ГОСТ 17.1.4.02-90 Вода. Методика спектрофотометрического определения хлорофилла а.
ГОСТ 17.1.4.02-90
Группа Т32
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ВОДА
ОКСТУ 2209
Дата введения 1991-01-01
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Институтом океанологии АН СССР, соисполнитель - Гидрохимический институт Госкомгидромета СССР
РАЗРАБОТЧИКИ
М.Е.Виноградов, член-корр. АН СССР; Б.В.Коновалов, канд. биол. наук (руководители темы); В.А.Кимстач, д-р хим. наук; А.А.Назарова, канд. хим. наук; Т.О.Гончарова, канд. хим. наук
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по охране природы от 03.07.90 N 28
3. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
|
|
Обозначение НТД, на который дана ссылка | Номер раздела, пункта |
11 | |
12 | |
12 | |
2 | |
5.10 | |
4.2 | |
4.4 | |
4.1 | |
4.5 | |
4.6 | |
4.3 | |
5.4 | |
5.9 | |
ИСО 5667-2-83 | 2 |
5. ПЕРЕИЗДАНИЕ. Июль 1999 г.
ВВЕДЕНИЕ
1. НАЗНАЧЕНИЕ И ОБЛАСТЬ РАСПРОСТРАНЕНИЯ
1.2. Методика предназначена для органов государственного контроля за состоянием водных объектов, ведомственных научно-исследовательских экологических и промысловых работ.
1.6. Продолжительность анализа одной пробы от момента ее отбора до окончания спектрофотометрирования без учета времени хранения пробы, фильтра с осадком и экстракта не должна превышать 3 ч.
2. ССЫЛКИ НА СТАНДАРТЫ, СОВМЕСТНО С КОТОРЫМИ ДОЛЖЕН ПРИМЕНЯТЬСЯ НАСТОЯЩИЙ СТАНДАРТ
ГОСТ 17.1.5.04 Охрана природы. Гидросфера. Приборы и устройства для отбора, первичной обработки и хранения проб природных вод. Общие технические условия.
ИСО 5667-2* Качество воды. Отбор проб. Часть 2. Руководство по методам отбора проб.
3. СУЩНОСТЬ МЕТОДА
Для приготовления экстракта пробу воды фильтруют через мембранный фильтр с нанесенным на нем слоем углекислого бария или магния, осадок размельчают (гомогенизируют), пигменты экстрагируют водным ацетоном из гомогената и удаляют центрифугированием из экстракта светорассеивающую взвесь.
4. РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
4.1. Силикагель по ГОСТ 3956.
4.2. Ацетон ч.д.а. по ГОСТ 2603.
4.3. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
4.4. Кислота соляная х.ч. по ГОСТ 3118.
4.5. Барий углекислый ч.д.а. по ГОСТ 4158.
4.6. Магний углекислый основной ч.д.а. по ГОСТ 6419.
4.7. Бумага фильтровальная - по нормативно-технической документации (НТД).
4.8. Фильтры мембранные размерами пор 0,6-0,9 мкм: отечественного производства "Владипор" типа МФА-МА NN 6-9 (0,6-0,9 мкм) (см. приложение 1, п.2) или типа МФЦ N 4 (0,6 мкм) по НТД; производства зарубежных фирм Synpor N 4 (0,85 мкм) или N 5 (0,6 мкм), Millipore НА, Whatman GF/F.
5. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ И ОБОРУДОВАНИЕ
5.1. Спектрофотометр. Выделяемый спектральный интервал должен быть не более 2-3 нм, точность установки длин волн в диапазоне 430-750 нм не ниже ±2 нм, погрешность измерений по шкале оптических плотностей не более 0,01 Б. Например, спектрофотометры: двухлучевой типа СФ-18 или однолучевой типа СФ-46 по НТД.
5.3. Установка фильтровальная с воронками под фильтры мембранные диаметром от 35 до 142 мм (см. приложения 3 и 4).
5.5. Насос вакуумный, типа НВР-1 или ЗНВР-1Д, или отсасыватель хирургический ОХ-10 по НТД.
5.6. Батометр (см. приложение 1, п.1).
5.8. Ведро полиэтиленовое или эмалированное.
5.9. Эксикатор диаметром 140, 190 или 250 мм по ГОСТ 25336.
6. ПОДГОТОВКА РЕАКТИВОВ И ФИЛЬТРОВ
6.2. Мембранные фильтры готовят в зависимости от типа материала фильтра. Некоторые типы фильтров выпускают готовыми к использованию (например, стекловолокнистые фильтры типа GF/F), другие требуют предварительного вымачивания или даже кипячения в воде. Например фильтры типа Synpor необходимо трижды прокипятить по 10-15 мин в свежих порциях дистиллированной воды. После кипячения следует провести выбраковку деформированных фильтров. Готовые фильтры хранят в сухом состоянии.
7. ФИЛЬТРОВАНИЕ ПРОБ ВОДЫ И ХРАНЕНИЕ ФИЛЬТРОВ
Из этих же соображений выбирается объем пробы грунта или льда при анализе микрофитобентоса или ледовой микрофлоры.
7.2. После отбора пробу необходимо немедленно профильтровать. При отсутствии такой возможности допускается хранить ее в холодильнике при температуре от 2 до 6 °С. Максимально допустимая продолжительность хранения с момента отбора - не более 2-3 ч. После хранения, перед началом фильтрования, пробу необходимо осторожно перемешать. К материалу емкости для хранения пробы предъявляются те же требования, что и к материалу для изготовления устройства для отбора пробы (см. приложение 1).
После окончания фильтрования для подсушки фильтра следует поддержать перепад давления в течение еще 5-10 с.
7.5. Продолжительность фильтрования не должна превышать 40-60 мин.
7.6. Сразу же после фильтрования необходимо подсушить фильтр с помощью фильтровальной бумаги, подкладывая ее в несколько слоев под фильтр и меняя 2-3 раза в течение 10-15 мин. Затем осадок с фильтра снять и перенести в гомогенизатор.
При невозможности начать гомогенизацию и экстрагирование необходимо немедленно фильтр с осадком тщательно высушить, поместив его в эксикатор с силикагелем, и хранить в холодильнике при температуре минус 10-0 °С. Во избежание потерь вследствие рассыпания осадка с фильтров при их хранении и транспортировке допускается хранить фильтры свернутыми пополам осадком внутрь.
7.7. Срок хранения должен быть по возможности сокращен и не превышать 1 мес (в морозильной камере при температуре ниже минус 20 °С - до 3 мес).
8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
При анализе фитопланктона, богатого зелеными и сине-зелеными водорослями с толстыми оболочками или слизью, для повышения полноты гомогенизации при растирании допускается добавить кварцевый песок или толченое стекло марки "пирекс".
Взвесь, осажденную на фильтр из стекловолокна, допускается гомогенизировать вместе с фильтром. В этом случае следует использовать гомогенизатор со сферическими рабочими поверхностями.
Кроме механического растирания допускаются другие способы гомогенизации, например с помощью ультразвука. При этом способе необходимо следить за отсутствием чрезмерного, выше 40 °С, нагрева обрабатываемой взвеси.
Высокая степень гомогенизации достигается также продавливанием замороженной взвеси под большим давлением через узкое отверстие (фильеру).
После центрифугирования экстракт следует перенести в стеклянную мерную пробирку, при необходимости добавляя 90%-ный ацетон, довести его объем до объема фотометрической кюветы и закрыть пробирку притертой пробкой (см. приложение 2, табл.5).
Подготовленный к фотометрированию экстракт допускается хранить в холодильнике при температуре 0-5 °С не более 1 сут.
8.3. Спектрофотометрирование и подкисление экстракта. При спектрофотометрировании используются кюветы с рабочей длиной от 0,5 до 5 см в зависимости от объема экстракта и его оптической плотности. Последняя должна находиться в диапазоне 0,05-0,8 Б.
Отсчеты оптических плотностей берутся на четырех длинах волн - 664, 647, 630 и 750 нм. Фотометрирование проводят дважды: до и после подкисления экстракта несколькими каплями приготовленного раствора соляной кислоты в ацетоне.
При фотометрировании подкисленного экстракта отсчеты берутся на двух длинах волн - 664 и 750 нм.
9. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
При доминировании диатомовых, перидиней, золотистых и разножгутиковых - по формуле
9.3. Пигментный индекс в экстракте вычисляют по формуле
9.4. Все оптические плотности, входящие в формулы (1)-(8), берутся с учетом поправки, которая равна оптической плотности на длине волны 750 нм. Эта поправка вычитается из значения измеренной оптической плотности.
За результат определений принимают единичный результат для каждой пробы.
10. ПОГРЕШНОСТЬ ОПРЕДЕЛЕНИЙ
Таблица 1
|
|
|
Концентрация хлорофилла в пробе воды, мкг·дм | Ориентировочная концентрация хлорофилла в экстракте, мкг·см | Погрешность  , % |
<0,02 | <0,25 | 100 |
0,02-0,07 | 0,25-0,5 | 50 |
0,07-0,2 | 0,5-1,5 | 30 |
0,2-0,7 | 1,5-2,5 | 20 |
>0,7 | >2,5 | 10 |
11. РЕГУЛЯРНЫЙ КОНТРОЛЬ ПОГРЕШНОСТИ ТЕКУЩИХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ
Строгое соблюдение требований настоящего стандарта обеспечивает исключение всех составляющих погрешности, кроме тех, которые возникают при фотометрировании экстракта. Поэтому для обеспечения текущих определений с регламентированной погрешностью наряду с соблюдением требований, установленных методикой, следует регулярно контролировать погрешность, возникающую при спектрофотометрировании.
С этой целью в соответствии с требованиями ГОСТ 8.513* необходимо ежегодно проводить обязательную государственную поверку спектрофотометра. Кроме того, перед каждой серией текущих определений, но не реже одного раза в месяц следует оценивать погрешность определений оптической плотности и установки шкалы длин волн путем сравнения спектров контрольных светофильтров, входящих в комплект прибора, с их спектрами, указанными в паспорте.
_________________
* На территории Российской Федерации действуют ПР 50.2.006-94.
12. ТРЕБОВАНИЯ К ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ОТХОДОВ АНАЛИЗА, К БЕЗОПАСНОСТИ И КВАЛИФИКАЦИИ ОПЕРАТОРА
Слив отходов анализа в канализацию допускается после их предварительного разбавления не менее чем в 100 раз.
В процессе анализа требуется соблюдение мер предосторожности, регламентируемых при работе с вредными веществами (для ацетона, соляной кислоты и углекислого бария) по ГОСТ 12.1.005 и ГОСТ 12.1.007.
Лица, допускаемые к выполнению измерений, должны обладать опытом проведения типовых биохимических анализов, а также навыками обращения со спектрофотометрами.
13. ФОРМА ОТЧЕТА О ПРОВЕДЕННОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ
В отчете должна быть следующая информация:
место, время и устройство отбора проб;
результаты должны быть выражены в соответствии с разд.9;
любые отклонения от данной методики и другие обстоятельства, которые могут повлиять на результаты определений;
ссылка на настоящий стандарт.
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Справочное
БАТОМЕТРЫ И ФИЛЬТРЫ
1. Устройства для отбора проб
Устройствами для отбора проб могут служить:
батометр, срабатывающий от посыльного грузика или электрического импульса на заданной глубине;
батометр для отбора "интегральной" пробы, снабженный устройством для обеспечения равномерного поступления воды при равномерном движении батометра в слое отбора;
шланг (с насосом или без насоса);
ведро (для отбора проб с поверхности).
Материал для изготовления рабочих емкостей устройств для отбора, с которыми непосредственно контактирует отобранная проба, должен быть непрозрачным, нетоксичным, коррозийно-стойким. Оптимально удовлетворяет этим требованиям черный полиэтилен. Для батометра допускается винипласт, оргстекло, другие пластмассы, стекло. При этом прозрачные материалы должны иметь снаружи непрозрачное покрытие. Перед началом работ устройство для отбора необходимо в течение нескольких дней выдержать в воде и тщательно отмыть.
Для изготовления батометров можно воспользоваться конструкторскими разработками, осуществленными в ОКБ океанологической техники Института океанологии АН СССР (см. табл.2). Вместимость и марки батометров указаны в табл.2.
Таблица 2
|
|
|
|
Вместимость батометра, дм | Марка батометра по спецификации ОКБ ОТ ИО АН СССР | Вместимость батометра, дм | Марка батометра по спецификации ОКБ ОТ ИО АН СССР |
1 | БП-1-63 | 10 | БМ  -00-00 |
2,5 | ОА-07.00.00.00 | 30 | БМ  -00-00 |
2,5 | 2БМ  -00-00 | 130 | 2А.011.00.00.00 |
7 | Б4-С7-65 | 150 | 0А.285.00.00.00 |
Для защиты этих батометров от коррозии рекомендуется двухразовое покрытие их внутренней поверхности лаком марки ЭДН-1 по нормативно-технической документации или аналогичным.
2. Размеры мембранных фильтров отечественного производства (мембраны "ВЛАДИПОР" типа МФА-МА ПО "ТАСМА") указаны в табл.3.
Таблица 3
|
|
|
|
Диаметр диска, мм | Минимальный объем партии, шт. | Диаметр диска, мм | Минимальный объем партии, шт. |
35  | 10000 | 90  | 1500 |
47 | 6000 | 142  | 500 |
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
Справочное
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЪЕМОВ ПРОБ
Таблица 4
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Концентрация хлорофилла в пробе, мг·м |
0,05 |
0,1 |
0,5 |
1 |
5 |
10 |
50 |
100 |
Объем пробы, дм | Более 40 | 20-50 и более | 5-50 | 2-20 | 0,4-4 | 0,2-2 | 0,04-0,4 | 0,02-0,2 |
Таблица 5
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Количество хлорофилла в экстракте, мкг |
2 |
5 |
10 |
20 | ||||||||
, см | 1 | 2 | 5 | 1 | 2 | 5 | 1 | 2 | 5 | 1 | 2 | 5 |
, см | 4 | 8 | 20 | 4 | 8 | 20 | 4 | 8 | 20 | 4 | 8 | 20 |
, мкг·cм | 0,5 | 0,25 | 0,1 | 1,25 | 0,625 | 0,25 | 2,5 | 1,25 | 0,5 | 5 | 2,5 | 1 |
, Б
| 0,05 | 0,125 | 0,25 | 0,5 | ||||||||
ПРИЛОЖЕНИЕ 3
Рекомендуемое
Схема фильтровальной установки для фильтрования самотеком в полевых условиях
1 - воронка фильтровальная (например, В-67, разработка ОКБ ОТ ИО АН СССР, см. приложение 1); 2 - трубка полиэтиленовая; 3 - канистра полиэтиленовая; 4 - штатив для воронок; 5 - полка для канистр
Черт.1
ПРИЛОЖЕНИЕ 4
Рекомендуемое
Схема установки для получения сжатого воздуха, используемого при завершении фильтрования самотеком или при фильтровании проб малого объема в полевых условиях
1 - сжатый воздух; 2 - пробка; 3 - канистра; 4 - вода; 5 - трубка; 6 - зажим; 7 - анализируемая проба; 8 - воронка фильтровальная
Черт.2
Примечания:
1. Предпочтительнее использовать дюралевые канистры, однако при небольшом давлении (до 0,15-0,2 атм) пригодны канистры из твердого полиэтилена.
2. Для получения запаса сжатого воздуха в нижней канистре следует:
а) собрать установку по схеме, изображенной на черт.2, заполнить верхнюю канистру водой до уровня, не доходящего до пробки на несколько сантиметров;
б) разжать верхний зажим и зажать нижний;
в) наклонить верхнюю канистру так, чтобы вода начала поступать по трубке в нижнюю, после чего возвратить ее в нормальное положение;
г) после перетекания воды в нижнюю канистру в ней образуется запас сжатого воздуха, давление в котором будет определяться разностью уровней воды в канистрах - Н.
3. Для создания давления можно использовать любую чистую воду (фильтрованную или водопроводную) в дюралевых канистрах - желательно пресную.
ПРИЛОЖЕНИЕ 5
Рекомендуемое
Схема гомогенизатора
1 - пестик; 2 - ступица
Черт.3
