ГОСТ 32031-2012 Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes.
ГОСТ 32031-2012
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes
Food products. Methods for detection of Listeria monocytogenes
___________________________________________________________
МКС 07.100.30
Дата введения 2014-07-01
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом мясной промышленности имени В.М.Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМП им.В.М.Горбатова Россельхозакадемии)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 226)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 03 декабря 2012 г. N 54-П)
За принятие проголосовали:
|
|
|
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения | AM
| Минэкономики Республики Армения |
Казахстан | KZ | Госстандарт Республики Казахстан |
Киргизия | KG | Кыргызстандарт |
Россия | RU | Росстандарт |
Таджикистан | TJ | Таджикстандарт |
Узбекистан | UZ | Узстандарт |
(Поправка. ИУС N 6-2019).
4 Настоящий стандарт соответствует международному стандарту ISO 11290-1:1996* Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes - Part 1: Detection method (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета микроорганизмов Listeria monocytogenes. Часть 1. Метод обнаружения) и изменения к нему ISO 11290-1:1996/Amd.1:2004 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes -- Part 1: Detection method -- Amendment 1: Modification of the isolation media and the haemolysis test, and inclusion of precision data (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета микроорганизмов Listeria monocytogenes. Часть 1. Метод обнаружения. Изменение 1. Модификация разделительной среды и определение гемолитической активности, а также включение показателей прецизионности)
Степень соответствия - неэквивалентная (NEQ).
Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 51921-2002
5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 июня 2013 г. N 309-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32031-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 г.
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.
ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 6, 2019 год с учетом уточнения, опубликованного в ИУС 11-2019
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает методы выявления бактерий Listeria monocytogenes.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ ISO 11133-1-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории
ГОСТ ISO 11133-2-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред
ГОСТ ISO 16140-2011 Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов
ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе
ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов
ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.
3.1 бактерии рода Listeria: Микроорганизмы, которые образуют типичные колонии на плотных селективных средах и являются грамположительными неспорообразующими короткими палочками, иногда почти коккоподобными, располагающимися одиночно или короткими цепочками, реже образующие длинные нити.
3.2 Listeria monocytogenes: Микроорганизмы, которые образуют типичные колонии на плотных селективных средах и идентифицируемые* по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам.
Примечание - Описание и методы определения морфологических, культуральных и биохимических характеристик этих микроорганизмов приведены в настоящем стандарте.
3.3 выявление Listeria monocytogenes: Определение наличия или отсутствия Listeria monocytogenes в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом.
4 Сокращения
В настоящем стандарте используют следующие сокращения:
ALOA - агар Listeria пo Оттавиани и Агости;
ГРМ - гидролизат рыбной муки;
ИФА - иммуноферментный анализ;
МПА - мясопептонный агар;
МПБ - мясопептонный бульон;
ПАЛ - питательный агар для выделения листерий;
ПБЛ - питательный бульон для выделения листерий;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
TSYEA - триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом;
TSYEB - триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом.
5 Сущность метода
Метод выявления бактерий L. monocytogenes в определенной массе или объеме продукта состоит из четырех последовательных этапов (см. 5.1, 5.2, 5.3, 5.4 и приложение А).
5.1 Первичное обогащение анализируемой пробы в жидкой среде со сниженной концентрацией селективных компонентов (полуконцентрированный бульон Фразера) при температуре 30 °С в течение 24 ч.
Примечание - Бактерии рода Listeria в продукте могут находиться в небольшом количестве, очень часто на фоне значительного количества микроорганизмов других родов. Поэтому для выявления небольшого количества бактерий рода Listeria, а так же "поврежденных" клеток в пробе необходим этап селективного обогащения на среде с пониженной концентрацией селективных компонентов.
5.2 Вторичное обогащение посевного материала, полученного по 5.1 в жидкой среде с полной концентрацией селективных компонентов (бульон Фразера) при температуре (37±1) °С в течение 48 ч.
5.3 Пересев посевного материала, полученного по 5.1 и 5.2, параллельно на две плотные селективные среды:
а) первая среда (обязательная): ALOA;
б) вторая среда: одна из плотных селективных сред, на выбор лаборатории, дополнительно к агару по 5.3 (а), такие как Оксфорд агар, Палкам агар или ПАЛ.
Посевы на ALOA культивируют при температуре (37±1) °С и просматривают через (24±3) ч, а при необходимости еще через (24±3) ч, контролируя наличие роста характерных для L. monocytogenes колоний.
Посевы на второй селективной среде культивируют при соответствующей температуре и просматривают на наличие роста колоний с характерным для бактерий рода Listeria ростом после определенного времени.
5.4 Идентификация отобранных колоний
Пересев колоний, полученных по 5.3. с характерным ростом для бактерий рода Listeria и вида Listeria monocytogenes на плотные питательные среды и культивирование при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч и их идентификация по соответствующим морфологическим, культуральным и биохимическим признакам.
6 Питательные среды, тест-системы и реактивы
6.1 Общие требования
Состав и приготовление питательных сред и реактивов - в соответствии с приложением Б.
6.2 Селективные среды первичного обогащения
В качестве селективных сред первичного обогащения могут быть использованы следующие среды.
6.2.1 Бульон Фразера полуконцентрированный - по Б.1.1.
6.2.2 Селективный накопительный бульон UVM - по Б.1.2.
6.2.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ I) - по Б.1.3.
6.3 Селективные среды вторичного обогащения
В качестве селективных сред вторичного обогащения могут быть использованы следующие среды.
6.3.1 Бульон Фразера - по Б.2.1.
6.3.2 Селективный накопительный бульон (UVM II) - по Б.2.2.
6.3.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ II) - по Б.2.3.
6.4 Селективные плотные среды
6.4.1 Агар Listeria пo Оттавиани и Агости (ALOA) - по Б.3.1.1.
6.4.2 Бриллианс Listeria агар (BRILLIANCE LISTERIA agar) - по Б.3.1.2.
В качестве второй среды необходимо использовать одну из следующих:
6.4.3 Оксфорд агар - по Б.3.2.1.
6.4.4 Палкам агар - по Б.3.2.2.
6.4.5 Питательный агар для выделения листерий (ПАЛ) - по Б.3.2.3.
6.5 Питательные среды для изучения культурально-морфологических свойств бактерий рода Listeria
6.5.1 Плотные питательные среды
6.5.1.1 Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) - по Б.4.1.1.
6.5.1.2 Трипказо-соевый агар (TSA) - по Б.4.1.2.
6.5.1.3 Мясопептонный агар (МПА) - по Б.4.1.3.
6.5.2 Жидкие питательные среды
6.5.2.1 Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB) - по Б.4.2.1.
6.5.2.2 Трипказо-соевый бульон (TSB) - по Б.4.2.2.
6.5.2.3 Мясопептонный бульон (МПБ) - по Б.4.2.3.
6.6 Среды и реактивы для идентификации бактерий рода Listeria
6.6.1 Раствор с объемной долей перекиси водорода 3% - по ГОСТ 10444.1.
6.6.2 Растворы и реактивы для окраски по Граму - по ГОСТ 10444.1.
6.6.3 Коммерческие наборы для окраски по Граму - согласно инструкции изготовителя.
6.6.4 Среда для определения подвижности бактерий - по Б.8.
6.6.5 Среда для определения лецитиназной активности - по Б.10.1 и Б.10.2.
6.7 Среды и реактивы для идентификации бактерий вида Listeria monocytogenes
6.7.1.1 Кровяной агар - по Б.5.
6.7.1.2 Суспензия из эритроцитов барана - по Б.6.
6.7.2 Буфер фосфатно-солевой - по Б.11.
6.7.3 Среда для проведения КАМП-теста - по Б.9.
6.7.4 Среды для определения ферментативных свойств культуры - по Б.7.1 и Б.7.2.
6.7.5 Углеводы - по Б.7.1.2.
6.7.5.1 Рамноза.
6.7.5.2 Ксилоза.
7 Средства измерений, аппаратура, посуда, материалы и тест-штаммы
Аппаратура и материалы по ГОСТ 10444.1 и ГОСТ ISO 7218 со следующими дополнениями.
рН-метр с точностью измерения ±0,1 ед. рН.
Шкаф сушильный стерилизационный для сухой стерилизации или автоклав для влажной стерилизации.
Термостат, поддерживающий температуру между (25±1) °С и (50±1) °С.
Термостаты, поддерживающие температуры: (25±1)°С, (30±1)°С, (37±1)°С.
Баня водяная, поддерживающая температуру 44 °С - 47 °С.
Петля, игла из платиново-иридиевого или никель-хромового сплава или пластиковая диаметром около 3 мм.
Шпатели стеклянные формы хоккейной клюшки.
Пробирки стерильные.
Колбы и флаконы необходимой вместимости.
Дозаторы автоматические переменного объема.
Наконечники одноразовые, стерильные для дозаторов.
Чашки Петри стеклянные или пластиковые диаметром от 90 до 100 мм.
Микроскоп для фазово-контрастной микроскопии.
Контрольные тест-штаммы:
- S. aureus;
- R. equi;
- L. innocua;
- L. ivanovii;
- L. monocytogenes;
- E. faecalis:
- E. coli.
Примечание - Допускается применение средств измерений, аппаратуры с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не хуже указанных.
8 Отбор проб
Отбор проб - по ГОСТ 26668.
Проба должна быть представительной, а также без повреждений и изменений при транспортировании и хранении.
9 Подготовка проб
Подготовка проб - по ГОСТ 26670.
10 Проведение испытания
Схема проведения испытания приведена в приложении А.
10.1 Проба для анализа и исходная суспензия
10.2 Первичное обогащение
Исходную суспензию (см. 10.1) культивируют при температуре (30±1) °С в течение (24±3) ч.
10.3 Вторичное обогащение
10.3.2 Посевы (см. 10.3.1) культивируют в течение (48±2) ч при температуре (37±1)°С.
10.4 Пересев на плотные селективные среды
10.4.1 Из пробирок с посевами (см. 10.2) после культивирования с помощью петли или шпателя (см. 7.5) проводят пересев на поверхность первой плотной селективной среды (см. 6.4.1) так, чтобы получить хорошо изолированные колонии.
Аналогичным образом проводят пересев и на вторую плотную селективную среду (см. 6.4.2 или 6.4.3, или 6.4.4)* .
10.4.2 С посевным материалом, выращенным на среде обогащения (см. 10.3.2), повторяют процедуру приведенную в 10.4.1.
10.4.3 Чашки с посевами на первой плотной селективной среде (см. 10.4.1 и 10.4.2) культивируют вверх дном в термостате при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч.
Чашки с посевами на второй плотной селективной среде инкубируют согласно инструкции производителя питательных сред.
10.4.4 Через (24±3) ч или (48±2) ч [если после (24±3) ч отмечен слабый рост культуры или его отсутствие] культивирования на первой и второй плотной селективной средах (10.4) учитывают наличие колоний с ростом характерных для бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes.
10.4.4.1 На первой селективной плотной среде бактерии вида L. monocytogenes и L. ivanovii растут в виде сине-зеленых колоний, окруженные непрозрачным ореолом (типичные колонии). Другие виды бактерий рода Listeria также растут в виде сине-зеленых колоний, без ореола.
Примечания
1 Некоторые штаммы L. monocytogenes могут давать очень слабый ореол вокруг колонии или вовсе не иметь его. Это характерно для "поврежденных" клеток L. monocytogenes (например, вследствие воздействия кислот).
2 Некоторые штаммы L. monocytogenes характеризуются пониженной фосфатидилинозитолфосфолипазной С активностью. Для выявления таких штаммов требуется более продолжительное культивирование.
10.4.4.2 Посевы на второй плотной селективной среде просматривают на наличие колоний с ростом характерным для бактерий рода Listeria.
На Палкам агаре все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, иногда с черным центром.
На Оксфорд агаре все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие сероватые колонии, окруженные черным ореолом.
На ПАЛ все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие серовато-желтые колонии с черным ореолом.
10.4.4.3 При отсутствии роста характерных колоний бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes на первой и второй плотных селективных средах исследования прекращают и делают заключение об отсутствии в исследуемой пробе продукта бактерий Listeria monocytogenes.
10.5 Идентификация выделенных культур до рода Listeria
10.5.1 Выбор колоний для подтверждения
10.5.1.1 С каждой чашки с плотной селективной средой (см. 10.4.4.1 и 10.4.4.2) отбирают по пять колоний с ростом, характерным для бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes.
Если на чашке выросло менее пяти типичных колоний, отбирают их все.
10.5.1.2 Отобранные колонии пересевают на поверхность подсушенного триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом (см. 6.5.1.1) или другого плотного питательного агара (см. 6.5.1.2-6.5.1.3) так, чтобы получить изолированные колонии.
Посевы культивируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч до появления видимого роста.
На триптом-соевом агаре с дрожжевым экстрактом бактерии рода Listeria растут в виде выпуклых, бесцветных и непрозрачных колоний в диаметре от 1,0 до 2,0 мм.
Для подтверждения принадлежности выделенной культуры к бактериям рода Listeria проводят следующие тесты.
10.5.2 Реакция на каталазу
Берут изолированную колонию, выделенную по 10.5.1.2, и вносят в каплю 3%-ного раствора перекиси водорода (см. 6.6.1). Мгновенное образование пузырьков газа указывает на положительную реакцию.
Бактерии рода Listeria являются каталазоположительными.
10.5.3 Окраска по Граму
Культуры, выделенные по 10.5.1.2, окрашивают по Граму (по ГОСТ 30425) и микроскопируют.
Бактерии рода Listeria являются грамположительными тонкими, короткими палочками.
10.5.4 Определение подвижности
Культуру, выделенную по 10.5.1.2, пересевают в триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (см. 6.5.2.1) или в другую жидкую питательную среду (см. 6.5.2.2-6.5.2.3).
Посевы культивируют при температуре (25±1) °С от 8 до 24 ч до появления мутности в бульоне. Затем каплю культуральной жидкости помещают на предметное стекло и накрывают сверху покровным стеклом и микроскопируют.
В поле зрения микроскопа должны наблюдаться короткие палочки с опрокидывающими движениями.
При культивировании посевов в жидкой питательной среде при температуре выше (25±1) °С подвижность бактерий не наблюдается.
В качестве альтернативного теста определения подвижности можно использовать посев культуры уколом в питательную среду (см. 6.6.4).
Посевы культивируют в термостате при температуре (25±1) °С в течение 48 ч.
Бактерии рода Listeria подвижны при температуре (25±1) °С, образуют характерный рост вокруг линии укола, похожий на зонтик. Если рост слабый необходимо культивировать еще пять суток с ежедневным просмотром посевов.
10.5.5 Характеристика бактерий рода Listeria
Бактерии рода Listeria - это грамположительные короткие тонкие палочки, каталазоположительные, подвижные при температуре не выше (25±1) °С.
10.6 Идентификация бактерий рода Listeria (см. 10.5.5) до вида
Культуры, полученные по 10.5.1.2 и соответствующие 10.5.5, идентифицируют следующими методами.
10.6.1 Определение бета-гемолитической активности
10.6.1.1 С использованием кровяного агара
Поверхность кровяного агара (см. 6.7.1.1) перед использованием необходимо тщательно подсушить. Чашку с тыльной стороны целесообразно разделить на квадраты и проколоть каждый маркированный квадрат бактериальной иглой с колонией культуры отобранной с триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом (см. 10.5.1.2). На каждую чашку с кровяным агаром, кроме исследуемых культур, должны быть посеяны контрольные штаммы, такие как L. monocytogenes (положительный контроль) и L. innocua (отрицательный контроль).
Посевы культивируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.
После инкубирования проводят визуальное сравнение прозрачности зон вокруг анализируемых и контрольных культур.
10.6.1.2 С использованием суспензии эритроцитов барана
При наличии у культуры гемолитической активности - жидкость окрашена в соломенно-коричневый цвет и отсутствует осадок красных кровяных клеток на дне лунки.
При отсутствии гемолитической активности наблюдается осадок красных кровяных клеток на дне лунки. Клетки могут быть красно-коричневыми по цвету.
Если реакция неопределенная, следует оставить культуру при температуре (3±2) °С на 24 ч.
10.6.2 Определение лецитиназной активности
Поверхность лецитин-агара с активированным углем (см. 6.6.5) и без угля (см. 6.6.5) перед использованием необходимо тщательно подсушить. Чашку с тыльной стороны целесообразно разделить на квадраты и высевать на каждый маркированный квадрат бактериальной петлей колонию культуры отобранной с триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом (см. 10.5.1.2). На каждую чашку с лецитин-агаром с активированным углем и без угля, кроме исследуемых культур, должен быть посеян контрольный штамм L. monocytogenes (положительный контроль).
Для получения доступа к полной версии без ограничений вы можете выбрать подходящий тариф или активировать демо-доступ.