ГОСТ 10444.7-86 Продукты пищевые. Методы выявления ботулинических токсинов и Clostridium botulinum.

ГОСТ 10444.7-86

Группа Н09

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Методы выявления ботулинических токсинов и Clostridium botulinum

 Food products. Methods for detection of botulinal toxins and Clostridium botulinum

МКС 07.100.30    

ОКСТУ 9109

Дата введения 1987-07-01

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 12 мая 1986 г. N 1214 дата введения установлена 01.07.87

ВЗАМЕН ГОСТ 10444.7-75, ГОСТ 10444.8-75

ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.

Настоящий стандарт устанавливает методы выявления в пищевых продуктах ботулинических токсинов всех типов, вегетативных клеток и спор токсигенных штаммов Clostridium botulinum, определения титра ботулинических токсинов, серологического типирования токсина и выделения культур токсигенных штаммов С. botulinum типа А, В, С, D, Е, F и G.

Метод выявления ботулинического токсина и определение его титра основан на выявлении симптомов клинической картины болезни и гибели животных, характерных для ботулинической интоксикации.

Серологическое типирование токсина С. botulinum осуществляется на белых мышах путем постановки защитного теста in vivo или реакции нейтрализации in vitro с диагностическими противоботулинистическими типоспецифическими антитоксическими сыворотками.

Метод выявления С. botulinum основан на его способности развиваться и образовывать ботулинические токсины в питательных средах для анаэробных микроорганизмов.

Выделение культур токсигенных штаммов С. botulinum из продукта или культуральной жидкости проводят путем высева на твердые питательные среды с последующим исследованием культуральных и морфологических признаков, характерных для С. botulinum, и определением способности выделенной культуры образовывать ботулинический токсин.

Методы предназначены:

для исследования продуктов по санитарно-эпидемиологическим показаниям;

для анализа посевов продуктов, в случае обнаружения в них мезофильных анаэробных микроорганизмов.

Исследования проводят в лабораториях, указанных органами здравоохранения.

Термины, применяемые в настоящем стандарте, и пояснения к ним приведены в приложении 1.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 5211-65.

 1. МЕТОДЫ ОТБОРА И ПОДГОТОВКА ПРОБ

1.1. Методы отбора проб пищевых продуктов - по ГОСТ 26668-85 и в соответствии с требованием приложения 4. Пробы пищевых продуктов подготавливают к анализу по ГОСТ 26669-85. Консервы и полуконсервы проверяют на герметичность по ГОСТ 8756.18-70 и термостатируют по ГОСТ 26669-85.

1.2. Термостатированию не подлежат: консервы и полуконсервы в негерметичной таре, бомбажные, хлопуши, консервы с видимыми невооруженным глазом признаками развития микроорганизмов и предназначенные для одновременного выявления ботулинических токсинов и С. botulinum или только ботулинических токсинов.

 2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ И РАСТВОРЫ

2.1. Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы, реактивы и растворы по ГОСТ 10444.1-84, а также аппаратуру, материалы, реактивы и растворы, указанные ниже:

анаэростат;

аппарат для встряхивания;

баллоны с газами (азот, водород, гелий или смесью: азот 80%, углекислый газ - 10%, водород - 10%);

весы аналитические;

грушу резиновую;

доски для сушки посуды;

ерши для мойки посуды;

корзинки проволочные луженые для стерилизации;

микроскоп биологический с приспособлением для фазовоконтрастного микроскопирования;

микропипетки;

пестик для фарфоровой ступки;

петли бактериологические;

пипетки пастеровские;

пробирки центрифужные вместимостью 10-100 см

;

размельчитель тканей лабораторный;

редукторы к баллонам с газом;

стекла предметные по ГОСТ 9284-75;

стекла покровные по ГОСТ 6672-75;

фильтры асбестовые, керамические, мембранные;

флаконы вместимостью 100-500 см

;

футляры металлические для стерилизации пипеток, чашек Петри, шприцев;

штативы для пипеток;

штативы для пробирок;

бумагу индикаторную;

дуршлаг;

масло иммерсионное;

перчатки резиновые;

фильтр тканевый;

мышей белых массой 15-20 г одного пола;

бриллиантовый зеленый, раствор: 0,5-1,0 г бриллиантового зеленого растворяют в 100 см

этилового спирта. Применяют для метки белых мышей;

кальций углекислый стерильный готовят по ГОСТ 10444.1-84. Добавление углекислого кальция к средам с глюкозой способствует образованию спор С. botulinum;

кислоту аскорбиновую, раствор массовой концентрацией 50 г/дм

: 5 г аскорбиновой кислоты переносят в мерную колбу вместимостью 100 см

, доводят объем дистиллированной водой до метки, растворяют и стерилизуют фильтрованием, используя фильтры со средним диаметром пор 0,40-0,45 мкм. Раствор следует применять свежеприготовленным. Допускается использовать без стерилизации раствор аскорбиновой кислоты для инъекций. Применяют в качестве восстановителя, связывающего кислород в питательных средах для С. botulinum;

кислоту молочную,

-форма по ГОСТ 490-2006;

кислоту пикриновую, раствор: 2,5 пикриновой кислоты растворяют в 100 см

воды при нагревании. Применяют для метки белых мышей;

кислоту соляную по ГОСТ 3118-77, раствор с массовой долей соляной кислоты 4%. Применяют для подкисления питательных сред;

масло вазелиновое по ГОСТ 3164-78 или подсолнечное по ГОСТ 1129-93*; масло вазелиновое разливают в колбы по 20-50 см

и стерилизуют горячим воздухом в стерилизаторе в течение 60 мин при температуре 140 °С; масло подсолнечное прокаливают при температуре (160±1) °С горячим воздухом в стерилизаторе в течение 2 ч, охлаждают, фасуют в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 30 мин;

________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52465-2005.

мальтозу;

малахитовый зеленый;

медь сернокислую по ГОСТ 4165-78, 1%-ный раствор. Применяют для постановки биуретовой реакции в питательных средах;

натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, раствор с массовой долей гидроокиси натрия 4%. Применяют для подщелачивания питательных сред;

натрий углекислый по ГОСТ 83-79, 0,3-1%-ный раствор. Применяют для кипячения игл для шприцев (см. приложение 3);

натрия тиогликолят;

неомицин;

перекись водорода по ГОСТ 177-88, раствор с массовой долей перекиси водорода 3%;

растворы фосфатного буфера:

для приготовления фосфатного буфера готовят растворы:

А - раствор однозамещенного фосфорнокислого калия (KН

РО

- квалификации х.ч., дважды перекристаллизованный или для рН-метрии) массовой концентрацией 9,078 г/дм

;

Б - раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na

HPO

·2H

O квалификации х.ч., дважды перекристаллизованный) массовой концентрацией 11,876 г/дм

;

для приготовления 100 см

фосфатного буфера:

pH 6,0 - к 12 см

раствора Б добавляют 88 см

раствора А;

рН 6,2 - к 18,5 см

раствора Б добавляют 81,5 см

раствора А;

рН 6,8 - к 50 см

раствора Б добавляют 50 см

раствора А;

раствор фосфатного буфера

рН 6,0 применяют для растворения трипсина;

растворы желатино-фосфатного буфера:

в 100 см

фосфатного буферного раствора с определенным значением рН вносят 0,6 г желатина, дают набухнуть желатину и нагревают до полного растворения желатина. Стерилизуют при температуре (110±1) °С в течение 15 мин;

раствор желатино-фосфатного буфера

рН 6,2 применяют в качестве стабилизатора ботулинических токсинов. В случае выявления ботулинического токсина типа А переходят на раствор желатино-фосфатного буфера

рН 6,8;

смесь реактивов для создания анаэробных условий готовят по ГОСТ 10444.1-84. Допускается использование талька вместо инфузорной земли;

трипсин, раствор: 1,5 г трипсина растворяют в 100 см

раствора фосфатного буфера

рН 6,0. Раствор трипсина стерилизуют фильтрованием через керамический или мембранный фильтр с размерами пор 0,40-0,45 мкм или другой эквивалентный фильтр. Стерильный раствор трипсина вносят в регенерированную и охлажденную питательную среду асептически непосредственно перед использованием из расчета 1 см

раствора трипсина на 15 см

среды. Применяют для активизации протоксина С. botulinum;

гидролизат казеина ферментативный;

фломастеры (применяют для метки мышей);

циклосерин;

эмульсию яично-желточную: свежие куриные яйца моют, ополаскивают холодной водой, опускают в 70%-ный спирт и высушивают. Разбивают каждое яйцо, соблюдая правила асептики, в стерильную чашку Петри и отделяют желток от белка. Помещают желтки в стерильную колбу или флакон с четырьмя объемами стерильной воды и энергично перемешивают. Нагревают смесь на водяной бане при температуре (45±0,5) °С в течение 2 ч, оставляют на 18-24 ч при температуре от 0 до плюс 5 °С для того, чтобы сформировался осадок.

С соблюдением правил асептики собирают эмульсию над осадком. Эмульсию хранят при температуре 0 - плюс 5 °С не более 72 ч. Применяют для определения способности С. botulinum давать положительную реакцию с яичным желтком.

 3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

3.1. При приготовлении питательных сред для выявления и культивирования С. botulinum жидкие и полужидкие среды разливают во флаконы или в пробирки таким образом, чтобы высота столбика среды составляла не менее 10 см, объем среды - 30-100 см

.

Если нет специальных указаний по хранению среды, то среду хранят в темноте при температуре (4±2) °С не более 1 мес. Сухие среды, в состав которых входят тиогликолят натрия и цистеина гидрохлорид, хранят в герметичной упаковке при температуре (4±2) °С. Приготовленные из них жидкие и полужидкие среды хранят при комнатной температуре не более 7 сут.

3.2. Для выявления и выделения С. botulinum используют следующие среды.

3.2.1. Агар желточный для анаэробов: к 1000 см

дистиллированной воды добавляют 25,0 см

дрожжевого экстракта, 5,0 г триптона или ферментативного гидролизата казеина, 20,0 г пептона, 5,0 г хлористого натрия и 20,0 г агара. Среду нагревают на кипящей водяной бане до расплавления агара, устанавливают рН (6,9±0,1), разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин. Хранят при температуре (4±2) °С не более 28 сут.

Яично-желточную эмульсию добавляют к расплавленной и охлажденной до 50 °С среде из расчета 80 см

яично-желточной эмульсии на 1000 см

среды, тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри. Чашки хранят при температуре (4±2) °С не более 2 сут, перед использованием подсушивают по ГОСТ 26670-91. Применяют для определения способности С. botulinum давать положительную реакцию с яичным желтком.

3.2.2. Агар печеночно-желточный; агар печеночный готовят по ГОСТ 10444.1-84.

Яично-желточную эмульсию добавляют к расплавленному и охлажденному до 50 °С печеночному агару из расчета 80 см

желточной эмульсии на 1000 см

агара, тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри. Чашки хранят при температуре (4±2) °С не более 2 сут, перед использованием подсушивают по ГОСТ 26670-91.

При отсутствии печеночного агара допускается заменять его мясо-пептонным агаром.

Применяют для определения способности С. botulinum давать положительную реакцию с яичным желтком.

3.2.3. Агар мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1-84.

3.2.4. Агар сахарный кровяной по Цейсслеру готовят по ГОСТ 10444.1-84.

Применяют при определении гемолитической активности С.botulinum.

3.2.5. Бульон триптиказо-пептонно-глюкозный с дрожжевым экстрактом (ТРGУ) и с трипсином (ТРGУТ): 50,0 г триптического перевара казеина, 5,0 г пептона, 100,0 см

дрожжевого экстракта, 4,0 г глюкозы и 1,0 г тиогликолята натрия добавляют к 900 см

дистиллированной воды, устанавливают рН (7,1±0,1). Стерилизуют при температуре (121±1) °С пробирки в течение 10 мин, флаконы - в течение 15 мин. Хранят при комнатной температуре не более 7 сут.

Для культивирования С. botulinum, образующих протоксин, перед употреблением к 1000 см

бульона добавляют 60 см

1,5%-ного раствора трипсина в фосфатном буферном растворе.

3.2.6. Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1-84.

Применяют для культивирования С. botulinum.

3.2.7. Среду из вареного мяса (Cook-Meat Medium) готовят по ГОСТ 10444.1-84.

Применяют для выделения и культивирования С. botulinum.

3.2.8. Среду Китт-Тароцци с углекислым кальцием готовят по ГОСТ 10444.1-84.

Применяют для выявления и культивирования С. botulinum.

3.2.9. Среду печеночно-глицериновую готовят по ГОСТ 10444.1-84.

Применяют для культивирования С. botulinum.

3.2.10. Среду питательную для контроля стерильности, сухую.

В состав среды входят:

фермент активный гидролизат казеина неглубокой степени расщепления - 15,0 г;

витаминный препарат экстракта кормовых дрожжей 5,0 г;

натрий хлористый - 6,4 г;

глюкоза - 5,0 г;

тиогликолят натрия - 0,3 г;

цистеина гидрохлорид - 0,75 г;

агар - 0,6 г;

натрий углекислый - 0,5-0,95 г;

33,0 г сухого порошка растворяют в 1000 см

воды, тщательно размешивают, доводят до кипения, кипятят 2-3 мин при помешивании, фильтруют, разливают во флаконы. Стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин. Готовая среда должна иметь рН (7,0±0,2).

Среду хранят при комнатной температуре не более 7 сут.

Применяют для культивирования С. botulinum.

3.2.11. Улучшенную клостридиальную среду (R. С. М.) готовят по ГОСТ 10444.1-84.

Применяют для культивирования С.botulinum.

3.2.12. Бульон с кониной и мальтозой: к 1000 см

воды добавляют 500 г конины, кипятят в водяной бане в течение 1 ч, фильтруют, в фильтрат добавляют 30,0 г ферментативного пептона, 2,32 г двузамещенного фосфата натрия, 10,0 г мальтозы. Смесь кипятят на водяной бане в течение 30 мин, устанавливают рН (7,6±0,2), фильтруют, разливают по 10 см

в пробирки, после чего в каждую пробирку вводят 1-1,5 г вареной и измельченной конины. Пробирки стерилизуют в течение 15 мин при температуре (121±1) °С.

Применяют для культивирования С. botulinum.

3.2.13. Питательный агар с кровью и глюкозой: к 1000 см

деионированной воды добавляют 17,0 г ферментативного пептона, 15 см

дрожжевого экстракта, 5,0 г натрия хлористого, (17,0±3,0) г агара, 20,0 г глюкозы, устанавливают рН (7,2±0,2), стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин. После стерилизации и охлаждения до 50 °С добавляют 200 см

крови. Допускается добавление в среду неомицина до конечной концентрации 50 мг/см

или циклосерина до 400 мг/см

.

Применяют для выделения С. botulinum.

3.2.14. Питательный агар с яичным желтком и лактозой: к 1000 см

деионированной воды добавляют 17,0* ферментативного пептона, 15 см

дрожжевого экстракта, 5,0 г натрия хлористого, (17,0±3,0) г агара, устанавливают рН (7,2±0,2), стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин. В стерильную расплавленную среду добавляют 20,0 г лактозы, смесь прогревают в течение 30 мин в водяной бане в кипящей воде. После охлаждения до 50 °С добавляют асептически 10 см

0,4%-ного раствора бромкрезолпурпура и 100 см

эмульсии яичного желтка.

Применяют для выделения С. botulinum.

 4. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

4.1. Подготовка продукта к испытанию на наличие ботулинических токсинов

4.1.1. Для выявления ботулинических токсинов отбирают 100 см

/г жидкого продукта, культуральной жидкости анаэробных посевов, жидкую фракцию продуктов смешанного состава, водные экстракты или экстракты, приготовленные с физиологическим раствором пастообразных, сыпучих продуктов и продуктов твердой консистенции. Объем приготовленной исходной жидкости должен составлять около 30 см

. Оставшееся количество исходной жидкости используют, при необходимости, для повторного испытания.

При отсутствии продукта в достаточном количестве выявляют ботулинические токсины в исходной жидкости меньшего объема.

Экстракты из сыпучих и твердых продуктов, нерастворимых в воде, получают из соленых продуктов (содержащих более 2% NaCl) при добавлении дистиллированной воды в соотношении 1:1 или 1:2, из несоленых и предварительно восстановленных продуктов тепловой и сублимационной сушки - при добавлении такого же количества физиологического раствора.

Предварительно измельченный ножом или ножницами продукт переносят в стерильную ступку, добавляют при необходимости стерильный песок или стерильную стеклянную крошку и доводят до однородной консистенции, постоянно добавляя воду или физиологический раствор. Смесь переносят в стерильную колбу.

Водорастворимые или пастообразные продукты смешивают с водой или физиологическим раствором в соотношении 1:1 или 1:2 в стерильной колбе.

Полученные смеси выдерживают при температуре (4±2) °С в течение 2 ч и затем извлекают из них жидкую фракцию.

Прогрев и ротационную гомогенизацию продукта для выявления ботулинических токсинов не проводят; продукт измельчают в ступке.

Жидкую фракцию отделяют от продукта отстаиванием и (или) фильтруют через ватно-марлевый или другой фильтр, не адсорбирующий ботулинические токсины, или центрифугируют при температуре (4±2) °С и частоте вращения 500 с

в течение 1-2 мин. Использование асбестовых фильтров или фильтровальной бумаги не допускается. Подготовленную таким образом исходную жидкость переносят в стерильную колбу; хранят при температуре (4±2) °С не более 7 сут.

4.2. Подготовка продукта к испытанию для выявления и выделения С.botulinum

4.2.1. Для выявления и выделения С. botulinum отбирают 100 см

/г продукта из различных мест, имеющих и не имеющих изменения; гомогенизируют по ГОСТ 26669-85 или доводят до однородной консистенции. Допускается для посева использовать продукт, оставшийся после отделения или экстрагирования из него жидкой фазы.

Для выявления в любых продуктах вегетативных клеток и спор С. botulinum приготавливают не менее четырех навесок массой 20,0-25,0 г (см

) любого продукта.

 5. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

5.1. Выявление ботулинических токсинов

5.1.1. Выявление ботулинических токсинов проводят по табл.1 или одновременно с использованием противоботулинических антитоксических сывороток по табл.2. Исследования проводят с исходной жидкостью (ИЖ), если в ней ботулинический токсин не обнаружен, то ИЖ обрабатывают протеолитическим ферментом.

Таблица 1

Постановка исследований по обнаружению ботулинического токсина и определению титра токсина в исходной жидкости

Цель исследования	Объем ИЖ, см	Минимально выявляемое количество токсина в MLD ИЖ или ИЖТ, см	Способ подготовки Ж для инъекции	Объем Ж для инъек- ции двум мышам, см	Коли- чество шпри- цев, шт.	Порядок исследования
Обнаружение ботулинических токсинов	1	Токсин инактивирован	ИЖ прогретая	0,5x2	1	Вначале ставят биологическую пробу с прогретой ИЖ, затем с ИЖ и в последнюю очередь с ИЖТ
	1	2	ИЖ	0,5x2	1
	1	2	ИЖТ	0,5x2	1
	0,5	4	0,5 ИЖ+0,5 ЖФБ	0,5x2	1	При неспецифических симптомах гибели животных в предыдущих вариантах
	0,1	20	0,1 ИЖ+0,9 ЖФБ	0,5x2	1
	2	1	Увеличенный объем ИЖ	1,0x2	1	При слабо выраженных симптомах ботулинической интоксикации
	2	1	Увеличенный объем ИЖТ	1,0x2	1
Определение титра ботулинического токсина	1·10	200	1 ИЖ (ИЖТ)+99 ЖФБ	0,5x2	1	Биологическую пробу с ИЖ или ИЖТ начинают с наибольшего разведения
	1·10	20	1 ИЖ (ИЖТ)+9 ЖФБ	0,5x2	1
	0,5	4	1 ИЖ (ИЖТ)+1 ЖФБ	0,5x2	1
	1·10	200000	1 ИЖ (ИЖТ)+99999 ЖФБ	0,5x2	1	Биологическую пробу с ИЖ или ИЖТ начинают с наибольшего разведения
	1·10	20000	1 ИЖ (ИЖТ) +9999 ЖФБ	0,5x2	1
	1·10	2000	1 ИЖ (ИЖТ)+999 ЖФБ	0,5x2	1

Примечания:

1. ИЖ - исходная жидкость; Ж - жидкость, подготовленная соответствующим способом из ИЖ или ИЖТ для введения каждой из двух белых мышей; ИЖТ - исходная жидкость, обработанная протеолитическим ферментом; ЖФБ - буферный желатино-фосфатный раствор. Если предполагается наличие токсина С. botulinum E, то разведения более 1 ИЖТ + 999 ЖФБ не готовят.

2. Допускается титр ботулинического токсина не определять.

Таблица 2

Постановка исследований по обнаружению и типированию ботулинических токсинов

________________

* При перекрестной реакции с сывороткой типа Е.

Для выявления ботулинических токсинов по табл.1 используют исходную жидкость. В две пробирки пипеткой с резиновой грушей переносят по 2-3 см

, а в третью - 2,7 см

исходной жидкости. В последнюю пробирку стерильной пипеткой добавляют 0,3 см

раствора трипсина или панкреатина. В смеси исходной жидкости с ферментом с помощью раствора гидроокиси натрия или раствора соляной кислоты устанавливают рН (6,0±1). Затем пробирку со смесью термостатируют при (37±1) °С в течение 1 ч, но не дольше, периодически перемешивая содержимое. Культуральную жидкость, полученную из посевов продуктов в питательную среду, содержащую трипсин или панкреатин, протеолитическим ферментом не обрабатывают.