ГОСТ 31659-2012 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella.

  ГОСТ 31659-2012 (ISO 6579:2002)*

____________________

* Поправка (ИУС 5-2015).

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

 ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

 Метод выявления бактерий рода Salmonella

 Food products. Method for the detection of Salmonella spp

___________________________________________________________

МКС 07.100.30

Дата введения 2013-07-01

 Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" (ГНУ ВНИИКОП) на основе аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 20 июля 2012 г. N 50)

За принятие проголосовали:

(Поправка. ИУС N 1-2022).

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 ноября 2012 г. N 715-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31659-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ISO 6579:2002* Microbiology of food and animal feeding staffs** - Horizontal method for the detection of Salmonella spp. (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод выявления Salmonella spp.) в части пищевых продуктов. При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребности экономики указанных выше государств и особенностей межгосударственной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом***.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие в ГОСТ 1.5-2001 (подраздел 3.6).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать сведения о соответствии ссылочных международных стандартов межгосударственным стандартам, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок, указанные в приложении ДА.

Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

ВНЕСЕНЫ: поправка*, опубликованная в ИУС N 5, 2015 год; поправка, опубликованная в ИУС N 1, 2022 год, введенная в действие с 23.08.2021

________________

* См. ярлык "Примечания".     

      1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной массе или объеме продукта бактерий рода Salmonella, включая Salmonella Typhi и Salmonella Paratyphi.

Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления бактерий рода Salmonella.

      2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 4209-77 Реактивы. Магний хлористый 6-водный. Технические условия

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9536-79 Спирт изобутиловый технический. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

      3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 бактерии рода Salmonella: Микроорганизмы, которые на агаризованных селективно-диагностических средах образуют типичные или не совсем типичные колонии.

Примечание - Описание и методы определения биохимических и серологических характеристик этих микроорганизмов приведены в настоящем стандарте.

3.2 выявление бактерий рода Salmonella: Определение присутствия или отсутствия бактерий рода Salmonella в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом.

      4 Сущность метода

4.1 Общие положения

Метод выявления бактерий рода Salmonella в определенной массе или объеме продукта состоит из четырех этапов (см. 4.2; 4.3; 4.4; 4.5 и приложение А).

4.2 Предварительное обогащение в неселективной жидкой среде

Бактерии рода Salmonella могут присутствовать в продукте в небольшом количестве вместе с большим количеством других бактерий из семейства Enterobacteriaceae или других семейств. Поэтому предварительное обогащение необходимо для выявления небольшого числа бактерий рода Salmonella или сублетально поврежденных бактерий рода Salmonella.

Навеску массой 25 г вносят в забуференную пептонную воду, затем инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (18±2) ч.

Для некоторых пищевых продуктов используют другое предварительное обогащение (см. 8.1.2).

Для большего эффекта перед внесением навески продукта забуференную пептонную воду нагревают до температуры (37±1) °С.

4.3 Обогащение в селективной жидкой среде

Среду Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) и одну из двух сред: Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон (МКТ-бульон) или селенитовую среду - инокулируют культурой, полученной по 4.2. После посева RVS-бульон инкубируют при температуре (41,5±1,0) °С в течение (24±3) ч, а МКТ-бульон и селенитовую среду - при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

4.4 Пересев на чашки для идентификации

Культуры, полученные по 4.3, пересевают на две селективные агаризованные среды:

- ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-arap) и

- на одну из следующих агаризованных сред: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или бриллиантовый зеленый агар.

Посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

4.5 Проведение идентификации

Колонии, предположительно относящиеся к бактериям рода Salmonella, полученные на чашках по 4.4, идентифицируют с помощью биохимических и серологических тестов.

      5 Питательные среды, реактивы и сыворотки

5.1 Общие положения

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред и реактивов, должны быть аналитического качества (не ниже ч.д.а. или х.ч.).

5.2 Питательные среды и реактивы

Состав и приготовление питательных сред и реактивов указаны в приложении В.

5.2.1 Среда для неселективного предварительного обогащения: забуференная пептонная вода по В.1.

5.2.2 Первая селективная обогатительная среда: среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) по В.2.

5.2.3 Вторая селективная обогатительная среда: селенитовая среда по В.3.

5.2.4 Третья селективная обогатительная среда: тетратионатный бульон Мюллер-Кауфмана (МКТ-бульон) по В.4.

5.2.5 Агаризованные селективные среды для чашек.

5.2.5.1 Первая среда: ксилоза-лизин-деоксихолатный агар (XLD-arap) по В.5.

5.2.5.2 Вторая среда по В.6.

5.2.6 Питательный агар по В.7.

5.2.7 Мясо-пептонный агар или ГРМ-агар (питательный агар для культивирования микроорганизмов на основе гидролизата рыбной муки) по В.8.

5.2.8 Мясо-пептонный бульон с глюкозой по В.9.

5.2.9 Среды с углеводами (среды Гисса) по В.10.

5.2.10 Трехсахарный железистый агар (TSI-arap) или агар Клиглера, или агар Олькеницкого по В.11.

5.2.11 Агар с мочевиной (Кристенсена) по В.12.

5.2.12 L-лизин-декарбоксилазная среда по В.13.

5.2.13 Реактив для определения

-галактозидазы (или используются в соответствии с инструкцией изготовителя готовые бумажные диски) по В.14.

5.2.14 Реактив для реакции Фогес-Проскауера (VP) по В.15.

5.2.15 Реактивы для индольной реакции по В.16.

5.2.16 Триптон/триптофановая среда по В.17.

5.2.17 Бульон Хоттингера по В.18.

5.2.18 Мясо-пептонный бульон с 0,05% L-триптофана по В.19.

5.2.19 Полужидкий питательный агар по В.20.

5.2.20 Полужидкий мясо-пептонный агар по В.21.

5.2.21 Физиологический раствор по В.22.

5.3 Сыворотки

Имеется несколько типов агглютинирующих сывороток, содержащих антитела для одного или нескольких О-антигенов, т.е. антисыворотки, содержащие одну или более "О" групп (моновалентные или поливалентные анти-О-сыворотки), анти-Vi-сыворотки и антисыворотки, содержащие антитела для одного или нескольких Н-факторов (моновалентные или поливалентные анти-Н-сыворотки).

Каждое опытное определение должно давать гарантию, что используемая антисыворотка пригодна для выделения всех серотипов бактерий рода Salmonella.

Сухие агглютинирующие адсорбированные О-, Vi-, Н-сальмонеллезные сыворотки промышленного производства готовят перед употреблением по прилагаемой к ним инструкции.

      6 Аппаратура, материалы и реактивы

Приемлемой альтернативой посуде многоразового применения является одноразовая посуда, если она отвечает соответствующим требованиям.

Обычное лабораторное оборудование и реактивы для микробиологических исследований по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

Аппарат для сухой стерилизации (стерилизационный сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав) по ГОСТ ISO 7218 (подразделы 4.5 и 4.10).

Термостат, поддерживающий температуру (37±1) °С по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.6).

Водяная баня, поддерживающая температуру (41,5±1,0) °С, или термостат, поддерживающий температуру (41,5±1,0) °С по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.9).

Водяная баня, поддерживающая температуру 44 °С-47 °С и (37±1) °С, по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.9).

Прибор для мембранной фильтрации.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г (для взвешивания реактивов) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,01 мг*.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 1 кг (для взвешивания продукта) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±20,0 мг.

Микроскоп биологический, обеспечивающий просмотр в проходящем свете, с увеличением 900

-1000

.

Бактериологическая петля диаметром около 3 мм.

рН-метр с точностью калибровки ±0,1 рН при температуре 20 °С-25 °С по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.4).

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Стекла покровные по ГОСТ 6672.

Пробирки или флаконы соответствующей вместимости.

Могут быть использованы бутылки или флаконы с нетоксичными металлическими или пластиковыми завинчивающимися крышками.

Градуированные или автоматические пипетки вместимостью 10, 2 и 1 см

с градуировкой на 0,5 и 0,1 см

.

Чашки Петри среднего размера (диаметр 90 или 100 мм) и/или большие (диаметр 140 мм).

Спирт изобутиловый по ГОСТ 9536.

Бриллиантовый зеленый.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709**.

Желчь бычья сухая или натуральная.

Железо (III) аммоний цитрат.

Железо (III) цитрат.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363.

Карбамид (мочевина) по ГОСТ 6691.

Контрольный штамм бактерий рода Salmonella, не относящихся к тифозной группе.

Креатин моногидрат.

Ксилоза.

L-лизин гидрохлорид.

4-диметиламинобензальдегид.

Магний хлористый по ГОСТ 4209.

Натрий кислый селенистокислый

.

Натрий гипосульфит

.

Натрий деоксихолат.

о-нитрофенил

-D-галактопиранозид (ONPG).

Новобиоцин натриевая соль.

Сухие агглютинирующие адсорбированные поливалентные сальмонеллезные О-сыворотки основных групп А, В, С, Д, Е и редких групп.

Vi- и Н-агглютинирующие сыворотки.

Толуол.

Феноловый красный.

Ферментативный гидролизат сои.

Экстракт мясной.

Допускается применение средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не хуже указанных.

      7 Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669.

Важно, чтобы для испытания поступила представительная проба, не поврежденная и не измененная в ходе транспортирования или хранения.

      8 Проведение испытания

Схема проведения испытания приведена в приложении Б.

8.1 Навеска и исходное разведение

8.1.1 Общие положения

Для приготовления исходной суспензии используют как разбавитель неселективную среду, указанную в 5.2.1 и 4.2 (забуференную пептонную воду).

Если масса пробы иная, чем 25 г, используют необходимое количество неселективной среды, исходя из соотношения 1:10.

Для уменьшения объема работы, когда испытывают больше одной пробы от определенного продукта и когда очевидно, что объединенная навеска не влияет на результат испытания, - навески объединяют.

Пример - Если необходимо исследовать 10 навесок по 25 г, их объединяют и к 250 г добавляют 2,25 дм

неселективной среды.

8.1.2 Специфичность приготовления исходной суспензии для некоторых продуктов

Указанная специфичность приготовления может быть применена только для выявления бактерий рода Salmonella.

8.1.2.1 Какао и какаосодержащие продукты (массовая доля какао более 20%)

Добавляют в забуференную пептонную воду (см. 5.2.1) 50 г некислого казеина или 100 г/дм

обезжиренного молочного порошка и, если пищевые продукты предположительно содержат большое количество грамположительных микроорганизмов, прибавляют после 2 ч инкубирования 0,018 г/дм

бриллиантового зеленого (3,6 см

/дм

раствора, приготовленного по В.4.4). Казеин и молочный порошок добавляют при приготовлении забуференной пептонной воды до стерилизации.

8.1.2.2 Кислые и кислотосодержащие пищевые продукты

При неселективном обогащении должна быть гарантия того, что рН не будет ниже 4,5.

рН кислых и кислотосодержащих продуктов стабилизируют путем использования забуференной пептонной воды двойной концентрации.

Допускается также при высеве жидких высококислотных продуктов для предотвращения снижения рН сред на 0,5 и более рН продукта перед посевом доводить до (7,0±0,2).

При высеве твердых высококислотных продуктов доводят рН до (7,0±0,2) в посевах.

Доведение рН проводят с соблюдением правил асептики с помощью стерильных растворов гидроокиси натрия и соляной кислоты, приготовленных по ГОСТ 10444.1. Количество добавляемых растворов устанавливают опытным путем.

8.2 Неселективное обогащение

Инкубируют исходную суспензию (см. 8.1.1) при температуре (37±1) °С в течение (18±2) ч.

8.3 Селективное обогащение

Культуры, полученные после инкубирования по 8.2, пересевают в среды для селективного обогащения. Для этого по

1

см

культуры пересевают в 10 см

RVS-бульона

и в 10 см

селенитовой среды

или в 10 см

тетратионатного бульона Мюллер-Кауфмана.

Посевы на RVS-бульоне инкубируют при температуре (41,5±1,0) °С в течение (24±3) ч (следят за тем, чтобы температура не превышала 42,5 °С), а на тетратионатном бульоне и селенитовой среде посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

Если из одного пищевого продукта проведен высев нескольких навесок (каждой отдельно) для выявления бактерий рода Salmonella, то допускается из каждого посева по 8.2 пересев проводить в один флакон с каждой селективной питательной средой (RVS-бульоном, тетратионатным бульоном Мюллер-Кауфмана,

селенитовой

средой). При этом количество селективной среды во флаконе должно быть увеличено по сравнению с 10 см

во столько раз, из скольких посевов проводят пересев.

Свежие продукты, не содержащие поврежденных микроорганизмов, подвергнутые* каким-либо воздействиям, например сушке, заморозке и другим, допускается высевать непосредственно в селективные среды, минуя этап неселективного обогащения. Соотношение между количеством высеваемого продукта и средой должно быть не менее 1:10.

8.4 Пересев на чашки и идентификация

8.4.1 Культуры через 24 ч инкубирования на селективных средах пересевают по ГОСТ 26670 так, чтобы получить хорошо изолированные колонии, на XLD-arap и на одну из агаризованных сред: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или бриллиантовый зеленый агар.

При отсутствии больших чашек используют для посева петлей две средние чашки (одну за другой).

8.4.2 Чашки переворачивают (см. 8.4.1) вверх дном и помещают в термостат при температуре (37±1) °С.

8.4.3 После инкубирования в течение (24±3) ч, а на бриллиантовом зеленом агаре - 48 ч, просматривают чашки (см. 8.4.2) и отмечают присутствие типичных колоний бактерий рода Salmonella и не совсем типичных колоний, которые могут быть бактериями рода Salmonella. Отмечают их местоположение на дне чашки.

Типичные колонии бактерий рода Salmonella, вырастающие на XLD-arape, имеют черный центр и слегка прозрачную зону красноватого цвета, что принадлежит цвету индикатора.

Бактерии рода Salmonella

-отрицательные варианты (например, S. Paratyphi А) образуют на XLD-arape розовые колонии с темным розовым центром, лактозоположительные бактерии рода Salmonella на XLD-arape - желтые колонии с почернением или без него.

На висмут-сульфит агаре бактерии рода Salmonella образуют черные колонии с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком и с пигментированием среды под колониями.