ГОСТ 32638-2020 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Метод оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro.

ГОСТ 32638-2020 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Метод оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro.

ГОСТ 32638-2020

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЯ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА

Метод оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro

Methods of testing the impact of chemical products on the human body. Method for evaluating the gene mutations in mammalian cells in vitro

МКС 75.080

11.020

11.120.01

Дата введения 2021-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным унитарным предприятием "Российский научно-технический центр информации по стандартизации, метрологии и оценке соответствия" (ФГУП "СТАНДАРТИНФОРМ") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии документа, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июня 2020 г. N 131-П)

За принятие проголосовали:


Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	ЗАО "Национальный орган по стандартизации и метрологии" Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Казахстан	KZ	Госстандарт Республики Казахстан
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Россия	RU	Росстандарт
Таджикистан	TJ	Таджикстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 октября 2020 г. N 910-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32638-2020 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2021 г.

5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному документу OECD Test N 476:2016 "Руководство по испытанию химических веществ. Метод оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro с использованием генов Hprt and xprt" ("Guideline for testing of chemicals. In Vitro mammalian cell gene mutation tests using the Hprt and xprt genes", MOD) путем:

- включения дополнительного раздела 1, дополнительных слов, которые выделены в тексте курсивом;

- изменения его структуры для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3).

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного документа приведено в дополнительном приложении ДА.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6)

6 ВЗАМЕН ГОСТ 32638-2014

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

Введение

Руководства Организации экономического сотрудничества и развития (OECD) периодически пересматриваются с учетом научного прогресса, изменений в нормативном законодательстве и с целью защиты животных. Впервые руководство OECD Test N 476 было принято в 1984 г. В 1997 г. был принят пересмотренный документ, включающий новые данные, полученные в этой области, отражающий почти тридцатилетний опыт работ с использованием данного метода и также являющийся результатом разработки отдельного нового руководства, посвященного методу оценки генных мутаций на клетках млекопитающих

in vitro

с использованием гена тимидинкиназы. Настоящее руководство является частью серии руководств по генетической токсикологии. Настоящий документ предоставляет краткую информацию об исследованиях в области генетической токсикологии и обзор последних изменений, которые были внесены в руководства по испытаниям

________________

См. [1].

Целью метода оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro является обнаружение генных мутаций, индуцируемых химическими соединениями. В клеточных линиях, используемых в экспериментах, измеряют прямые мутации репортерных генов (генетических маркеров), в частности эндогенных гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (Hprt - в клетках грызунов, HPRT - в клетках человека, в настоящем руководстве обобщенно именуемые геном Hprt и геном HPRT) и трансген ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (gpt) (обозначаемый XPRT).

Анализы мутации HPRT и XPRT выявляют разные спектры генетических событий. В дополнение к мутациям, обнаруженным анализом HPRT (например, замена пар оснований, сдвиг рамки считывания, небольшие делеции и вставки), аутосомное расположение трансгена

gpt

позволяет обнаружить мутации, возникающие в результате больших делеций и, возможно, митотической рекомбинации, не определяемой с использованием HPRT анализа, потому что ген

Hprt

расположен в Х-хромосоме

. В настоящее время для нормативного регулирования XPRT анализ используют менее широко, чем HPRT анализ.

________________

См. [2]-[7].

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает требования к проведению испытаний по оценке генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro, вызываемых химическими веществами, путем измерения прямых мутаций генов тимидинкиназы (ТК) и гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (HPRT) и трансгена ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (XPRT) и применяется для скрининга потенциальной мутагенности и канцерогенности веществ для млекопитающих.

2 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1 мутагены, замещающие пары оснований (base pair substitution mutagens): Вещества, вызывающие замещение пар оснований в дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК).

2.2 эффективность клонирования (cloning efficiency): Процент высеянных клеток низкой плотности, способных вырасти в колонию, которую можно подсчитать.

2.3 концентрации (concentrations): Конечные концентрации исследуемого химического вещества в культуральной среде.

2.4 цитотоксичность (сytotoxicity): Снижение относительной выживаемости клеток, подвергшихся воздействию, по сравнению с отрицательным контролем.

2.5 прямая мутация (forward mutation): Генная мутация от родительского типа к мутантному типу, которая приводит к изменению или потере активности фермента или функции кодируемого белка.

2.6 мутаген, вызывающий мутации со сдвигом рамки считывания (frameshift mutagens): Вещества, которые вызывают вставку или делецию одной или нескольких пар оснований в молекуле ДНК.

2.7 генотоксичность (genotoxic): Общий термин, охватывающий все типы повреждений ДНК или хромосом, включая разрывы ДНК, аддукты, перестройки, мутации, хромосомные аберрации и анеуплоидию.

Примечание - Не все виды генотоксических эффектов приводят к мутациям или стабильному повреждению хромосом.

2.8 HAT-среда (HAT medium): Среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин и используемая для очистки мутантов Hprt.

2.9 митотическая рекомбинация (mitotic recombination): Рекомбинация между гомологичными хроматидами во время митоза,

Примечание - Митотическая рекомбинация может приводить к индукции двухцепочечных разрывов ДНК или к потере гетерозиготности.

2.10 среда MPA (MPA medium): Среда, содержащая ксантин, аденин, тимидин, аминоптерин, микофеноловую кислоту, используемая для очистки мутаций хрrt.

2.11 мутагенный (mutagenic): Вызывающий наследуемое изменение последовательностей пар оснований ДНК в генах или в структуре хромосом (хромосомные аберрации).

2.12 частота мутаций; MF [mutant frequency (MF)]: Отношение числа выявленных мутантных клеток к общему числу выживших клеток.

2.13 время фенотипической экспрессии (phenotypic expression time): Период времени после воздействия, в течение которого генетическое изменение фиксируется в геноме и любые предшествующие генные продукты истощаются настолько, что изменяется фенотипический признак.

2.14 относительная выживаемость; RS [relative survival (RS)]: Мера цитотоксичности, связанная с воздействием.

Примечание - RS - это эффективность клонирования (СЕ) клеток, высеянных сразу после воздействия, с поправкой на потерю клеток в процессе воздействия, по сравнению с эффективностью клонирования в отрицательных контролях (выживаемость принимают равной 100%).

2.15 S9 фракция печени (S9 liver fractions): Супернатант гомогената печени после 9000 g центрифугирования, экстракт сырой печени.

2.16 смесь S9 (S9 mix): Смесь S9 фракции печени и кофакторов, необходимых для метаболической активности ферментов.

2.17 контроль растворителя (solvent control): Общий термин для определения контрольных культур только в растворителе, используемом для растворения исследуемого химического вещества.

2.18 необработанный контроль (untreated control): Культуры клеток, которые не подвергают обработке (т.е. отсутствуют химические вещества или растворители), но подвергают одновременно такому же анализу, что и культуры, обработанные исследуемым химическим веществом.

3 Основные положения и ограничения

3.1 Испытания, проводимые in vitro, обычно требуют использования экзогенного источника метаболической активации. Экзогенная система метаболической активации не может полностью воспроизводить условия in vivo.

3.2 Следует избегать условий, которые могут привести к положительным артефактам (например, возможному взаимодействию с испытуемой системой), не вызванным прямым взаимодействием между исследуемыми химическими веществами и генетическим материалом клетки. Такие условия касаются изменения значения pH или осмотической концентрации раствора

, взаимодействия с компонентами среды

или высокого уровня цитотоксичности

. Цитотоксичность, превышающую рекомендованные верхние уровни, приведенные в 5.2.2.3, считают чрезмерной для анализа HPRT.

________________

См. [8]-[10].

См. [11], [12].

См. [13].

3.3 Перед использованием настоящего стандарта для смеси с целью получения данных, предназначенных для целей регулирования, следует рассмотреть вопрос о возможности обеспечения достоверных результатов. Такое рассмотрение не требуется, если существует нормативное требование для испытания смеси.

4 Принцип проведения испытаний

4.1 Клетки-мутанты с дефицитом активности фермента Hprt в анализе HPRT или фермента xprt в анализе XPRT устойчивы к цитостатическим эффектам пуринового аналога 6-тиогуанина (TG). Клетки профицитные по Hprt (в HPRTанализе) или gpt (в анализе XPRT) чувствительны к TG, что вызывает ингибирование клеточного метаболизма и останавливает дальнейшее деление клеток. Таким образом, клетки-мутанты способны разрастаться (пролиферировать) в присутствии TG в отличие от нормальных клеток, содержащих фермент Hprt (в анализе HPRT) или gpt (в анализе XPRT), не обладающих такой способностью.

4.2 Клеточную суспензию или монослойную культуру подвергают воздействию исследуемого химического вещества как с экзогенным источником метаболической активации (см. 5.1.4), так и без него, в течение установленного периода времени (от 3 до 6 ч) и затем субкультивируют для определения цитотоксичности и фенотипической экспрессии до отбора мутантов

. Цитотоксичность определяется относительной выживаемостью (RS), то есть эффективностью клонирования, измеренной сразу после воздействия и скорректированной на любую потерю клеток во время воздействия по сравнению с отрицательным контролем (см. 5.2.2.2 и приложение А). Обработанные культуры клеток культивируют в среде для выращивания в течение соответствующего периода времени, характерного для каждого типа клеток, для обеспечения близкой к оптимальному значению фенотипической экспрессии индуцированных мутаций (обычно от 7 до 9 дней). Частоту мутаций после фенотипической экспрессии определяют путем посева известного количества клеток в культуральную среду, содержащую селективный агент для выявления мутантных колоний, и в среду без селективного агента для определения эффективности клонирования (жизнеспособности). После соответствующего времени инкубации подсчитывают колонии. Частоту мутаций определяют по количеству мутантных колоний, скорректированных по эффективности клонирования во время отбора мутантов.

________________

См. [14]-[17].

5 Описание метода

5.1 Подготовка

5.1.1 Клетки

5.1.1.1 Типы клеток, используемые для анализов HPRT и XPRT, должны быть чувствительны к химическим мутагенам, иметь высокую эффективность клонирования, стабильный кариотип и стабильную частоту спонтанных мутантов. Клетки, наиболее часто используемые для анализа HPRT, включают линии CHO, CHL и V79 клеток китайского хомяка, клетки мышиной лимфомы L5178Y и лимфобластоидные клетки человека TK6

________________

См. [18], [19].

Клетки AS52, полученные из СНО, содержащие трансген

gpt

(с удаленным геном

hprt

), используют для анализа XPRT

. HPRT анализ на клетках AS52 не может быть выполнен, поскольку ген

hprt

был удален. Использование других клеточных линий должно быть обосновано и подтверждено.

________________

См. [20], [21].

5.1.1.2 Клеточные линии следует регулярно проверять на стабильность модального числа хромосом и отсутствие загрязнения микоплазмой

. При наличии загрязнения или изменении модального числа хромосом клетки не используют. Должно быть установлено нормальное время клеточного цикла, используемое в испытательной лаборатории, соответствующее опубликованным характеристикам клеток. В исходной основной клетке также должна быть проверена частота спонтанных мутаций, и исходный запас не используют, если частота мутаций не соответствует требованиям.

________________

См. [22], [23].

5.1.1.3 Перед использованием в настоящем методе может потребоваться очищение культур от предшествующих мутантных клеток, например путем культивирования в среде HAT - для анализа HPRT и MPA - для анализа XPRT

(см. приложение A). Очищенные клетки могут быть заморожены и затем после размораживания использованы в качестве рабочих запасов. Свежеразмороженный рабочий материал можно использовать для испытания после достижения стандартного времени удвоения. При проведении анализа XPRT при обычной культуре клеток AS52 следует использовать условия, обеспечивающие поддержание трансгена

gpt

________________

См. [5], [24].

См. [20].

5.1.2 Среда и условия культивирования

Для поддержания культур используют соответствующую культуральную среду и условия инкубации (культуральные сосуды, увлажненную атмосферу с 5%-ным содержанием

и температурой инкубации 37°C). Культуры клеток всегда должны поддерживаться в условиях, обеспечивающих их рост в логарифмической фазе. Особенно важно, чтобы среда и условия культивирования были выбраны таким образом, чтобы обеспечить оптимальный рост клеток в течение периода экспрессии и оптимальную эффективность клонирования как для мутантных, так и для немутантных клеток.

5.1.3 Приготовление культур

Клеточные линии размножают из исходных культур, высевая в культуральную среду с такой плотностью, чтобы клетки в суспензиях или в монослоях продолжали расти экспоненциально в течение периодов обработки и экспрессии (например, следует избегать слияния клеток, растущих в монослоях).

5.1.4 Метаболическая активация

При использовании клеток с недостаточной эндогенной метаболической способностью применяют экзогенные метаболизирующие системы. Наиболее часто используемой системой (рекомендуемой по умолчанию) является пост-мито-хондриальная фракция (S9) с добавлением кофактора, полученного из печени грызунов (как правило, крыс), обработанных фермент-индуцирующими агентами, такими как Aroclor 1254

или комбинация фенобарбитала и

-нафтофлавона

. Комбинация последних химических веществ не противоречит Стокгольмской конвенции о стойких органических загрязнителях

, и было доказано, что она является такой же эффективной, как Aroclor 1254, для индукции оксидаз со смешанной функцией

. Фракцию S9 обычно используют в концентрации от 1% об. до 2% об., но в окончательной исследуемой среде концентрация может быть увеличена до 10% об. На выбор типа используемой экзогенной системы и концентрации метаболической активации или метаболического индуктора может влиять класс исследуемых веществ

________________

См. [25]-[28].

См. [29]-[32].

См. [33].

См. [29], [31].

См. [34]-[36].

5.1.5 Подготовка исследуемого вещества

Твердые исследуемые химические вещества готовят в соответствующих растворителях и при необходимости разбавляют до обработки клеток (см. 5.2.1). Жидкие исследуемые химические вещества могут быть добавлены непосредственно в анализируемую систему и/или разбавлены до обработки анализируемой системы. Испытания газообразных или легко испаряющихся химических веществ проводят путем внесения соответствующих изменений в стандартные протоколы, например обработкой в герметичных культуральных сосудах

. Подготовку исследуемого химического вещества проводят непосредственно перед обработкой, за исключением случаев подтверждения стабильности при хранении.

________________

См. [37], [38].

5.2 Условия испытаний

5.2.1 Растворители

Растворитель выбирают таким образом, чтобы обеспечить оптимальные условия для растворения исследуемых химических веществ, не оказывая вредного воздействия на проведение испытания (например, изменение роста клеток, влияние на стабильность исследуемого химического вещества, реакции с культуральными сосудами, нарушения системы метаболической активации). Рекомендуется, по возможности, в первую очередь использовать водные растворы (или культуральные среды). Хорошо зарекомендовавшими себя растворителями являются вода и диметил-сульфоксид.

Как правило, содержание органических растворителей не должно превышать 1% об., а водных растворителей (физиологический раствор или вода) - 10% об. в среде при окончательной обработке. Если используют необщепризнанные растворители (например, этанол или ацетон), их использование подтверждают данными, указывающими на их совместимость с исследуемыми химическими веществами и испытуемой системой, а также отсутствием генетической токсичности в используемой концентрации. При отсутствии подтверждающих данных важно добавить необработанные контроли (см. приложение A) для подтверждения того, что выбранный растворитель не вызывает вредных или мутагенных эффектов.

Полная версия документа доступна с 20.00 до 24.00 по московскому времени.

Для получения доступа к полной версии без ограничений вы можете выбрать подходящий тариф или активировать демо-доступ.

Теги документа

гост in vitro