ГОСТ 10444.7-86 Продукты пищевые. Методы выявления ботулинических токсинов и Clostridium botulinum.
ГОСТ 10444.7-86
Группа Н09
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
Методы выявления ботулинических токсинов и Clostridium botulinum
Food products. Methods for detection of botulinal toxins and Clostridium botulinum
МКС 07.100.30
ОКСТУ 9109
Дата введения 1987-07-01
Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 12 мая 1986 г. N 1214 дата введения установлена 01.07.87
ВЗАМЕН ГОСТ 10444.7-75, ГОСТ 10444.8-75
ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.
Настоящий стандарт устанавливает методы выявления в пищевых продуктах ботулинических токсинов всех типов, вегетативных клеток и спор токсигенных штаммов Clostridium botulinum, определения титра ботулинических токсинов, серологического типирования токсина и выделения культур токсигенных штаммов С. botulinum типа А, В, С, D, Е, F и G.
Метод выявления ботулинического токсина и определение его титра основан на выявлении симптомов клинической картины болезни и гибели животных, характерных для ботулинической интоксикации.
Серологическое типирование токсина С. botulinum осуществляется на белых мышах путем постановки защитного теста in vivo или реакции нейтрализации in vitro с диагностическими противоботулинистическими типоспецифическими антитоксическими сыворотками.
Метод выявления С. botulinum основан на его способности развиваться и образовывать ботулинические токсины в питательных средах для анаэробных микроорганизмов.
Выделение культур токсигенных штаммов С. botulinum из продукта или культуральной жидкости проводят путем высева на твердые питательные среды с последующим исследованием культуральных и морфологических признаков, характерных для С. botulinum, и определением способности выделенной культуры образовывать ботулинический токсин.
Методы предназначены:
для исследования продуктов по санитарно-эпидемиологическим показаниям;
для анализа посевов продуктов, в случае обнаружения в них мезофильных анаэробных микроорганизмов.
Исследования проводят в лабораториях, указанных органами здравоохранения.
Термины, применяемые в настоящем стандарте, и пояснения к ним приведены в приложении 1.
Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 5211-65.
1. МЕТОДЫ ОТБОРА И ПОДГОТОВКА ПРОБ
1.1. Методы отбора проб пищевых продуктов - по ГОСТ 26668-85 и в соответствии с требованием приложения 4. Пробы пищевых продуктов подготавливают к анализу по ГОСТ 26669-85. Консервы и полуконсервы проверяют на герметичность по ГОСТ 8756.18-70 и термостатируют по ГОСТ 26669-85.
1.2. Термостатированию не подлежат: консервы и полуконсервы в негерметичной таре, бомбажные, хлопуши, консервы с видимыми невооруженным глазом признаками развития микроорганизмов и предназначенные для одновременного выявления ботулинических токсинов и С. botulinum или только ботулинических токсинов.
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ И РАСТВОРЫ
2.1. Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы, реактивы и растворы по ГОСТ 10444.1-84, а также аппаратуру, материалы, реактивы и растворы, указанные ниже:
анаэростат;
аппарат для встряхивания;
баллоны с газами (азот, водород, гелий или смесью: азот 80%, углекислый газ - 10%, водород - 10%);
весы аналитические;
грушу резиновую;
доски для сушки посуды;
ерши для мойки посуды;
корзинки проволочные луженые для стерилизации;
микроскоп биологический с приспособлением для фазовоконтрастного микроскопирования;
микропипетки;
пестик для фарфоровой ступки;
петли бактериологические;
пипетки пастеровские;
размельчитель тканей лабораторный;
редукторы к баллонам с газом;
стекла предметные по ГОСТ 9284-75;
стекла покровные по ГОСТ 6672-75;
фильтры асбестовые, керамические, мембранные;
футляры металлические для стерилизации пипеток, чашек Петри, шприцев;
штативы для пипеток;
штативы для пробирок;
бумагу индикаторную;
дуршлаг;
масло иммерсионное;
перчатки резиновые;
фильтр тканевый;
мышей белых массой 15-20 г одного пола;
кальций углекислый стерильный готовят по ГОСТ 10444.1-84. Добавление углекислого кальция к средам с глюкозой способствует образованию спор С. botulinum;
кислоту соляную по ГОСТ 3118-77, раствор с массовой долей соляной кислоты 4%. Применяют для подкисления питательных сред;
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52465-2005.
мальтозу;
малахитовый зеленый;
медь сернокислую по ГОСТ 4165-78, 1%-ный раствор. Применяют для постановки биуретовой реакции в питательных средах;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, раствор с массовой долей гидроокиси натрия 4%. Применяют для подщелачивания питательных сред;
натрий углекислый по ГОСТ 83-79, 0,3-1%-ный раствор. Применяют для кипячения игл для шприцев (см. приложение 3);
натрия тиогликолят;
неомицин;
перекись водорода по ГОСТ 177-88, раствор с массовой долей перекиси водорода 3%;
растворы фосфатного буфера:
для приготовления фосфатного буфера готовят растворы:
растворы желатино-фосфатного буфера:
смесь реактивов для создания анаэробных условий готовят по ГОСТ 10444.1-84. Допускается использование талька вместо инфузорной земли;
гидролизат казеина ферментативный;
фломастеры (применяют для метки мышей);
циклосерин;
эмульсию яично-желточную: свежие куриные яйца моют, ополаскивают холодной водой, опускают в 70%-ный спирт и высушивают. Разбивают каждое яйцо, соблюдая правила асептики, в стерильную чашку Петри и отделяют желток от белка. Помещают желтки в стерильную колбу или флакон с четырьмя объемами стерильной воды и энергично перемешивают. Нагревают смесь на водяной бане при температуре (45±0,5) °С в течение 2 ч, оставляют на 18-24 ч при температуре от 0 до плюс 5 °С для того, чтобы сформировался осадок.
С соблюдением правил асептики собирают эмульсию над осадком. Эмульсию хранят при температуре 0 - плюс 5 °С не более 72 ч. Применяют для определения способности С. botulinum давать положительную реакцию с яичным желтком.
3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Если нет специальных указаний по хранению среды, то среду хранят в темноте при температуре (4±2) °С не более 1 мес. Сухие среды, в состав которых входят тиогликолят натрия и цистеина гидрохлорид, хранят в герметичной упаковке при температуре (4±2) °С. Приготовленные из них жидкие и полужидкие среды хранят при комнатной температуре не более 7 сут.
3.2. Для выявления и выделения С. botulinum используют следующие среды.
3.2.2. Агар печеночно-желточный; агар печеночный готовят по ГОСТ 10444.1-84.
При отсутствии печеночного агара допускается заменять его мясо-пептонным агаром.
Применяют для определения способности С. botulinum давать положительную реакцию с яичным желтком.
3.2.3. Агар мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1-84.
3.2.4. Агар сахарный кровяной по Цейсслеру готовят по ГОСТ 10444.1-84.
Применяют при определении гемолитической активности С.botulinum.
3.2.6. Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1-84.
Применяют для культивирования С. botulinum.
3.2.7. Среду из вареного мяса (Cook-Meat Medium) готовят по ГОСТ 10444.1-84.
Применяют для выделения и культивирования С. botulinum.
3.2.8. Среду Китт-Тароцци с углекислым кальцием готовят по ГОСТ 10444.1-84.
Применяют для выявления и культивирования С. botulinum.
3.2.9. Среду печеночно-глицериновую готовят по ГОСТ 10444.1-84.
Применяют для культивирования С. botulinum.
3.2.10. Среду питательную для контроля стерильности, сухую.
В состав среды входят:
фермент активный гидролизат казеина неглубокой степени расщепления - 15,0 г;
витаминный препарат экстракта кормовых дрожжей 5,0 г;
натрий хлористый - 6,4 г;
глюкоза - 5,0 г;
тиогликолят натрия - 0,3 г;
цистеина гидрохлорид - 0,75 г;
агар - 0,6 г;
натрий углекислый - 0,5-0,95 г;
Среду хранят при комнатной температуре не более 7 сут.
Применяют для культивирования С. botulinum.
3.2.11. Улучшенную клостридиальную среду (R. С. М.) готовят по ГОСТ 10444.1-84.
Применяют для культивирования С.botulinum.
Применяют для культивирования С. botulinum.
Применяют для выделения С. botulinum.
Применяют для выделения С. botulinum.
4. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ
4.1. Подготовка продукта к испытанию на наличие ботулинических токсинов
При отсутствии продукта в достаточном количестве выявляют ботулинические токсины в исходной жидкости меньшего объема.
Экстракты из сыпучих и твердых продуктов, нерастворимых в воде, получают из соленых продуктов (содержащих более 2% NaCl) при добавлении дистиллированной воды в соотношении 1:1 или 1:2, из несоленых и предварительно восстановленных продуктов тепловой и сублимационной сушки - при добавлении такого же количества физиологического раствора.
Предварительно измельченный ножом или ножницами продукт переносят в стерильную ступку, добавляют при необходимости стерильный песок или стерильную стеклянную крошку и доводят до однородной консистенции, постоянно добавляя воду или физиологический раствор. Смесь переносят в стерильную колбу.
Водорастворимые или пастообразные продукты смешивают с водой или физиологическим раствором в соотношении 1:1 или 1:2 в стерильной колбе.
Полученные смеси выдерживают при температуре (4±2) °С в течение 2 ч и затем извлекают из них жидкую фракцию.
Прогрев и ротационную гомогенизацию продукта для выявления ботулинических токсинов не проводят; продукт измельчают в ступке.
4.2. Подготовка продукта к испытанию для выявления и выделения С.botulinum
5. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ
5.1. Выявление ботулинических токсинов
5.1.1. Выявление ботулинических токсинов проводят по табл.1 или одновременно с использованием противоботулинических антитоксических сывороток по табл.2. Исследования проводят с исходной жидкостью (ИЖ), если в ней ботулинический токсин не обнаружен, то ИЖ обрабатывают протеолитическим ферментом.
Таблица 1
Постановка исследований по обнаружению ботулинического токсина и определению титра токсина в исходной жидкости
|
|
|
|
|
|
|
Цель исследования | Объем ИЖ, см | Минимально выявляемое количество токсина в MLD ИЖ или ИЖТ, см | Способ подготовки Ж для инъекции | Объем Ж для инъек- ции двум мышам, см | Коли- чество шпри- цев, шт. | Порядок исследования |
Обнаружение ботулинических токсинов | 1 | Токсин инактивирован | ИЖ прогретая | 0,5x2 | 1 | Вначале ставят биологическую пробу с прогретой ИЖ, затем с ИЖ и в последнюю очередь с ИЖТ |
| 1 | 2 | ИЖ | 0,5x2 | 1 |
|
| 1 | 2 | ИЖТ | 0,5x2 | 1 |
|
| 0,5 | 4 | 0,5 ИЖ+0,5 ЖФБ | 0,5x2 | 1 | При неспецифических симптомах гибели животных в предыдущих вариантах |
| 0,1 | 20 | 0,1 ИЖ+0,9 ЖФБ | 0,5x2 | 1 |
|
| 2 | 1 | Увеличенный объем ИЖ | 1,0x2 | 1 | При слабо выраженных симптомах ботулинической интоксикации |
| 2 | 1 | Увеличенный объем ИЖТ | 1,0x2 | 1 |
|
Определение титра ботулинического токсина | 1·10  | 200 | 1 ИЖ (ИЖТ)+99 ЖФБ | 0,5x2 | 1 | Биологическую пробу с ИЖ или ИЖТ начинают с наибольшего разведения |
| 1·10 | 20 | 1 ИЖ (ИЖТ)+9 ЖФБ | 0,5x2 | 1 |
|
| 0,5 | 4 | 1 ИЖ (ИЖТ)+1 ЖФБ | 0,5x2 | 1 |
|
| 1·10  | 200000 | 1 ИЖ (ИЖТ)+99999 ЖФБ | 0,5x2 | 1 | Биологическую пробу с ИЖ или ИЖТ начинают с наибольшего разведения |
| 1·10  | 20000 | 1 ИЖ (ИЖТ) +9999 ЖФБ | 0,5x2 | 1 |
|
| 1·10  | 2000 | 1 ИЖ (ИЖТ)+999 ЖФБ | 0,5x2 | 1 |
|
Примечания:
1. ИЖ - исходная жидкость; Ж - жидкость, подготовленная соответствующим способом из ИЖ или ИЖТ для введения каждой из двух белых мышей; ИЖТ - исходная жидкость, обработанная протеолитическим ферментом; ЖФБ - буферный желатино-фосфатный раствор. Если предполагается наличие токсина С. botulinum E, то разведения более 1 ИЖТ + 999 ЖФБ не готовят.
2. Допускается титр ботулинического токсина не определять.
Таблица 2
Постановка исследований по обнаружению и типированию ботулинических токсинов
|
|
|
|
|
|
Номер вари- анта опыта
| Иссле- дуемый вариант | Типы противоботу- линических сывороток | Состояние подопытных мышей | Условия опыта | Наличие и тип ботулинического токсина |
1 | ИЖ (ИЖТ) | Без сывороток | Болеют и обычно погибают со специфическими клиническими симптомами ботулизма | Концентрацию ИЖ (ИЖТ) и способ подготовки для инъекции выбирают по табл.1 | Присутствует один или несколько типов ботулинических токсинов |
2 | ИЖ (ИЖТ) | Трехвалентная типов А, В, Е | Живы | Мыши в 1-ом варианте погибли | Тип А, В или Е (F)* или их комбинации |
3 | ИЖ | Моновалентная типа А | " | То же | Тип А |
4 | ИЖ | Моновалентная типа В | " | " | Тип В |
5 | ИЖ (ИЖТ) | Моновалентная типа Е | " | " | Тип Е (тип F)* |
6 | ИЖ (ИЖТ) | По табл.3 | Живы мыши, получившие гомологический тип сыворотки | " | Один или несколько типов токсина, соответствующих типу (типам) сывороток, защитивших мышей от гибели |
________________
* При перекрестной реакции с сывороткой типа Е.
Вторую пробирку с исходной жидкостью кипятят на водяной бане в течение 10 мин и охлаждают до комнатной температуры. Первую пробирку с исходной жидкостью оставляют без обработки.
Хранение исходной жидкости, обработанной протеолитическим ферментом, не допускается.
Непосредственно после окончания обработки исходной жидкости протеолитическим ферментом ставят биологическую пробу на белых мышах.
5.1.3. При наличии в исходной жидкости ботулинического токсина болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации те животные, которым введена необработанная протеолитическим ферментом жидкость, и, если фермент не инактивировал ботулинический токсин, то болеют и погибают животные, которым введена жидкость, обработанная протеолитическим ферментом. При наличии в исходной жидкости ботулинических протоксинов болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации в первую очередь те животные, которым введена обработанная ферментом жидкость; мыши, которым введена не обработанная ферментом жидкость, могут переболеть, но не погибают или погибают позже. Мыши, которым введена прокипяченная жидкость, должны оставаться на всем протяжении опыта здоровыми. Если болеют или погибают мыши, получившие прокипяченную и непрокипяченную жидкость, то исходную жидкость разводят буферным желатино-фосфатным раствором в соотношении 1:1 и 1:9 и повторяют исследования по вышеописанному методу с тем, чтобы избежать гибели животных от прокипяченной жидкости или подтвердить, что клинические признаки гибели животных по всем вариантам опыта не соответствуют признакам ботулинической интоксикации.
При наличии в исходной жидкости ботулинических токсинов все последующие исследования проводят с необработанной жидкостью (ИЖ); ботулинических протоксинов - с жидкостью, обработанной протеолитическим ферментом (ИЖТ).
5.2. Определение титра ботулинического токсина
5.2.2. Опытным путем подбирают такие разведения исходной жидкости или жидкости, обработанной протеолитическим ферментом, при введении которых погибают все мыши, и последующие разведения, при которых мыши не погибают.
5.3. Серологическое типирование токсина С. botulinum
5.3.1. Подтверждение присутствия и установление типа ботулинического токсина защитным тестом
Таблица 3
Подбор противоботулинических сывороток для типирования ботулинических токсинов в ИЖ (ИЖТ)
|
|
|
|
Номер вари-анта опыта | Анализируемый продукт | Типы используемых противоботулинических сывороток и их комбинации | Типы выявляемых ботулинических токсинов или их комбинации |
1 | Не прошедший термическую обработку | Моновалентные типов А, В, Е | А, В, Е (F) |
|
| и трехвалентная типов А, В, Е | А+В+Е (F) |
2 | Тот же, не содержащий ботулинических токсинов или их комбинаций, выявляемых по 1-му варианту опыта | Моновалентная типа F | F (E) |
|
| Моновалентная типа С | C (D) |
3 | Прошедший термическую обработку | Моновалентная типа А и В, бивалентная АВ | А; В; А+В |
4 | Тот же, не содержащий типы ботулинических токсинов или их комбинаций, выявляемых по 3-му варианту опыта | Моновалентная типа F | F (E) |
|
| Моновалентная типа Е | E (F) |
|
| Моновалентная типа С | C (D) |
5 | Любой, не содержащий типы ботулинических токсинов или их комбинаций, выявляемых по 1-4-му вариантам опыта | Бивалентные типы: АС | А+С (D) |
|
| АЕ | А+Е (F) |
|
| AF | А+F (E) |
|
| ВС | В+С (D) |
|
| BE | В+Е (F) |
|
| BF | В+F (E) |
|
| СЕ | С (D)+Е (F) |
|
| CF | С (D)+F (E) |
|
| EF | Е+F |
| Любой, не содержащий типы ботулинических токсинов или их комбинаций, выявляемые по 1-4-му вариантам опыта | Трехвалентные типы: ABF | А+В+F (Е) |
|
| ВСЕ | В+C (D)+E (F) |
|
| ВСF и другие
| В+C (D)+F (E) и другие |
|
| Поливалентная типа ABCEF | А+В+C (D)+Е+F |
6 | Тот же, не содержащий типы ботулинических токсинов или их комбинаций, выявляемые по 1-5-му вариантам опыта | Моновалентная типа D | D (C) |
|
| Моновалентная типа G | G |
|
| Поливалентная типов А, В, С, D, E, F | (A+B+C+D+E+F+G) и другие комбинации, в соответствии с комбинациями использованной сыворотки |
Примечания:
1. Исследование начинают с использования комбинации с наибольшим количеством типов сывороток, и в случае, если использованная комбинация типов сывороток защищает мышей от гибели, типируют ботулинические токсины моно-, би- или трехвалентными сыворотками, указанными в соответствующем варианте опыта.
2. В скобках указана возможная перекрестная реакция при типировании ботулинических токсинов.
5.3.1.4. При наличии в исходной жидкости ботулинического токсина болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации те мыши, которым введена сыворотка, не гомологичная типу ботулинического токсина в исходной жидкости. Погибают также мыши, которые получили гомологичную сыворотку в объеме, недостаточном для защиты от высокой дозы токсина. Мыши, получившие сыворотку, в состав которой входит моновалентная сыворотка, гомологичная типу ботулинического токсина в исходной жидкости, остаются живы. Если болеют и погибают все животные, то биологическую пробу повторяют, применяя более разбавленную исходную жидкость или ранее не использованные комбинации моновалентных сывороток.
5.3.2. Подтверждение присутствия и установление типа ботулинического токсина реакцией нейтрализации
Допускается одновременное установление присутствия и типа ботулинического токсина путем постановки развернутой реакции нейтрализации.
Концентрированные сыворотки применяют при необходимости с целью подтверждения присутствия ботулинических токсинов в исходной жидкости в наиболее короткий срок с наименьшим количеством животных без предварительного определения титра ботулинического токсина.
5.3.2.1. Для постановки реакции нейтрализации и типирования ботулинических токсинов концентрированными антитоксическими диагностическими противоботулиническими сыворотками используют сухие сыворотки, имеющие титр в пределах: для типа А - 200-440 ME; для типа В - 100-200 ME; для типа Е - 200-400 ME; по возможности реакция ставится с сыворотками типа С - 200-300 ME, типа F - 50 ME.
5.4. Выявление С. botulinum
5.4.1. Для выявления С. botulinum питательные среды для высева навесок продукта выбирают по табл.4, используя одну из сред, предложенных для высева 1-й навески, и одну из сред, предложенных для высева 3-й навески.
Таблица 4
Схема посевов в питательные среды для выявления С. botulinum
|
|
|
|
|
Но- мер на- вески | Пищевой продукт | Питательная среда для посева | Обработка посевов | Темпе- ратура термо- стати- рования, °С |
1 | Любой, кроме консервов, при подозрении на присутствие вегетативных клеток С. botulinum типов А, В, С, D, F, разлагающих казеин | Печеночно-глицериновая; улучшенная клостридиальная; из вареного мяса; Китт-Тароцци; бульон с кониной и мальтозой | Без обработки | 36±1 |
| Консервы | То же
| То же | 30±1 |
2 | Любой, кроме консервов, при подозрении на присутствие спор С. botulinum типов А, В, С, D, F, разлагающих казеин | " | Прогрев (60±1) °С или при (80±1) °С в течение 15 мин | 36±1 |
| Консервы |
| То же
| 30±1 |
3 | Любой при подозрении на присутствие С. botulinum типов В, С, D, E, F, не разлагающих казеин | Триптиказо-пептонно-глюкозная с дрожжевым экстрактом; питательная для определения стерильности; Хоттингера; бульон с кониной и мальтозой - с добавлением трипсина | Без обработки | 30±1* |
4 | Любой при подозрении на присутствие спор С.botulinum типов В, С, D, E, F, не разлагающих казеин; навеску продукта обрабатывают спиртом | То же, но без добавления трипсина | То же | 30±1* |
_______________
* При подозрении на присутствие психротрофных штаммов С. botulinum, посевы термостатируют при (26±1) °С.
Навески продукта вносят на дно сосуда с питательной средой. Одну из навесок обрабатывают перед посевом этиловым спиртом (96% или абсолютным). Навеску смешивают с равным объемом спирта в колбе с притертой пробкой и, периодически встряхивая, выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Навеску или осадок навески, обработанные спиртом, вносят в питательную среду. Посевы прогревают при температуре и в течение времени, приведенных в табл.4, и помещают в термостат.
5.4.2. Посевы термостатируют, наблюдая за появлением признаков роста микроорганизмов до 14 сут. После появления признаков роста микроорганизмов посевы продолжают выдерживать в термостате 5 сут. Через 5 сут после появления роста микроорганизмов посевы переносят в холодильник и хранят при (4±2) °С.
Развитие С. botulinum в питательных средах начинается со дна пробирки, с помутнения среды, которое равномерно распространяется по всему столбику жидкости, иногда отступая от поверхности на 0,5-1,0 см, и сопровождается выделением пузырьков газа. Видимое газообразование может отсутствовать. Культуральная жидкость издает посторонний запах: гнилостный, сырный, масляно-кислый - от слабо выраженного до явного. С возрастом клетки С.botulinum частично лизируются, часто оседают на дно, и помутнение среды исчезает.
Некоторые штаммы С. botulinum могут переваривать кусочки мяса. При развитии в смешанной культуре те или иные признаки, характеризующие присутствие в культуральной среде С. botulinum, могут отсутствовать.
Непосредственно после появления признаков роста микроорганизмов и затем на 3-и и 5-е сут из посевов отбирают пастеровской пипеткой со дна культуральную жидкость для окраски по Граму, окраски спор, фазово-контрастного микроскопирования и пробы на каталазу по ГОСТ 30425-97. В препаратах устанавливают морфологию бактерий, отмечают наличие типичных клостридиальных клеток, наличие и относительную интенсивность спорообразования и место локализации спор внутри клеток. За 18-24 ч культура С. botulinum образует грамположительные палочки с закругленными концами различной длины и ширины (приложение 1). При старении культуры в ней появляются клетки, не окрашивающиеся по Граму, и спорообразующие клетки обычно в виде ракеток и отдельные споры. Возбудители ботулизма в чистой культуре каталазу не образуют.
После появления признаков роста микроорганизмов пятидневную культуральную жидкость из всех посевов одновременно или последовательно исследуют на присутствие ботулинических токсинов и ботулинических протоксинов по п.5.1.
Исследование начинают с тех посевов, в которых признаки развития С. botulinum выражены наиболее четко; исследование прекращают при обнаружении ботулинического токсина или ботулинического протоксина хотя бы в одном из посевов. В случае необходимости допускается начинать исследование культуральной жидкости раньше, но заключение об отсутствии ботулинического токсина может быть дано только на основании исследования пятидневной культуры.
Обнаружение в культуральной жидкости ботулинического токсина или протоксина и клостридиальных клеток указывает на присутствие в посеве токсигенного штамма С. botulinum. Устанавливают тип обнаруженного токсина или протоксина и тем самым тип С. botulinum, присутствующего в посеве.
5.5. Выделение культур токсигенных штаммов С. botulinum
5.5.1. Выделение культур токсигенных штаммов С. botulinum проводят при получении нечетких результатов по нейтрализации и (или типировании ботулинических токсинов в исходной жидкости).
5.5.2. Культуру токсигенных штаммов С. botulinum выделяют одновременно с (или после) обнаружением ботулинического токсина и (или) мезофильных клостридий в продукте или в культуральной жидкости. Для выделения отбирают те части продукта или те посевы, в которых обнаружены спорообразующие клостридиальные клетки и в которых спорообразование протекало наиболее интенсивно.
Содержимое второй пробирки прогревают при (60±1) °С или при (80±1) °С в течение 15 мин.
Содержимое третьей пробирки смешивают с равным объемом спирта, укупоривая пробирку так, чтобы во время выдержки спиртовой смеси спирт не улетучивался из пробирки.
5.5.3. Для выделения токсигенных штаммов С. botulinum применяют печеночно-желточный агар, желточный агар для анаэробов или агар кровяной с глюкозой или питательный агар с яичным желтком и лактозой. Продукт или культуральную жидкость отбирают из пробирок пастеровской пипеткой, наносят каплю на поверхность среды и втирают в нее шпателем, получая изолированные колонии. Для этого одним шпателем последовательно засевают три-четыре чашки Петри, перенося посевной материал шпателем из одной чашки в другую. Чашки с посевами термостатируют при (30±1) °С - (36±1) °С в течение 48 ч в анаэробных условиях по ГОСТ 30425-97.
Для подтверждения принадлежности выделенных колоний к клостридиям определяют отсутствие каталазы по ГОСТ 30425-97.
Бактериологической петлей из 5-10 колоний, имеющих характерные для С. botulinum свойства, отбирают посевной материал и переносят его соответственно в 5-10 пробирок с питательными средами, посевы термостатируют, устанавливают присутствие в них и тип С. botulinum.
6. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
6.1. Если при проведении биологической пробы хотя бы одна из особей мышей, получившая жидкий продукт, жидкую фракцию или экстракт из продукта, заболела с проявлением клинических симптомов, характерных для ботулинической интоксикации, и остались живы мыши, получившие прокипяченный жидкий продукт, прокипяченную жидкую фракцию или прокипяченный экстракт из продукта, то считают, что в продукте содержится ботулинический токсин.
6.2. Если после предварительной обработки протеолитическим ферментом обнаружен токсин или его количество в продукте увеличилось, то считают, что в продукте содержится ботулинический протоксин.
6.3. Если при проведении биологической пробы все мыши остаются живы, то считают, что ботулинические токсины и протоксины в навеске проанализированного продукта содержатся в количестве менее X-MLD (где X-MLD - минимальное количество токсина, которое можно обнаружить в анализируемом продукте), или отсутствуют.
6.4. Если мыши погибли ранее, чем через 2 ч после постановки биологической пробы с разведенной исходной жидкостью без проявления клинических симптомов ботулинической интоксикации, то указывают, что определить присутствие в анализируемом продукте ботулинического токсина по настоящему стандарту не представляется возможным.
6.5. Если в результате защитного теста или реакции нейтрализации ботулинических токсинов или протоксинов противоботулиническими антитоксическими сыворотками мыши, получившие при постановке биологической пробы только исходную жидкость продукта, а получившие исходную жидкость продукта с моновалентной или двух-, трех- или поливалентной сывороткой, остаются живы, то считают, что в продукте содержится один или несколько ботулинических токсинов или протоксинов.
6.6. Если нейтрализовать и/или типировать ботулинический токсин в продукте и/или в культуральной жидкости не удалось, то указывают, что при проведении биологической пробы мыши погибли с клиническими симптомами ботулинической интоксикации. При этом указывают также типы и концентрации использованных противоботулинических антитоксических сывороток, разведение продукта или культуральной жидкости и раствор, применяемый для получения экстракта продукта.
6.7. Если при типировании ботулинических токсинов или протоксинов мыши, получившие исходную жидкость продукта, погибли с клиническими симптомами ботулинической интоксикации и не погибли мыши, получившие исходную жидкость продукта с противоботулиническими антитоксическими типоспецифическими сыворотками, то считают, что в продукте присутствуют ботулинический токсин или смесь ботулинических токсинов тех типов, которым соответствует сыворотка, нейтрализовавшая токсин и предохранившая животных от гибели.
6.9. При обнаружении в культуральной жидкости посева хотя бы в одной из навесок продукта клостридий и ботулинического токсина или протоксина считают, что в продукте присутствует токсигенный штамм С. botulinum.
Результаты исследования ботулинического токсина в культуральной жидкости посева продукта оценивают аналогично исследованию ботулинических токсинов в продукте.
6.10. Если проводилось выделение токсигенных штаммов С. botulinum, то при обнаружении в посевах хотя бы одной колонии клостридий, способной образовывать ботулинический токсин или протоксин, считают, что в продукте присутствует токсигенный штамм С. botulinum.
При обнаружении в посевах колоний клостридий, не способных образовывать ботулинический токсин или протоксин, считают, что в продукте токсигенные штаммы С. botulinum отсутствуют. Результаты исследования ботулинического токсина в культуральной жидкости выделенного штамма оценивают аналогично исследованиям ботулинических токсинов в продукте.
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Обязательное
ТЕРМИНЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В НАСТОЯЩЕМ СТАНДАРТЕ И ПОЯСНЕНИЯ К НИМ
|
|
Термин | Пояснение |
Исходная жидкость (ИЖ) | Жидкий продукт или жидкая фаза продукта, или его водный экстракт, или его экстракт в физиологическом растворе, или культуральная жидкость анаэробных посевов, полученные путем отстаивания и центрифугирования и (или) фильтрования продукта в соответствии с настоящим стандартом для исследования ботулинических токсинов |
Исходная жидкость, обработанная протеолитическим ферментом (ИЖТ) | Исходная жидкость, обработанная протеолитическим ферментом трипсином или панкреатином для обнаружения в ней ботулинических протоксинов и определения титра токсинов, полученных в результате такой обработки в соответствии с настоящим стандартом |
Ботулинические токсины типов А, В, С, D, Е, F, G | Комплекс белковых веществ, содержащий высокомолекулярный нейротоксический белок, образуемый С. botulinum типами А, В, С, D, Е, F, G, определяемый с помощью защитного теста или реакции нейтрализации с моно- или поливалентными специфическими антитоксическими сыворотками, и вызывающий заболевание человека, высших млекопитающих и птиц, протекающее с симптомами, характерными для ботулинической интоксикации |
С. botulinum | Клостридии, подвижные палочки с закругленными концами, единичные, парные или в коротких цепочках, образующие овальные субтерминальные, иногда парацентральные споры, обычно вздувающие клетку в виде ракетки или слабо выраженного веретена. В молодой культуре грамположительные. Каталазоотрицательные. Образуют желатиназу; липазу, кроме типа G; способность сбраживать глюкозу, мальтозу и салицин варьируют. Лактозу, сахарозу, маннит нe сбраживают, нитраты не редуцируют, индол не образуют. Углеводы сбраживают обычно с выделением кислоты и газа. Кислота при этом может нейтрализоваться NH  , образующимся в процессе разложения С. botulinum азотсодержащих соединений |
С. botulinum типы А, В, С, D, Е, F, G | С. botulinum образующий токсин соответственно типов А, В, С, D, Е, F, G |
С. botulinum типы А, В, С, D, F, разлагающие казеин | С. botulinum, токсины которых нейтрализуются соответственно антитоксическими противоботулиническими сыворотками типов А, В, С, D, F. Клетки 0,8-1,3  4,4-8,6 мкм. Образуют споры без экзоспориума. Разлагают казеин. Сбраживают глюкозу, образуют H S. Салицин, мальтозу сбраживают вариабельно. Не образуют лецитиназу. Оптимальная температура для роста от 30 до 40 °С |
С. botulinum типы С, D, не разлагающие казеин | С. botulinum, токсины которых нейтрализуются соответственно антитоксическими противоботулиническими сыворотками типов С, D. Клетки размером 0,5-0,7 3,4-7,9 мкм. Образуют споры без экзоспориума. Сбраживают глюкозу, иногда мальтозу, салицин. H S не образуют. Оптимальная температура для роста от 30 до 37 °С. Некоторые штаммы образуют лецитиназу |
С. botulinum типы В, Е, F, не разлагающие казеин | С. botulinum, токсины которых нейтрализуются соответственно антитоксическими противоботулиническими сыворотками типов В, Е, F. Клетки размером 0,3-0,7 3,4-7,5 мкм. С.botulinum типы Е, F, образуют споры с экзоспориумом. Споры С.botulinum Е имеют характерные подвески. Сбраживают глюкозу, иногда мальтозу. Отдельные штаммы образуют лецитиназу. Оптимальная температура для роста от 25 до 37 °С |
С. botulinum тип G, разлагающий казеин | С. botulinum, токсин которого нейтрализуется антитоксической противоботулинической сывороткой типа G. Клетки 1,3-1,9 1,6-9,4 мкм. Споры, как правило, не утолщают спорангий. Казеин расщепляется медленно и слабо. Сахара не сбраживает, лецитиназу, липазу не образует, гемолиза не дает. Образует H S. Оптимальная температура для роста от 30 до 37 °С |
Морфология колоний С. botulinum типы А, В, С, D, F, гидролизующие казеин, на агаре печеночном | Колонии  3-8 мм, округлые с ризоидными краями, плоские с вогнутой серединой, серые, тусклые или слегка блестящие, прозрачные с непрозрачной серединой. Растут одинаково как при наличии, так и в отсутствии сбраживаемых углеводов |
Морфология колоний С. botulinum типы В, Е, F, не гидролизующие казеин, на агаре печеночном | Колонии мелкие и средние, 1-3 мм, круглые с неправильными выступающими краями, тусклые, полупрозрачные. В присутствии сбраживаемого углевода размер колоний существенно увеличивается |
С. botulinum типы С, D, не гидролизующие казеин, на агаре печеночном | Колонии мелкие и средние, 1-3 мм, круглые с волнистыми краями, серовато-беловатые, гладкие, тусклые и прозрачные. Присутствие в средах сбраживаемых углеводов не влияет на их рост |
С. botulinum тип G на агаре печеночном | Колонии очень мелкие, 0,5-1,5 мм, круглые с ровными краями, выпуклые, серые, гладкие, блестящие. Добавление в среду углеводов не влияет на морфологию колоний |
Минимальная летальная доза - MLD для мыши | Минимальное количество токсина, вызывающее в течение 72 ч гибель всех белых мышей массой 15-20 г с характерными клиническими симптомами заболевания при внутрибрюшинном введении в биологическую пробу |
Титр токсина в MLD в см или г продукта | Количество (титр) токсина в 1 г или см продукта, культуральной жидкости или растворов, приготовленных из них, в MLD, вычисляют по формуле |
|  , |
| где  - разведение исходной жидкости, взятое с обратным знаком; |
|  - масса навески продукта, см или г; |
|  - объем жидкости, используемый для экстрагирования токсина, см ; |
|  - объем жидкости, введенной каждой мыши, см ; |
|  - объем исходной жидкости, взятый для приготовления 6 или 4-х кратного разведения, см ; |
|  - объем растворителя, взятый для приготовления 6 или 4-х кратного разведения исходной жидкости, см ; |
| ME - международная единица активности ботулинических антитоксинов, соответствующая определенному количеству моновалентной противоботулинической антитоксической сыворотки, способной нейтрализовать определенное количество гомологичного ботулинического токсина |
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
Обязательное
ТЕХНИКА ПОСТАНОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ
Количество белых мышей, необходимых для постановки биологической пробы, при постановке защитного теста, проведении реакции нейтрализации и при типировании ботулинических токсинов с разведенными типоспецифическими сыворотками, равняется числу разведений исходной жидкости (с учетом использования при низком титре ботулинического токсина исходной жидкости без разведения), умноженному на количество типов моновалентных двух-, трех- или поливалентных сывороток, применяемых для постановки защитного теста или реакции нейтрализации и типирования ботулинических токсинов в исследуемом продукте, и умноженному на количество мышей в каждом варианте опыта - обычно на две особи.
По клеткам или банкам рассаживают белых мышей, помещая не более двадцати мышей одного пола в каждую клетку или банку. Во время постановки опытов перераспределения мышей по клеткам не допускается.
При проведении биологической пробы надевают резиновые перчатки, указательным и большим пальцами левой руки захватывают кожу мыши на затылке, а хвост и левую заднюю лапу удерживают между ладонью, четвертым и пятым пальцами. При этом мышь держат головой вниз так, чтобы кишечник сместился книзу от места укола. Место укола обрабатывают спиртом. Правой рукой вводят иглу шприца в горизонтальном направлении между кожей и мышцами с левой стороны в задней трети живота, затем иглу слегка поворачивают в вертикальном направлении и осторожным движением продвигают вперед. Момент проникновения иглы в брюшную полость ощущают по исчезающему под рукой сопротивлению. После проникновения иглы в брюшную полость большим пальцем правой руки медленно нажимают поршень шприца и, следя за градуировкой на цилиндре, вводят определенное количество жидкости в брюшную полость. Затем иглу вынимают, животное метят и помещают в клетку для наблюдения.
Допускается ставить биологическую пробу на белых мышах с помощником, который фиксирует животных.
Мышей метят путем окрашивания их шерсти по определенной схеме раствором карболового фуксина, бриллиантового зеленого, раствором пикриновой кислоты либо фломастерами.
Одним цветом, основным (желательно красным) метят мышей с 1 по 9 номер.
Двумя цветами - красным и дополнительным - желтым или зеленым - метят мышей с двузначными номерами: с 10 до 99 включительно, причем десятки обозначают дополнительным цветом, а единицы - основным.
В зависимости от места окраски, пятна краски (желательно фуксина) соответствуют следующим условным номерам:
на левой передней лапе - 1, на левом боку - 2, на левой задней лапе - 3, на голове - 4, на спине - 5, у основания хвоста - 6, на правой передней лапе - 7, на правом боку - 8, на правой задней лапе - 9.
При комбинированной окраске двумя цветами разных мест получают любое двузначное число.
ПРИЛОЖЕНИЕ 3
Справочное
ПОДГОТОВКА ШПРИЦЕВ И ИГЛ К ИСПЫТАНИЮ
При отсутствии стерильных шприцев непосредственно перед использованием шприцы кипятят. Для этого в дистиллированную или мягкую воду (без примеси соды) при комнатной температуре погружают раздельно поршень и цилиндр. Воду постепенно доводят до кипения и кипятят детали шприцев не менее 20 мин.
Иглы кипятят отдельно. В канал иглы вводят мандрен, погружают ее в 0,3-1%-ный водный раствор углекислого натрия, постепенно доводят до кипения и кипятят не менее 20 мин. Прокипяченные детали шприца и иглы охлаждают до комнатной температуры и собирают.
ПРИЛОЖЕНИЕ 4
Справочное
ОТБОР ПРОБ ОТ ОСТАТКОВ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ
БОТУЛИНИЧЕСКИХ ТОКСИНОВ И C.botulinum
