ГОСТ Р 51921-2002 Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes.
ГОСТ Р 51921-2002
Группа Н11, Н12, Н14, Н16, Н17,
Н21, Н24, Н25, Н26, Н27,
Н28, Н61, Н65, С42, С43
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes
Food products. Methods for detection and determination of Listeria monocytogenes bacteria
___________________________________________________________
ОКС 07.100.30
67.080.20
67.100
67.120
ОКСТУ 9109
9209
9709
Дата введения 2003-07-01
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом мясной промышленности им. В.М.Горбатова РАСХН (головная организация); Государственным учреждением Научно-исследовательским институтом питания РАМН; Государственным учреждением Научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН; Государственным унитарным предприятием Государственным научно-исследовательским и проектно-конструкторским институтом по развитию и эксплуатации флота; Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН
ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 226 "Мясо и мясная продукция"
2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 12 июля 2002 г. N 277-ст
3 Настоящий стандарт гармонизирован с международным стандартом ИСО 11290.2-98* "Микробиология продуктов питания и животных кормов. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета микроорганизмов Listeria monocytogenes. Часть 2. Метод подсчета" в части пп.9.1, 9.2, 9.3, 9.4.1-9.4.4, 9.5.1-9.5.3, В.4, В.5
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, в том числе на продукты детского, лечебного и специализированного питания: мясо, включая мясо птицы, субпродукты и мясные продукты; рыбу, нерыбные объекты промысла и продукты, вырабатываемые из них; молоко и молочные продукты; маргарин, майонез, свежие и свежезамороженные овощи, картофель, салаты из овощей и устанавливает метод выявления и определения в них бактерий вида Listeria monocytogenes.
Метод основан на высеве определенного количества пищевого продукта в жидкую селективную питательную среду (с предварительным обогащением), последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и культивировании посевов при оптимальных условиях. Принадлежность выявленных колоний к Listeria monocytogenes определяют по биологическим свойствам.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия
ГОСТ 4288-76* Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого мяса. Правила приемки и методы испытаний
________________
* На территории Российской Федерации в части раздела "Правила приемки" действует ГОСТ Р 52675-2006.
ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 7631-2008 Рыба, нерыбные продукты и продукция из них. Методы определения органолептических и физических показателей
ГОСТ 7702.2.0-95/ГОСТ Р 50396.0-92 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим испытаниям
ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа*
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53430-2009.
ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 9792-73 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 9958-81 Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа
ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе
ГОСТ 10444.8-88 Продукты пищевые. Метод определения Bacillus cereus
ГОСТ 13928-84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу
ГОСТ 21237-75 Мясо. Методы бактериологического анализа
ГОСТ 25706-83 Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования
ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов
ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.
ГОСТ 30004.2-93 Майонезы. Правила приемки и методы испытаний
ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности
ГОСТ 31339-2006 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1-91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб
ГОСТ Р 51448-99 (ИСО 3100-2-88) Мясо и мясные продукты. Методы подготовки проб для микробиологических исследований
ГОСТ Р 52179-2003 Маргарины, жиры для кулинарии, кондитерской, хлебопекарной и молочной промышленности. Правила приемки и методы контроля
СП 1.2.731-99* Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами
3 Определения и сокращения
В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями и сокращениями:
бактерии рода Listeria (далее - листерии): Грамположительные неспорообразующие короткие палочки с закругленными концами, иногда почти кокки, одиночные или в коротких цепочках (0,4-0,5х0,5-2,0 мкм), реже образуют длинные нити.
Listeria monocytogenes: Вид бактерий рода Listeria, патогенный для человека и животных, принадлежность к которому устанавливают путем дифференциации от непатогенных видов Listeria по культуральным, биохимическим и биологическим свойствам.
МПА - мясопептонный агар.
МПБ - мясопептонный бульон.
ПБЛ - питательный бульон для выделения и культивирования листерий.
ПАЛ - питательный агар для выделения листерий.
4 Аппаратура, материалы и реактивы
4.1 Аппаратура, материалы и реактивы - по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:
анализатор иммунно-ферментный типа "mini VIDAS" с использованием стрипового набора YIDAS LMO;
дозаторы пипеточные по [1];
лупа по ГОСТ 25706;
рН-метр модели 2696 по [2];
петля бактериологическая из платины/иридия, никеля, хрома или пластиковая диаметром 3 мм;
пипетки градуированные по ГОСТ 29227, второго класса точности;
пипетки пастеровские;
слайды или планшеты для иммунологических реакций по [3];
стекла покровные по ГОСТ 6672;
стекла предметные по ГОСТ 9284;
термометр цифровой по [4];
часы механические сигнальные по ГОСТ 3145;
бактериофаг листерийный L-3A по [5];
гидролизат казеина панкреатический;
диагностикум антительный латексный для выявления листерий "Листерия-АG-тест" по [6];
манноза;
система "API Listeria" для определения ферментативных свойств по [7];
стандарт мутности Макфарланда, соответствующий 1 ЕД;
сыворотка поливалентная листериозная агглютинирующая по [8];
тест-штамм Listeria monocytogenes 766;
тест-штамм Rhodococcus equi гемолитический;
тест-штамм Staphylococcus aureus гемолитический.
5 Отбор и подготовка проб
5.1 Отбор и подготовку проб пищевых продуктов проводят в соответствии с ГОСТ 26668, ГОСТ 26669, а также в соответствии с нормативными и техническими документами на конкретные виды продуктов.
5.2 Отбор и подготовку проб мяса, включая мясо птицы, субпродуктов, мясных полуфабрикатов, колбасных изделий и других мясных продуктов, в том числе продуктов детского, лечебного и специализированного питания, проводят по 5.1 и ГОСТ 4288 (1.3, 2.1, 2.11.3), ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, ГОСТ 9792, ГОСТ 9958 (3.33), ГОСТ 21237 (1.1-1.3, 3.3), ГОСТ Р 51447, ГОСТ Р 51448.
5.3 Отбор и подготовку проб молока и молочных продуктов, в том числе продуктов детского, лечебного и специализированного питания, проводят по 5.1 и ГОСТ 9225 (1.1-1.7), ГОСТ 13928, ГОСТ 26809, [9].
5.4 Отбор и подготовку проб маргарина и майонеза проводят по 5.1 и ГОСТ Р 52179 (2.1), ГОСТ 30004.2 (1.2, 2.1), [10]*.
5.5 Отбор и подготовку проб рыбы, нерыбных объектов промысла и продуктов, вырабатываемых из них, в том числе продуктов детского, лечебного и специализированного питания проводят по 5.1 и ГОСТ 7631, ГОСТ 31339 (1.3, 4.1-4.3), [11] и [12]*.
5.6 Отбор и подготовку проб плодоовощной продукции, в том числе продуктов детского, лечебного и специализированного питания, проводят по 5.1 и [13]*.
6 Подготовка к исследованию
6.1 Приготовление растворов
6.1.1 Пептонно-солевой раствор для приготовления разведений - по ГОСТ 26669 (1.2).
6.1.2 Растворы и реактивы для окраски по Граму - по ГОСТ 10444.1 (4.25).
6.1.3 Физиологический раствор - по ГОСТ 10444.1 (4.29).
6.1.4 Раствор с объемной долей перекиси водорода 3% - по ГОСТ 10444.1 (4.33).
6.1.5 Приготовление растворов для постановки реакции нитратредукции.
Раствор А готовят по ГОСТ 10444.8 (3.1.7).
Раствор Б готовят по ГОСТ 10444.8 (3.1.6).
Непосредственно перед постановкой реакции растворы А и Б смешивают.
6.2 Приготовление питательных сред
6.2.1 Среды для поддержания выделенных культур и культивирования бактерий рода Listeria
6.2.1.1 МПБ с 1% глюкозы - по ГОСТ 10444.1 (5.13).
6.2.1.2 МПА с 1% глюкозы - по ГОСТ 10444.1 (5.13)
6.2.1.3 Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB) - по [14].
6.2.1.4 Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) - по [14].
6.2.1.5 Трипказо-соевый бульон (TSB) - по [15].
6.2.1.6 Трипказо-соевый агар (TSA) - по [15].
6.2.1.7 Состав питательных сред и способы приготовления приведены в приложении А.1.1-А.1.4.
6.2.2 Среды селективные для предварительного обогащения
6.2.2.1 ПБЛ I - по [16].
6.2.2.2 Бульон Фразера полуконцентрированный (Half Fraser broth) - по [14], [15].
6.2.2.3 Состав питательных сред и способы приготовления приведены в приложении А (А.2.1, А.2.2).
6.2.3 Среды селективные для обогащения
6.2.3.1 ПБЛ II - по [16].
6.2.3.2 Бульон Фразера (Fraser broth) - пo [14], [15].
6.2.3.3 Состав питательных сред и способы приготовления приведены в приложении А (А.3.1, А.3.2).
6.2.4 Среды селективно-диагностические
6.2.4.1 Среда ПАЛ - по [18].
6.2.4.2 Оксфордский агар (Oxford agar) - по [14], [15].
6.2.4.3 ПАЛКАМ агар (PALCAM agar) - по [14], [15], [17].
6.2.4.4 Состав питательных сред и способы приготовления приведены в приложении А (А.4.1-А.4.3).
6.2.5 Среды для изучения биологических свойств при идентификации листерий
6.2.5.1 Питательная среда ГРМ N 1 - по [19].
6.2.5.2 Кровяной агар
Для посева используют теплые чашки.
6.2.5.3 Лецитин-агар с активированным углем и без угля
К питательной среде ГРМ N 1 перед стерилизацией добавляют 0,5% активированного угля, растертого до порошкообразного состояния.
Аналогично готовят агар с добавлением желтка без добавления активированного угля.
6.2.5.4 Нитратную среду готовят по ГОСТ 10444.8 (3.2.9).
6.2.5.5 Полужидкую питательную среду (Listeria motility medium) для определения подвижности листерий готовят в соответствии с приложением А.5.1.
6.2.5.6 Среды Гисса готовят по ГОСТ 10444.1 (5.29), используя в качестве углевода рамнозу, ксилозу, маннозу и маннит.
6.2.5.7 МПБ с 0,5% глюкозы готовят по ГОСТ 10444.1 (5.13), но при приготовлении добавляют 5 г глюкозы.
6.2.5.8 МПА готовят по ГОСТ 10444.1 (5.12).
6.3 Среды по 6.2.2, 6.2.3, 6.2.4 готовят накануне или непосредственно перед использованием в соответствии с указанием на этикетке.
Готовые среды хранят в темноте, так как отдельные компоненты, входящие в их состав, например акрифлавин, могут окисляться на свету, образуя продукты, подавляющие рост листерий.
7 Проведение исследования
7.1 Предварительное селективное обогащение
Массу навески продуктов детского, лечебного или специализированного питания отбирают по 5.1. Соотношение между количеством высеваемого продукта и питательной средой должно составлять 1:9.
Посевы культивируют при температуре (30±1) °С в течение (24±2) ч.
При росте листерий на полуконцентрированном бульоне Фразера, содержащем эскулин, отмечают почернение среды за счет гидролиза гликозида эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа, образуя комплекс черного или оливкового цвета.
На ПБЛ I, не содержащем эскулин, почернение не происходит.
7.2 Селективное обогащение
На бульоне Фразера, содержащем эскулин, отмечают почернение среды, как признак возможного присутствия листерий.
На среде ПБЛ II почернение не происходит.
7.3 Выявление характерных колоний на агаризованных селективно-диагностических средах
7.3.1 Из пробирок после инкубирования по 7.2, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, в том числе почернения, делают посев бактериологической петлей из культуральной жидкости на поверхность одной из агаризованных селективно-диагностических сред, указанных в 6.2.4. Допускается проводить пересев параллельно на поверхность двух плотных селективно-диагностических сред.
Посевной материал растирают по поверхности шпателем или распределяют петлей в виде штриха. Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посев проводят по ГОСТ 26670.
Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч.
7.3.2 После инкубирования по 7.3.1 чашки с посевами просматривают и отмечают рост характерных колоний.
При отсутствии роста характерных колоний листерий на селективно-диагностических средах, указанных в 6.2.4, исследование прекращают и делают заключение об отсутствии Listeria monocytogenes в исследуемой пробе продукта.
На среде ПАЛ рост листерий сопровождается потреблением эскулина и почернением колоний и питательной среды. Через 24 ч инкубирования они образуют мелкие серовато-желтые колонии с черным ореолом диаметром от 1,0 до 2,0 мм. Посторонняя кокковая микрофлора образует выпуклые колонии лимонно-желтого цвета диаметром от 1,0 до 4,0 мм, окруженные слабым (или без него) покраснением питательной среды.
На ПАЛКАМ агаре (PALCAM agar) через 24 ч инкубирования листерий формируют мелкие серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом диаметром от 1,0 до 1,5 мм, иногда с черным центром. Через 48 ч колонии диаметром 1,5-2,0 мм приобретают зеленую окраску с углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Посторонняя кокковая микрофлора образует выпуклые желтые колонии диаметром от 1,0 до 4,0 мм.
На Оксфордском агаре колонии листерий через 24 ч инкубирования - мелкие диаметром 1 мм сероватые, окруженные черным ореолом. Через 48 ч - более темные около 2 мм в диаметре с черным ореолом и углубленным центром.
При появлении сплошного роста листерий проводят пересев бактериологической петлей из зон наибольшего почернения среды штрихами на поверхность двух чашек Петри с одной из агаризованных селективно-диагностических сред, указанных в 6.2.4, для получения изолированных колоний.
Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч.
7.3.3 Для определения принадлежности характерных колоний к бактериям рода Listeria отбирают отдельных колоний, выращенных на агаризованных селективно-диагностических средах по 7.3.1, и пересевают бактериологической петлей на среды: МПА с 1% глюкозы и/или триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA), трипказо-соевый агар (TSA), МПБ с 1% глюкозы и/или триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB), трипказо-соевый бульон (TSB).
Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 24 ч.
Получение чистой культуры проводят по ГОСТ 26670.
На МПА с 1% глюкозы листерии имеют вид мелких сероватых полупрозрачных колоний.
На триптон-соевом агаре с дрожжевым экстрактом (TSYEA) и трипказо-соевом агаре (TSA) типичные колонии листерий от 1,0 до 2,0 мм в диаметре, выпуклые, бесцветные, непрозрачные.
На всех указанных средах вид колоний напоминает "капли росы".
Рост листерий на средах: МПБ с 1% глюкозы, триптон-соевом бульоне с дрожжевым экстрактом (TSYEB), трипказо-соевом бульоне (TSB) характеризуется равномерным помутнением среды, при встряхивании которой наблюдаются так называемые муаровые волны.
7.4 Подтверждение принадлежности выявленных колоний к бактериям рода Listeria
Для подтверждения принадлежности выделенных микроорганизмов к роду Listeria у полученных на средах культивирования чистых культур по 7.3.3 проверяют отсутствие капсул и спор, окраску по Граму, определяют присутствие каталазы (каталазную активность), подвижность бактерий при двух температурах инкубирования: (22±1) и (37±1) °С, нитратредуцирующие свойства.
7.4.1 Из посевов по 7.3.3 готовят препараты, окрашивают их по Граму по ГОСТ 30425 (приложение Г.2) и микроскопируют. Бактерии рода Listeria являются грамположительными тонкими короткими палочками, спор и капсул не образуют.
Для получения доступа к полной версии без ограничений вы можете выбрать подходящий тариф или активировать демо-доступ.