ГОСТ Р 51600-2000
Группа Н19
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МОЛОКО
Методы определения наличия антибиотиков
Milk.
Methods for determination of the antibiotics indication*
______________
* Наименование стандарта. Измененная редакция, Изм. N 1.
ОКС 67.100.10
ОКСТУ 9209
Дата введения 2001-07-01
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ГУ ВНИИВСГЭ), Институтом питания РАМН и Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности (ГУ ВНИМИ)
ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 "Молоко и молочные продукты"
2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 26 апреля 2000 года N 127-ст
3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
4 ПЕРЕИЗДАНИЕ
ВНЕСЕНЫ: Изменение N 1, утвержденное и введенное в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 09.02.2006 N 6-ст с 01.07.2007, Изменение N 2, утвержденное и введенное в действие Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст с 01.07.2008
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на натуральное коровье молоко - сырье, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое молоко (далее - молоко) и устанавливает микробиологические и рецепторные методы определения наличия антибиотиков.
(Измененная редакция, Изм. N 1, 2).
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия
ГОСТ 2493-75 Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия
ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия
ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 23454-79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ
ГОСТ 24065-80 Молоко. Методы определения соды
ГОСТ 24066-80 Молоко. Методы определения аммиака
ГОСТ 24067-80 Молоко. Метод определения перекиси водорода
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
(Измененная редакция, Изм. N 2).
3 Чашечный метод с Вас. stearothermophilus
3.1 Сущность метода
Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами тест-микроба и препятствовать его росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие любого антибиотика в молоке устанавливают по диаметру зоны ингибиции.
3.2 Аппаратура, реактивы и материалы
3.2.1 Аппаратура, реактивы и материалы по ГОСТ 9225 и указанные в 3.2.2-3.2.16.
3.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.
3.2.4 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
3.2.6 Линейка по ГОСТ 427, пределом измерения 150 мм или аппарат Микрофот 5ПО-1.
3.2.7 Пробойник диаметром 10 мм или сверло пробочное N 4.
3.2.9 Гидролизат кормовых дрожжей.
3.2.10 Диски со стрептомицином.
3.2.11 Оптический стандарт мутности ОСО 42-28-29-86.
3.2.12 Препарат СКИВ.
3.2.13 Стандарт стрептомицина РСО 9347-194-00494189-99.
3.2.14 Тест-микроб Вас. stearothermophilus BKMB-510, выпускаемый Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.
3.2.16 Экстракт дрожжевой.
Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже, а также реактивы по качеству не ниже указанных.
3.3 Отбор проб
3.3.1 Отбор проб - по ГОСТ 9225.
3.3.2 Пробы молока до испытания допускается хранить в холодильнике при температуре (5±1) °С не более 24 ч.
3.3.3 Анализу подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный - по ГОСТ 24065, ГОСТ 24066 и ГОСТ 24067.
3.4 Подготовка к анализу
3.4.1 Подготовка посуды и материалов
3.4.1.1 Всю новую посуду, предназначенную для микробиологических исследований, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты объемной доли 1-2%) в течение 15 мин, затем ополаскивают дистиллированной водой.
Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (160±5) °С в течение 2 ч или в автоклаве при (121±2) °С в течение (30±1) мин с последующим подсушиванием.
Чашки Петри, пипетки и цилиндры стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В конец пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты. Пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками и обертывают бумагой. Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.
3.4.2 Приготовление питательных сред
3.4.2.3 Для проведения анализа допускается применять питательные среды указанного в 3.4.2.1 и 3.4.2.2 состава промышленного изготовления.
3.4.3 Получение спор тест-микроба
При наличии в поле зрения 90-95% свободных сформировавшихся спор колбы с посевами помещают на 16-18 ч в холодильник для осаждения. Надосадочную жидкость из колбы сливают, а осадок разливают по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают в водяной бане при температуре внутри пробирок (67±2) °С в течение (30±1) мин. Пробирки центрифугируют 20-30 мин. Осадок отмывают стерильной дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.
Взвесь спор вторично прогревают при температуре (67±2) °С в течение (30-1)* мин. Полученную взвесь переносят в бактериологические пробирки и хранят в холодильнике не более 2 мес.
3.4.4 Приготовление засеянной агаровой среды
3.4.4.1 В пробирки отбирают взвесь спор тест-микроба по 3.4.3.1 и разводят стерильной дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по оптическому стандарту мутности.
3.4.4.3 Чашки засевают непосредственно перед употреблением.
В некоторых случаях чашки хранят в холодильнике при температуре (5±1) °С не более 2 сут. Перед использованием их прогревают в термостате при (55±1) °С в течение (20±1) мин.
3.4.5 Приготовление обезжиренного стерильного молока
Допускается использовать препарат СКИВ.
3.4.6.1 Контрольное разведение стрептомицина используют для проверки активности роста тест-микроба.
3.4.6.2 Контрольное разведение стрептомицина готовят в фосфатных буферных растворах.
Основной раствор антибиотика хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой не более 30 сут при температуре (5±1) °С.
Контрольное разведение стрептомицина используют в течение рабочего
дня.
3.4.6.4 Взамен контрольного разведения стрептомицина для проверки активности роста тест-микроба могут быть использованы диски со стрептомицином по 3.2.10.
3.4.7 Подготовка проб молока к анализу
3.5 Проведение анализа
3.5.1 Непосредственно перед исследованием молока на поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри по 3.4.4, пробойником или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм. Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки (рисунок 1) только в случае использования контрольного разведения антибиотика.
Рисунок 1 - Схема вырезания лунок в агаровой среде
3.5.3 Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение (20±1) мин, затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55±1) °С в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.
3.6 Обработка результатов
3.6.1 Результаты анализа оценивают непосредственно после инкубирования. Чашки просматривают в проходящем свете от любого источника света.
Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых испытуемым образцом молока и контрольным разведением антибиотика, измеряют линейкой или на аппарате Микрофот 5ПО-1 по краям окружностей зон.
3.6.2 При отсутствии зон ингибиции контрольного разведения стрептомицина исследования повторяют с использованием вновь приготовленных засеянных чашек по 3.4.4 и контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.
3.6.3 При отсутствии антибиотиков в молоке диаметр зоны ингибиции должен быть менее 12 мм, а при их наличии - 12 мм и более.
3.7 Метрологические характеристики
3.7.1 Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 1.
Таблица 1
|
|
Наименование антибиотика | Наименьший предел определения, Ед/г (мкг/г)* |
Бензилпенициллин | 0,005 |
Стрептомицин | 0,5-1,0 |
Тетрациклин | 0,1 |
Окситетрациклин | 0,1 |
Хлортетрациклин | 0,05 |
Эритромицин | 0,05 |
Неомицин | 0,25 |
Мономицин | 0,25 |
Левомицетин | 2,5 |
Олеандомицин | 2,5 |
________________ * 1 мкг активного вещества равен 1 Ед активности. | |
4 Метод с индикатором бромкрезолпурпуром
4.1 Сущность метода
Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Вас. stearothermophilus var. calidolactis C953 от фиолетовой до желтой при отсутствии в исследуемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении окраски - при их наличии.
4.2 Аппаратура, материалы и реактивы
4.2.1 Термостат или блок термостатируемых ячеек, позволяющий поддерживать температуру от 30 до 70 °С с допускаемыми отклонениями ±0,5 °С от заданной.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.
4.2.3, 4.2.4 (Измененная редакция, Изм. N 1).
4.2.7 Пинцет.
4.2.8 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже указанных.
(Введен дополнительно, Изм. N 1).
4.2.10, 4.2.11 (Введены дополнительно, Изм. N 2).
4.3 Отбор проб
4.3.1 Отбор проб и подготовка их к анализу - по ГОСТ 9225.
4.3.2 Допускается хранить пробы в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6±2) °С.
4.4 Подготовка к анализу
4.4.1 Подготовка к анализу ампул по 4.2.3 и бутылочек по 4.2.4
Стеклянную бутылочку с питательными таблетками вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре от 15 до 25 °С.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.4.2 Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока необходимое число ампул или пробирок (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы или пробирки хранят в холодильнике при температуре (6±2) °С.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.4.3 Отвинчивают колпачок бутылочки и помещают его на стол вниз донышком. Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают в бутылочку.
4.4.4 Подготовка к анализу ампул или пробирок - по 4.2.9 или 4.2.10.
Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока необходимое число ампул или пробирок (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы или пробирки хранят в холодильнике при температуре (6±2) °С.
(Введен дополнительно, Изм. N 1. Измененная редакция, Изм. N 2).
4.5 Проведение анализа
4.5.1 Проведение анализа с использованием ампул "Delvotest® SP", "Delvotest® SP-NT" или "Delvotest® SP MINI-NT"
4.5.1.1 Соединительной частью шприца прокалывают укупорку ампул по 4.2.3 или 4.2.9.
4.5.1.2 В каждую открытую ампулу по 4.2.3 пинцетом помещают по одной таблетке питательной среды "Delvotest® SP", взятой из колпачка бутылочки по 4.4.3. Затем бутылочку плотно закрывают колпачком и хранят при температуре (20±2) °С.
4.5.1.4 Ампулы помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0±0,5) °С в течение 3 ч.
4.5.2 Проведение анализа с использованием тестового набора "Сораn Test®"
4.5.2.2 Пробирки с анализируемым молоком закрывают фольгой и помещают в блок термостатируемых ячеек и выдерживают при температуре (64,5±0,5) °С в течение 3 ч.
4.5, 4.5.1, 4.5.1.1-4.5.1.4, 4.5.2, 4.5.2.1-4.5.2.3 (Измененная редакция, Изм. N 2).
4.6 Обработка результатов
4.6.1 Ампулы или пробирки извлекают из термостата или блока термостатируемых ячеек и определяют цвет содержимого.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.6.2 Желтый цвет содержимого ампул или пробирок с контрольным и анализируемыми образцами молока свидетельствует об отсутствии в молоке ингибирующих веществ. Фиолетовое кольцо на поверхности содержимого ампулы (размером не более 1 мм) не учитывают.
4.6.3 Фиолетовый цвет содержимого ампул или пробирок с анализируемым образцом молока свидетельствует о наличии в молоке ингибирующих веществ.
4.6.2, 4.6.3 (Измененная редакция, Изм. N 2).
4.6.4 Вывод о наличии в молоке антибиотиков делают после дополнительных исследований молока по ГОСТ 24065-ГОСТ 24067 и при получении отрицательных результатов.
4.7 Метрологические характеристики
4.7.1 Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 2.
Таблица 2
|
|
|
Наименование антибиотика | Наименьший предел определения, Ед/г (мкг/г), с использованием | |
| Сораn Test® (CH-ATK) | Delvotest® SP-NT, Delvotest® SP MINI-NT |
DH-Стрептомицин |  1,0 | - |
Амоксициллин | 0,002 | 0,003 |
Ампициллин | 0,002 | 0,003 |
Бензилпенициллин | - | 0,0025 |
Гентамицин | 0,1 | 0,400 |
Дапсон | 0,002 | - |
Дигидрострептомицин | - | 2,500 |
Диклоксациллин | 0,01 | 0,010 |
Доксициклин | 0,15 | - |
Клоксациллин | 0,01 | 0,020 |
Левомицетин (хлорам-феникол) | - | 7,500 |
Линкомицин | - | 0,300 |
Нафциллин | 0,005 | 0,010 |
Неомицин | 0,5 | 0,400 |
Оксациллин | 0,005 | 0,010 |
Окситетрациклин | 0,25 | 0,400 |
Пенициллин | 0,001 | - |
Спектиномицин |  0,3 | - |
Спирамицин | 0,2 | - |
Стрептомицин | 1,0 | - |
Сульфадиазин | 0,05 | - |
Сульфадиметоксин | 0,05 | - |
Сульфадоксин | 0,1 | - |
Сульфаметазин | 0,1 | - |
Сульфаметоксазол | 0,05 | - |
Сульфанометозин | 0,05 | - |
Сульфатиозол | 0,05 | - |
Тетрациклин | 0,25 | 0,300 |
Тиамфеникол | 0,1 | - |
Тилозин | 0,05 | 0,100 |
Тилмикозин | 0,75 | - |
Триметроприм | 0,1 | - |
Хлорамфеникол | 5,0 | - |
Хлортетрациклин | 0,25 | 0,300 |
Цефазолин | 0,05 | - |
Цефалексин | 0,045 | 0,060 |
Цефалониум | 0,025 | 0,015 |
Цефаперазон | 0,025 | 0,060 |
Цефапирин | 0,0025 | 0,005 |
Цефацетрил | - | 0,020 |
Цефкуином | 0,03 | - |
Цефтиофур | 0,05 | - |
Цефуроксим | 0,06 | - |
Эритромицин | 0,2 | 0,250 |
(Измененная редакция, Изм. N 2).
5 Рецепторные методы
5.1 Рецепторный метод с 3,3,5,5-триметилбензидином и диметилсульфоксидом
5.1.1 Сущность метода
Метод основан на иммуноферментной реакции, в процессе которой антибиотики бета-лактамного типа захватываются специфическими белковыми рецепторами, меченными ферментом, содержащим индикатор, с образованием химически прочного окрашенного комплекса при взаимодействии с молоком, содержащим антибиотики.
5.1.2 Аппаратура, материалы и реактивы
5.1.2.1 Термостат, позволяющий поддерживать температуру (45±5) °С.
5.1.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.
5.1.2.3 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
5.1.3 Отбор проб
5.1.3.1 Отбор проб - по ГОСТ 9225. Пробы хранят в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6±2) °С.
5.1.4 Подготовка к анализу
5.1.4.1 Термостат нагревают до температуры (45±5) °С и выдерживают при этой температуре не менее 5 мин.
5.1.5 Проведение анализа
5.1.5.1 Мерную пипетку по 5.1.2.4 наполняют анализируемым молоком до метки.
5.1.5.2 Анализируемое молоко из пипетки выливают в пробирку. Пробирку закрывают и тщательно перемешивают круговыми движениями до растворения реактива. Пробирку и индикаторное устройство помещают в термостат и выдерживают при температуре (45±5) °С в течение 5-6 мин.
5.1.5.3 Вынимают подогретое индикаторное устройство из термостата и устанавливают на горизонтальной поверхности так, чтобы приемная воронка для заливки анализируемым молоком находилась слева от оператора.
5.1.5.4 Содержимое пробирки переливают в приемную воронку индикаторного устройства.
5.1.5.5 При появлении анализируемого молока в круглом окне клавиши индикаторного устройства клавишу нажимают до упора для изменения тока жидкости и промывки пористого материала раствором антибиотиков. Включение индикаторного устройства сопровождается характерным щелчком клавиши.
5.1.5.6 Индикаторное устройство повторно помещают в термостат, выдерживают при температуре (45±5) °С в течение 4 мин и извлекают из термостата. Стабильность окраски сохраняется в течение 15 мин после извлечения устройства из термостата.
5.1.6 Обработка результатов
5.1.6.1 Сравнивают цвет контрольной зоны в индикаторном окне с цветом зоны анализируемого молока.
5.1.6.3 Если цвет зоны анализируемого молока на индикаторном устройстве аналогичен или темнее цвета контрольной зоны - пенициллин или антибиотики бета-лактамного типа в анализируемом молоке отсутствуют.
Белый или менее интенсивный цвет зоны анализируемого молока по сравнению с цветом контрольной зоны свидетельствует о наличии в анализируемом молоке пенициллина или антибиотиков бета-лактамного типа.
5.2 Рецепторный метод с коллоидным золотом
5.2.1 Сущность метода
5.2.1.1 Метод основан на проведении реакции комплексообразования антибиотиков бета-лактамного типа со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом, и последующем визуальном выявлении оставшихся свободными меченых рецепторов путем хроматографии на полосках хроматографической бумаги, содержащих в виде соответствующих линий реакционную и контрольную зоны.
5.2.2 Аппаратура, материалы и реактивы
5.2.2.1 Термостат или блок термостатируемых ячеек, позволяющий поддерживать температуру (47,5±0,5) °С.
5.2.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.
5.2.2.3 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
5.2.3 Отбор проб
Отбор проб - по ГОСТ 9225. Пробы хранят в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6±2) °С.
5.2.4 Подготовка к анализу
5.2.4.1 Термостат или блок термостатируемых ячеек нагревают до температуры (47,5±0,5) °С и выдерживают при этой температуре не менее 5 мин.
5.2.4.2 Флакон встряхивают для осаждения содержимого в нем на дно.
5.2.5 Проведение анализа
5.2.5.2 Помещают флакон в термостат или блок термостатируемых ячеек по 5.2.2.1.
5.2.5.3 Не менее чем через 3 мин термостатирования во флакон, находящийся в термостате или в блоке термостатируемых ячеек, помещают входящую в комплект полоску хроматографической бумаги.
5.2.5.4 Хроматографирование проводят в течение 2 мин. Затем полоску хроматографической бумаги извлекают из флакона.
5.2.6 Обработка результатов
5.2.6.1 Сравнивают интенсивность цвета окрашенных в красный цвет зон, появляющихся после проведения процедуры по 5.2.5.4 в виде линий на полосках хроматографической бумаги.
5.2.6.2 Зона на верхней части полоски является контрольной. Если ее окрашивания не произошло после выполнения требований по 5.2.5.3, 5.2.5.4, то повторяют все процедуры в соответствии с 5.2.
5.2.6.3 Зона исследуемого молока расположена под контрольной зоной. Большая или равная интенсивность цвета контрольной зоны, а также отсутствие окраски зоны образца является признаком наличия антибиотиков бета-лактамного типа в молоке.
5.2.6.4 Меньшая интенсивность цвета контрольной зоны, по сравнению с интенсивностью цвета зоны под ней, является признаком отсутствия антибиотиков.
5.3 Метрологические характеристики
Наименьшие пределы определения антибиотиков бета-лактамного типа представлены в таблице 3.
Таблица 3
|
|
|
Наименование антибиотика | Наименьший предел определения, Ед/г (мкг/г), с использованием | |
| Бета-лактам "Snap®" | Beta Star® |
Амоксициллин | 0,007 | 0,002 |
Ампициллин | 0,005 | 0,002 |
Диклоксациллин | 0,02 | 0,005 |
Клоксациллин | 0,03 | 0,005 |
Нафциллин | 0,07 | 0,008 |
Оксациллин | 0,04 | 0,005 |
Пенициллин | 0,003* | - |
Пенициллин G | - | 0,002 |
Цефазолин | 0,02 | - |
Цефалексин | 0,025 | - |
Цефалониум | 0,04 | 0,007 |
Цефаперазон | 0,01 | 0,005 |
Цефапирин | 0,011 | 0,008 |
Цефацетрил | 0,05 | - |
Цефкуином | 0,02 | - |
Цефтиофур | 0,006 | 0,075 |
* 0,003 мкг активного вещества равно 0,005 Ед активности. | ||
Раздел 5. (Измененная редакция, Изм. N 1, 2)
6 Требования безопасности
Работу со споровой культурой тест-микроба в лаборатории проводят в соответствии с санитарными правилами по [2].
Раздел 6. (Введен дополнительно, Изм. N 1).
ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)
Библиография
|
|
[1] | Тест-набор Бета-лактам "Snap ". Россия, ООО "ЗИП-И Диагностикс" |
[2] СП 1.2.731-99 | Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами |
[3]
| Тестовый набор "Copan Test®" Дания, CHR HANSEN. Российское представительство: Россия, 105318 Москва, ул.Щербаковская, 53, корп.17, 3 этаж, ООО "Хр. Хансен"
|
[4]
| Тест-набор "Beta Star®" Дания, CHR HANSEN. Российское представительство: Россия, 105318 Москва, ул.Щербаковская, 53, корп.17, 3 этаж, ООО "Хр. Хансен" |
ПРИЛОЖЕНИЕ А. (Измененная редакция, Изм. N 1, 2).
Текст документа сверен по:
официальное издание
Молоко и молочные продукты.
Общие методы анализа: Сб. ГОСТов. -
М.: ИПК Издательство стандартов, 2004