ГОСТ 10444.12-88 Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов.

ГОСТ 10444.12-88

Группа Н09

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

 Метод определения дрожжей и плесневых грибов

Food products. Method for determination of yeast and mould

___________________________________________________________

МКС 07.100.30

ОКСТУ 9109

Дата введения 1990-01-01

 ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Государственным агропромышленным комитетом СССР

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 21.09.88 N 3208

3. В стандарт введен международный стандарт ИСО 7954-87

4. ВЗАМЕН ГОСТ 10444.12-75, ГОСТ 10444.13-75, ГОСТ 26888-86

5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

6. Ограничение срока действия снято по протоколу N 4-93 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 4-94)

7. ИЗДАНИЕ (Апрель 2010 г.) с Поправкой (ИУС 8-2009).

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод определения в них дрожжей и плесневых грибов.

Метод основан на высеве продукта или гомогената продукта и (или) их разведений в питательные среды, определении принадлежности выделенных микроорганизмов к плесневым грибам и дрожжам по характерному росту на питательных средах и по морфологии клеток.

Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления дрожжей и плесневых грибов в масложировой продукции.

Метод предназначен для:

установления соответствия микробиологических показателей качества пищевого продукта требованиям нормативно-технической документации;

установления промышленной стерильности консервов;

выяснения причин возникновения дефектов продуктов.

(Поправка)*.

________________

* Действует только на территории Российской Федерации.

 1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

1.1. Отбор проб пищевых продуктов по ГОСТ 26668, ГОСТ 26809 и ГОСТ 9225*.

________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53430-2009.

1.2. Подготовка проб пищевых продуктов к испытанию по ГОСТ 26669, ГОСТ 9225.

Консервы проверяют на герметичность по ГОСТ 8756.18.

Полные консервы, нормальные по внешнему виду, перед испытанием термостатируют при 30-37

°

С в таре вместимостью до 1 дм

включительно не менее 5 сут, в таре вместимостью свыше 1 дм

- не менее 7 сут.

Пищевые продукты, в которых нормируется допустимое количество дрожжей и плесневых грибов, термостатированию не подлежат.

Масса (объем) навески, предназначенной для приготовления гомогената продукта или исходного разведения - не менее (10,0

±0,1)

г (см

).

Исходные разведения продуктов с массовой долей NaCl более 5% готовят с использованием пептонной воды; исходные разведения мясных продуктов готовят с использованием физиологического раствора. Для приготовления последующих десятикратных разведений используют пептонно-солевой раствор. Пептонную воду и пептонно-солевой раствор готовят по ГОСТ 26669, физиологический раствор - по ГОСТ 10444.1.

Из пробы пищевого продукта, в котором нормируется количество дрожжей и (или) плесневых грибов, или из исходного разведения пищевого продукта готовят ряд разведений в соответствии с допустимым количеством дрожжей и (или) плесневых грибов, указанным в нормативно-технической документации на конкретный вид пищевого продукта.

 2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

2.1. Для проведения испытаний применяют аппаратуру, материалы, реактивы по ГОСТ 10444.1, а также аппаратуру, материалы и реактивы, указанные ниже:

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104*, с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и поверочной ценой деления не более 2 мг (для взвешивания реактивов);

________________

* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104*, с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и поверочной ценой деления не более 20 мг (для взвешивания продукта);

________________

* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.

термостат, позволяющий поддерживать температуру (24±1) °С;

микроскоп световой биологический или других аналогичных марок;

масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;

стекла предметные по ГОСТ 9284;

стекла покровные по ГОСТ 6672;

вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556;

агар сывороточный БФ;

бромфеноловый синий, водорастворимый, индикатор;

гентамицина сульфат во флаконах по 0,08 г или в ампулах по 1 или 2 см

водный раствор массовой долей 4%;

окситетрациклина дегидрат в таблетках по 0,25 г (250000 ЕД);

неомицина сульфат во флаконах по 0,5 г (50000 ЕД) или в таблетках по 0,10 и 0,25 г;

препараты группы левомицетина:

левомицетин сукцинат растворимый (для инъекций) во флаконах по 0,5 и 1,0 г;

левомицетин в таблетках по 0,25 и 0,5 г;

препараты группы пенициллина:

бензилпенициллина натриевая соль или калиевая соль во флаконах по 250000, 500000 или 1000000 ЕД;

бензилпенициллина новокаиновая соль во флаконах по 300000, 600000 или 1200000 ЕД;

новоцин во флаконах по 400000, 800000, 1200000 ЕД;

препараты группы стрептомицина:

стрептомицина сульфат во флаконах по 0,25 г (250000 ЕД), 0,5 г (500000 ЕД), 1 г (1000000 ЕД);

стрептосульмицина сульфат во флаконах по 0,25, 0,5 или 1 г;

стрептомицина-хлоркальциевый комплекс во флаконах по 0,1, 0,2, 0,5 г;

дигидрострептомицина сульфат во флаконах по 0,25, 0,5 или 1 г;

дигидрострептомицина пантотенат во флаконах по 0,25 г (250000 ЕД), 0,5 г (500000 ЕД), 1 г (1000000 ЕД).

 3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

3.1. Приготовление растворов антибиотиков

3.1.1. Растворы антибиотиков готовят непосредственно перед использованием. Антибиотики в таблетках используют для приготовления растворов при отсутствии антибиотиков для инъекций. При приготовлении растворов антибиотиков из таблеток не допускается проводить взвешивание, так как в таблетках может содержаться разное количество наполнителя. В этом случае приготовление растворов основано на использовании целых таблеток с точно известным содержанием антибиотиков.

Допускается при анализе пищевых продуктов (кроме консервов) проводить приготовление растворов антибиотиков из таблеток с соблюдением правил асептики на стерильной дистиллированной воде.

3.1.2. Раствор массовой концентрацией гентамицина сульфата 10 г/дм

:

во флакон с 80 мг гентамицина сульфата (для инъекций) вносят 8 см

стерильной дистиллированной воды, содержимое флакона растворяют. Раствор добавляют к готовой основе среды.

При использовании раствора гентамицина сульфата в ампулах исходят из того, что ампула с 1 см

раствора содержит 40 мг гентамицина, а с 2 см

- 80 мг.

3.1.3. Раствор массовой концентрацией левомицетина сукцината растворимого 50 и 100 г/дм

: во флакон с 0,5 или 1,0 г левомицетина (для инъекции) вносят 10 см

стерильной дистиллированной воды, содержимое флакона растворяют. Раствор добавляют к готовой основе среды.

При использовании левомицетина в таблетках по 0,25 и 0,5 г готовят растворы массовой концентрацией левомицетина 5 г/дм

. Для этого 2 таблетки по 0,25 г или 1 таблетку по 0,5 г растирают в ступке, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см

, смывая дистиллированной водой, стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670. Допускается раствор левомицетина стерилизовать вместе с основой среды.

3.1.4. Раствор массовой концентрацией окситетрациклина дигидрата 1 г/дм

: 1 таблетку по 0,25 г растирают в ступке, переносят в мерную колбу вместимостью 250 см

, смывая дистиллированной водой. Раствор доводят до метки дистиллированной водой, стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670.

3.1.5. Растворы препаратов группы пенициллина готовят из расчета содержания антибиотика 50000 или 100000 ЕД в 1 см

раствора:

во флаконы с 250000, 300000, 500000 ЕД вносят соответственно 5, 6, 10 см

стерильной дистиллированной воды, содержимое флакона растворяют, получая растворы, содержащие в 1 см

50000 ЕД антибиотика;

во флаконы с 1000000, 1200000 ЕД вносят соответственно 10, 12 см

стерильной дистиллированной воды, получая растворы, содержащие в 1 см

100000 ЕД антибиотика.

3.1.6. Растворы препаратов группы стрептомицина массовой концентрацией антибиотика 100 г/дм

: во флаконы с 0,10; 0,25; 0,50 и 1 г антибиотика вносят соответственно 1; 2,5; 5; 10 см

стерильной дистиллированной воды, содержимое флакона растворяют.

3.1.7. Раствор массовой концентрацией неомицина сульфата 50 г/дм

: во флакон с 0,5 г неомицина сульфата (для инъекций) вносят 10 см

стерильной дистиллированной воды.

При приготовлении раствора массовой концентрацией неомицина сульфата 10 г/дм

из таблеток: 2 таблетки по 0,25 г или 5 таблеток по 0,1 г растирают в ступке, порошок переносят в мерную колбу на 50 см

, смывая дистиллированной водой, объем доводят до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670.

3.2. Приготовление питательных сред

3.2.1. Питательные среды с антибиотиками готовят непосредственно перед использованием.

При приготовлении сред с антибиотиками вначале готовят основы сред. К расплавленной и охлажденной до температуры (46±1) °С основе среды добавляют растворы антибиотиков.

3.2.2. Для приготовления питательных сред с антибиотиками используют следующие основы.

3.2.2.1. Основу среды (среду Сабуро) готовят следующим образом: 40,0 глюкозы, 10,0 г пептона, 18,0 г агара добавляют к 1 дм

дистиллированной воды. Смесь подогревают, периодически помешивая, до расплавления составных частей, охлаждают до 45-55

°

С, устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25

°

С 6,5±0,1, разливают в мерные колбы и стерилизуют 15 мин при температуре (121

±1) °

С. Основу среды хранят при температуре (4

±2) °

С не более 14 сут.

Основу среды (среду Сабуро) допускается использовать без добавления антибиотиков при анализе консервов на промышленную стерильность.

3.2.2.2. Основа среды из сухого сывороточного агара БФ.

В состав среды входят, г:

60,0 г сухого сывороточного агара БФ прибавляют к 1 дм

дистиллированной воды, нагревают до полного растворения (при наличии осадка фильтруют). Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации при 25

°

С он составлял 4,2

±0,2.

Определенный объем среды разливают в колбы и стерилизуют при температуре (121

±1) °

С в течение 15 мин.

Основу среды используют при анализе молока и молочных продуктов.

3.2.3. Для определения дрожжей и плесневых грибов используют среды, указанные в пп.3.2.3.1-3.2.3.7.

3.2.3.1. Среда агаризованная с левомицетином: к 1 дм

основы добавляют 2 см

раствора левомицетина сукцината растворимого (для инъекций) массовой концентрацией 50 г/дм

или 1 см

раствора массовой концентрацией 100 г/дм

. При использовании раствора левомицетина массовой концентрации 5 г/дм

к 980 см

основы добавляют 20 см

раствора.

3.2.3.2. Среда агаризованная с окситетрациклином: к 900 см

основы добавляют 100 см

раствора окситетрациклина дигидрата массовой концентрацией 1 г/дм

.

3.2.3.3. Среда агаризованная с окситетрациклином и гентамицином: к 895 см

основы добавляют 100 см

раствора окситетрациклина дигидрата массовой концентрацией 1 г/дм

и 5 см

раствора гентамицина массовой концентрацией 10 г/дм

.

3.2.3.4. Среда агаризованная с антибиотиками группы пенициллина и стрептомицина: к 1 дм

основы добавляют 1 или 0,5 см

раствора антибиотика группы пенициллина, содержащего соответственно 50000 или 100000 ЕД, затем к среде добавляют 0,4 см

раствора антибиотика группы стрептомицина массовой концентрацией 100 г/дм

.

3.2.3.5. Среда агаризованная с неомицином сульфатом: к 1 дм

основы добавляют 7 см

раствора неомицина сульфата массовой концентрацией 50 г/дм

.

При использовании раствора неомицина сульфата массовой концентрацией 10 г/дм

к 965 см

основы добавляют 35 см

раствора.

3.2.3.6. Солодовое сусло готовят по ГОСТ 10444.1.

Применяют для выявления дрожжей и плесневых грибов в консервах.

Допускается использование готового неохмеленного пивного сусла вместо осахаренного сусла, получаемого из молотого ячменного солода.

3.2.3.7. Солодовое агаризованное сусло готовят по ГОСТ 10444.1.

Для определения дрожжей и плесневых грибов в продуктах, сильно обсемененных микроорганизмами, сусло при приготовлении подкисляют стерильным раствором лимонной кислоты массовой концентрацией 200 г/дм

или стерильным раствором молочной кислоты с объемной долей молочной кислоты 40% до рН 3,6

±0,1,

при этом при приготовлении среды увеличивают количество агара до 30 г на 1 дм

.

 4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

4.1. Из подготовленной пробы продукта и (или) его разведения отбирают навеску объемом (1

±0,1)

см

.

4.2. Продукт и (или) его разведения высевают по ГОСТ 26670 параллельно в две чашки Петри. Посевы заливают расплавленной и охлажденной до температуры (45

±1) °

С средой (см. пп.3.2.2.1; 3.2.3.1-3.2.3.5; 3.2.3.7). Параллельно с этим заливают чашку А Петри 15-20 см

среды для проверки ее стерильности.

Допускается при установлении промышленной стерильности консервов и при выявлении возбудителей порчи в продуктах по 2,0 см

исследуемого материала высевать параллельно в две пробирки с 5 см

жидкого солодового сусла (см. п.3.2.3.6).

4.3. Посевы термостатируют при температуре (24±1) °С в течение 5 сут, посевы на чашках Петри термостатируют дном вверх.

Через 3 сут термостатирования проводят предварительный учет типичных колоний или появления характерных признаков роста на жидких питательных средах.

Если в посевах на агаризованных средах присутствуют мукоровые, очень быстро растущие грибы, то снятие предварительных результатов необходимо проводить очень осторожно, не допуская того, чтобы споры этих грибов осыпались и дали рост вторичных колоний. Через 5 сут проводят окончательный учет результатов термостатирования посевов. Колонии дрожжей и плесневых грибов разделяют визуально.

Рост дрожжей на агаризованных средах сопровождается образованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем. Развитие дрожжей в жидкой среде сопровождается появлением мути, запаха брожения и газа.

Развитие плесневых грибов на питательных средах сопровождается появлением мицелия различной окраски.

4.4. Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

4.5. При необходимости для разделения колоний дрожжей и плесневых грибов проводят микроскопические исследования. Для этого из отдельных колоний или из посевов на жидкую среду готовят препараты методом раздавленной капли. На предметное стекло наносят каплю стерильной водопроводной воды. Затем в эту каплю прокаленной иглой вносится часть колонии или петлей наносят каплю культуральной жидкости. Полученная суспензия покрывается покровным стеклом.

Результаты микроскопирования оценивают пользуясь характеристикой дрожжей и плесневых грибов, указанной в приложении.

 5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

5.2. Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен рост дрожжей и плесневых грибов и их присутствие подтверждено микроскопированием, то дают заключение о присутствии этих микроорганизмов в продукте.

5.3. Результаты обрабатывают и пересчитывают отдельно для дрожжей и плесневых грибов.

5.4. Количество дрожжей и плесневых грибов в 1 г или в 1 см

продукта (

) вычисляют по формуле

,

где

- сумма всех подсчитанных колоний на чашках Петри в двух последовательных десятикратных разведениях при условии, что на каждой чашке число колоний отвечает требованиям п.4.4;

- количество чашек Петри, подсчитанное для меньшего разведения, т.е. для более концентрированного разведения продукта;

- количество чашек Петри, подсчитанное для большего разведения;

- степень разведения продукта (для меньшего разведения).

5.5. Результаты испытания записывают в соответствии с требованиями ГОСТ 26670.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Справочное

ХАРАКТЕРИСТИКА ДРОЖЖЕЙ И ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ