ГОСТ Р 51196-98 Молоко сухое. Метод определения молочной кислоты и лактатов.

     ГОСТ Р 51196-98

(ИСО 8069-86)

Группа Н19

 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 МОЛОКО СУХОЕ

 Метод определения молочной кислоты и лактатов

 Dried milk.

Method for determination of lactic acid and lactates

ОКС 67.100.10

ОКСТУ 9209

Дата введения 2000-01-01

 Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Московской государственной академией пищевых производств

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 28 августа 1998 г. N 334

3 Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 8069-86 "Сухое молоко. Определение содержания молочной кислоты и лактатов. Ферментативный метод" с дополнительными требованиями, отражающими потребности экономики страны (2, 3 и 7.1)

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ

      1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на сухое молоко всех видов и устанавливает метод определения молочной кислоты и ее солей - лактатов.

      2 Нормативные ссылки

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

      3 Определение

Массовая доля молочной кислоты и лактатов в сухом молоке, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в граммах молочной кислоты на 100 г сухого обезжиренного вещества.

      4 Сущность метода

Восстанавливают пробу сухого молока в теплой воде, осаждают жиры и белки и фильтруют пробу. Полученный фильтрат обрабатывают ферментами и биохимическими реагентами, добавляемыми одновременно, но действующими последовательно:

-

-лактатдегидрогеназа

и

-лактатдегидрогеназа

в присутствии никотина-мидадениндинуклеотида

окисляют лактат до пирувата, восстанавливая

до

:

;

- глутаматпируваттрансфераза

в присутствии

-глутамата преобразует пируват в

-аланин и

-глутамат в альфа-кетоглутарат:

.

Измеряют массовую долю образовавшегося

, эквивалентную массовой доле молочной кислоты и лактатов в пробе, на спектрофотометре при длине волны 340 нм.

      5 Реактивы

Все реактивы должны быть аналитического качества (не ниже х.ч.). Вода, используемая для приготовления растворов ферментов, должна быть бидистиллированной. Вода для приготовления растворов других реактивов и проб должна быть дистиллированной.

Препарат

должен содержать не менее 90% основного вещества.

5.1 Раствор гексацианоферрата (II) калия

Растворяют 35,9 г гексацианоферрата (II) калия K

[Fe(CN

)]

3Н

О в воде и доводят объем раствора до 1 дм

. Раствор перемешивают.

5.2 Раствор сульфата цинка

Растворяют 71,8 г сульфата цинка гептагидрата (ZnSO

·7H

O) в воде и доводят объем раствора до 1 дм

. Раствор перемешивают.

5.3 Раствор гидроксида натрия

(NaOH)=0,1 моль/дм

Растворяют 4,00 г гидроксида натрия (NaOH) в воде и доводят объем раствора до 1 дм

. Раствор перемешивают.

5.4 Буферный раствор активной кислотности 10,0 pH

Растворяют 7,92 г глицилглицина (С

Н

N

О

) и 1,47 г

-глутаминовой кислоты (C

H

NO

) в 80 см

воды. Устанавливают активную кислотность раствора (10,0

±0,1) pH

при 20

°

С раствором гидроксида натрия

(NaOH)=10 моль/дм

и доводят объем раствора водой до 100 см

. Раствор перемешивают.

Раствор устойчив 3 мес при температуре от 0 до

 5 °С.

5.5 Раствор

Растворяют 350 мг

(C

H

N

O

P

) в 10 см

воды.

Раствор устойчив 1 мес при температуре от 0 до 5 °С.

Во время использования сосуд с раствором должен быть погружен в емкость с колотым льдо

м.

5.6 Раствор

Растворяют 10 мг

из мускульных тканей свиньи в 1 см

раствора глицерина массовой доли 50% (активная кислотность приблизительно 7 pH).

Удельная активность раствора

должна быть не менее 5500 Е/см

при 25

°

С. Раствор устойчив 12 мес при температуре от 0 до 5

°

С.

Во время использования сосуд с раствором должен быть погружен в емкость с колотым льдом.

5.7 Суспензия

.

Смешивают 5 мг

из Lactobacillus leichmannii с 1 см

раствора сульфата аммония

((NH

)

SO

)=3,2 моль/дм

(активная кислотность приблизительно 6 pH).

Удельная активность суспензии

должна быть не менее 1500 Е/см

при 25

°

С. Суспензия устойчива 12 мес при температуре от 0 до 5

°

С. Во время использования сосуд с суспензией должен быть погружен в емкость с колотым ль

дом.

5.8 Суспензия

Суспензию

из сердца свиньи концентрации 20 мг/см

удельной активности 1600 Е/см

при 25

°

С в растворе сульфата аммония

((NH

)

SО

)=3,2 моль/дм

готовят центрифугированием 2 см

суспензии концентрации 10 мг/см

в течение 10 мин (при факторе разделения центрифуги 4000

). Отбирают 1 см

надосадочной жидкости и отбрасывают, а оставшуюся суспензию используют для анализа.

Готовая суспензия устойчива при температуре от 0 до 5 °С 12 мес. На время работы сосуд с суспензией помещают в емкость со

 льдом.

5.9 Раствор

-лактата лития

Растворяют 50 мг

-лактата лития (С

Н

О

Li) в воде и доводят объем раствора до 500 см

. Раствор перемешивают.

5.10 Раствор

-лактата лития

Растворяют 50 мг

-лактата лития (С

Н

О

Li) в воде и доводят объем раствора до 500 см

. Раствор перемешивают.

      6 Средства контроля и вспомогательные устройства

Обычная лабораторная аппаратура, в том числе указанная в 6.1-6.11.

6.1 Весы лабораторные общего назначения наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью ±0,001 г.

6.2 Стаканчик стеклянный для взвешивания или бюкса вместимостью 50 см

.

6.3 Цилиндр градуированный вместимостью 50 см

и допускаемой относительной погрешностью

±2%.

6.4 Колбы мерные вместимостью 100 см

и допускаемой относительной погрешностью

±0,2%.

6.5 Дозаторы пипеточные объемами доз 0,02; 0,05; 0,2; 1 и 2 см

и относительной погрешностью дозирования

±1%.

6.6 Пипетки градуированные вместимостью 2, 5 и 10 см

и допускаемой относительной погрешностью

±1%.

6.7 Воронка стеклянная для фильтрования диаметром 7 см.

6.8 Фильтры бумажные гофрированные диаметром 15 см, свободные от молочной кислоты и лактатов.

6.9 Палочка стеклянная.

6.10 Палочки пластиковые или иные для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.

6.11 Спектрофотометр (фотометр) со следующими техническими характеристиками: длина волны 340 нм; спектральный интервал - не более 10 нм; интервал измерений оптической плотности - от 0,000 до 2,000; погрешность установки длины волны - ±3 нм; среднее квадратическое отклонение случайной составляющей погрешности измерений - не более 0,15%.

Кюветы фотометрические толщиной поглощающего слоя 1 см.

      7 Порядок подготовки к проведению измерений

7.1 Отбор проб - по ГОСТ 26809.

7.2 Пробу хранят в условиях, предотвращающих порчу и изменение состава.

      8 Порядок проведения измерений

При проведении измерений следует избегать загрязнений, в том числе связанных с поглощением влаги или конденсацией ее на стенках сосудов.

8.1 Проверка активности реактивов

При приготовлении новой порции реактивов (5.5-5.8) и хранении готовых реактивов без использования более двух недель или изменении условий хранения проверяют активность реактивов.

8.1.1 Для проверки активности реактивов в две мерные колбы (6.4) вместимостью 100 см

вносят по 10 см

-лактата лития (5.9), в две другие мерные колбы (6.4) вместимостью 100 см

вносят по 10 см

-лактата лития (5.10). Определяют концентрации

-молочной кислоты и ее лактатов, а также концентрацию

-молочной кислоты и ее лактатов (8.5.2-8.6

).

8.1.2 Концентрации

-лактата лития,

, и

-лактата лития,

, мг/дм

, вычисляют по формулам:

;

,

где

- разность оптических плотностей, рассчитанная по 8.6.4.

8.1.3 Принимая во внимание чистоту реактивов, определенная концентрация лактата лития при проверке активности реактивов должна составлять (100±5)% концентрации приготовленных растворов.

Если определяемое значение не попадает в этот интервал, проверяют реактивы, технику измерения, точность пипеток и дозаторов, а также исправность спектрофотометра. После этого тестирование повторяют до получения удовлетворительных результатов.

8.2 Подготовка пробы

Пробу продукта помещают в контейнер вместимостью, в два раза превышающей объем пробы, с герметично закрывающейся крышкой, тщательно перемешивают, энергично встряхивая и переворачивая контейнер.

В процессе подготовки пробы необходимо исключить ее контакт с атмосферой, чтобы уменьшить абсорбцию влаги.

8.3 Масса навески

В стеклянном стаканчике (6.2) взвешивают 1,000 г пробы.

8.4 Подготовка контрольной пробы

Контрольное испытание проводят, как описано в 8.5-8.6, используя те же реактивы, но без пробы продукта. Для испытания пробы продукта (8.6) берут 1,0 см

фильтрата (8.5.3).

8.5 Приготовление раствора пробы и удаление белка

8.5.1 Навеску сухого молока (8.3) растворяют при помешивании стеклянной палочкой (6.9) в 20 см

воды температурой от 40 до 50

°

С, количественно переносят в мерную колбу (6.4) вместимостью 100 см

и охлаждают до комнатной температуры (20

°

С).

8.5.2 К раствору в колбе (8.5.1) последовательно добавляют 5,0 см

раствора гексацианоферрата (II) калия (5.1), 5,0 см

раствора сульфата цинка (5.2), 10 см

раствора гидроксида натрия (5.3), тщательно перемешивая содержимое колбы после добавления каждого компонента и доводят объем раствора водой до 100 см

. Снова тщательно перемешивают раствор и выдерживают 30 мин при комнатной температуре.

8.5.3 Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр (6.8), отбрасывая первую порцию фильтрата.

8.6 Определение

8.6.1 В спектрофотометрическую кювету (6.11) пипеточным дозатором (6.5) вносят:

- 1,0 см

фильтрата (8.5.3);

- 1,0 см

буферного раствора (5.4);

- 0,20 см

раствора

(5.5);

- 0,02 см

суспензии

(5.8).

Содержимое кюветы перемешивают палочкой (6.10).

8.6.2 Кювету выдерживают 5 мин, затем измеряют оптическую плотность раствора относительно воды при длине волны 340 нм.

В кювету добавляют 0,02 см

раствора

(5.6) и 0,05 см

раствора

(5.7). Раствор перемешивают палочкой (6.10).

Примечание - Раздельное определение

- и

-молочных кислот и их лактатов в пробе можно осуществить добавлением или

или

.

8.6.3 Раствор (8.6.2) выдерживают при комнатной температуре 45 мин и измеряют оптическую плотность. Раствор выдерживают еще 15 мин и снова измеряют оптическую плотность (измерения после 60 мин реакции).

Примечание - Если требуется определить содержание только

-молочной кислоты и ее лактатов, измерения производят соответственно через 30 и 45 мин.

8.6.4 Рассчитывают разность измеренных значений оптических плотностей по формуле

,

где

- оптическая плотность пробы через 60 мин (8.6.3);

- оптическая плотность пробы через 5 мин (8.6.2);

- оптическая плотность пробы через 45 мин (8.6.3);

- оптическая плотность контрольной пробы через 60 мин (8.6.3);

- оптическая плотность контрольной пробы через 5 мин (8.6.2);

- оптическая плотность контрольной пробы через 45 мин (8.6.3).

Примечания

1 В некоторых случаях может иметь место медленно текущая побочная реакция. Изменение оптической плотности, вызванное этой реакцией, исключают экстраполяцией оптической плотности на нулевой момент времени.

2 Если оптическую плотность измеряют через 30 и 45 мин, формула имеет вид

,

где

- оптическая плотность пробы через 30 мин (8.6.3);

- оптическая плотность контрольной пробы через 30 мин (8.6.3).

8.6.5 Если разность оптических плотностей, рассчитанная в соответствии с 8.6.4, превышает 0,500, определение повторяют (8.6.1-8.6.4), разводя дистиллированной водой растворы пробы продукта (8.5.3) и контрольной пробы (8.4).

      9 Правила обработки результатов измерений

9.1 Метод расчета

Массовую долю молочной кислоты и лактатов

в сухом молоке, выраженную в г молочной кислоты на 100 г сухого обезжиренного вещества, вычисляют по формуле

;

где

- разность оптических плотностей (8.6.4);

- молярная масса молочной кислоты,

г/моль;

- объем раствора в кювете (8.6.2), см

(для определения

- и

-молочных кислот

см

,

для определения

-молочной кислоты

см

,

для определения

-молочной кислоты

см

);

- объем подготовленного к анализу раствора (8.5.2), см

(

см

);

- объем разведенного фильтрата (8.6.5), см

(если испытание проводилось без разведения фильтрата, то

см

);

- коэффициент оптической плотности

, дм

·

ммоль

·см

, равный:

при длине волны 340 нм - 6,3,

при длине волны 365 нм - 3,5,

при длине волны 334 нм - 6,18;

- толщина поглощающего слоя в кювете, см;

- масса навески сухого молока, г (8.3);

- объем фильтрата (8.5.3) в спектрофотометрической кювете (8.6.4), см

;

- объем фильтрата (8.5.3), взятый для разведения (8.6.5), см

(если испытание проводилось без разведения фильтрата, то

см

);

- массовая доля сухого обезжиренного вещества в пробе продукта, %.

Результат определяют

 с точностью 0,001% (г/100 г).

9.2 Точность

Примечание - Сходимость и воспроизводимость были рассчитаны по результатам межлабораторных испытаний.

9.2.1 Сходимость

Абсолютное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать

, если среднее арифметическое результатов не превышает 0,060 г/100 г включительно.

Относительное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать 15% среднего арифметического значения, если оно превышает 0,060 г/100 г.

9.2.2 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение результатов двух измерений, выполненных в двух лабораториях, не должно превышать

=0,010 г/100 г, если среднее арифметическое результатов не превышает 0,100 г/100 г включительно.

Относительное расхождение результатов двух измерений, выполненных в двух лабораториях, не должно превышать 20% среднего арифметического значения, если оно превышает 0,100 г/100 г.

      10 Оформление результатов измерений

В отчете об испытании должны быть указаны:

- используемый метод;

- полученные результаты;

- любые условия проведения испытаний, не установленные данным стандартом и касающиеся подробностей, которые могут повлиять на конечный результат.

В отчете должны быть все данные, необходимые для полной идентификации пробы.