Методические указания по методам контроля МУК 3.1.7.3402-16 Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза.
МУК 3.1.7.3402-16
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
3.1.7. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ. ИНФЕКЦИИ, ОБЩИЕ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза
2 Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю.Поповой 10 ноября 2016 г.
3 Введены взамен методических указаний "Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей" (МУ 3.1.7.1189-03)
Перечень сокращений
ГИС - географические информационные системы;
НЦЭСМП - Научный центр экспертизы средств медицинского применения;
Г - гуанин;
ДДМ - диско-диффузионный метод;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
ДТР - диагностический титр разведения;
ИП - интенсивный показатель;
ИФА - иммуноферментный анализ;
ЛПС - липополисахарид;
МО - медицинские организации;
м.к. - микробная клетка;
МДа - мегадальтон;
ME - международные единицы;
мкм - микрометр;
МПА - мясопептонный агар;
МПБ - мясопептонный бульон;
МПК - минимальная подавляющая концентрация;
МУ - методические указания;
МУК - методические указания по контролю;
МФА - метод флуоресцирующих антител;
ООИ - особо опасные инфекции;
ПБА - патогенный биологический агент;
ПСЛ - показатель специфического лизиса лейкоцитов;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
ПЭО - показатель эпидемической опасности;
РА - реакция агглютинации;
РИФ - реакция иммунофлуоресценции;
РНАт - реакция нейтрализации антител;
РНГА - реакция непрямой гемагглютинации;
РК - реакция Кумбса;
РЛЛ - реакция лизиса лейкоцитов;
РХ - реакция Хеддлсона;
РА- реакция агглютинации Райта;
СП - санитарные правила;
Тб - Тбилиси;
т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов;
ЦНС - центральная нервная система;
Ц - цитозин;
MLVA - мультилокусный анализ вариабельного числа тандемных повторов.
1. Область применения
1.1. Настоящие методические указания определяют организацию и порядок проведения эпидемиологического надзора, а также порядок упаковки, хранения, транспортирования и проведения лабораторных исследований клинического материала в целях выявления этиологического агента и проведения его типирования.
1.2. Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов и организаций, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, а также для специалистов медицинских организаций, осуществляющих лабораторную диагностику бруцеллеза, независимо от их организационно-правовой формы или формы собственности.
2. Общие положения
2.1. Бруцеллез - зоонозное, инфекционно-аллергическое заболевание с высокой потенциальной возможностью перехода в хроническую форму. Возбудитель бруцеллеза относится ко II группе патогенности. Человек высоковосприимчив к возбудителю бруцеллеза. Заболевание характеризуется длительным течением с поражением преимущественно опорно-двигательного аппарата, как правило, сопровождается хронизацией инфекционного процесса с последующей инвалидизацией больного. Наиболее широко бруцеллез распространен в странах Средиземноморья, Малой Азии, Юга и Юго-Восточной Азии, Африки, Центральной и Южной Америки.
2.2. В Международную классификацию болезней Десятого пересмотра "бруцеллез" входит в блок "бактериальные зоонозы" под кодом А23.
2.3. Возбудитель бруцеллеза относится к семейству Brucellacaea, роду Brucella, который включает в себя 10 самостоятельных видов, различающихся по биохимическим, метаболическим, антигенным и вирулентным характеристикам: B. melitensis (3 биовара), B. abortus (7 биоваров), B. suis (5 биоваров), B. neotomae, B. ovis, B. canis, B. ceti, В. pinnipedialis, B. microti, В. inopinata.
2.5. К патогенным для человека бруцеллам, способным вызывать заболевание, относятся возбудители бруцеллеза: B. melitensis, B. abortus и B. suis, циркулирующие в очагах бруцеллеза крупного и мелкого скота, а также свиней. В. abortus и B. suis вызывают спорадическую заболеваемость, B. melitensis способен вызывать групповые заболевания.
2.6. Бруцеллы относительно стабильны в окружающей среде и способны длительное время сохраняться в различных субстратах. Во влажной среде при температуре 55°С возбудитель бруцеллеза погибает через 60 мин, при 60°С - через 30 мин, при 70°С - через 10 мин, при кипячении - моментально. Сухой жар (90-95°С) убивает бруцеллы в течение часа. При низких температурах бруцеллы сохраняют жизнеспособность при температуре минус 5-8°C в течение 35 дней, а при минус 20°C - в течение 20 дней. Под действием солнечного света бруцеллы погибают в сроки от нескольких минут до 7-8 дней в зависимости от интенсивности инсоляции и атмосферных условий. В сыром молоке, хранящемся в холодильнике, возбудитель бруцеллеза сохраняется до 10 дней; сливочном масле - более 4 недель; домашнем сыре - 3 недели; брынзе - 45 дней; простокваше, сметане - 8-15 дней; кумысе, шубате (сброженное верблюжье молоко) - до 3 суток; мясе - до 12 дней; во внутренних органах, костях, мышцах и лимфатических узлах инфицированных туш - в течение 1 месяца и более; в овечьей шерсти, смушках - от 1,5 до 4 месяцев. В замороженных инфицированных мясных и молочных продуктах бруцеллы остаются жизнеспособными в течение всего срока хранения.
2.7. Возбудитель бруцеллеза чувствителен к различным дезинфицирующим веществам: 2%-й раствор фенола, 3%-й раствор креолина, 0,2-1%-й раствор хлорной извести и хлорамина убивают их в течение нескольких минут.
3. Эпидемиологические особенности бруцеллеза
3.1. Основными источниками возбудителя инфекции для людей являются больные бруцеллезом овцы, козы, крупный рогатый скот и свиньи. Отмечаются случаи заражения людей от северных оленей, верблюдов, яков, собак, кошек и других животных.
3.2. Эпидемиологическое значение имеют неблагополучные по бруцеллезу овцеводческие хозяйства с циркуляцией наиболее вирулентного возбудителя вида B. melitensis, в которых чаще возникают вспышечные случаи заболевания людей, а также хозяйства крупного рогатого скота и свиноводческие фермы, в которых регистрируется, как правило, спорадическая заболеваемость.
3.3. Роль человека в передаче бруцеллезной инфекции эпидемиологического значения не имеет.
3.4. Инкубационный период - от 5 до 15 дней, чаще 7-10 дней.
3.5. Основными путями передачи возбудителя бруцеллеза являются контактный и алиментарный, реже аэрогенный. Особенно высока возможность инфицирования при контактном пути заражения во время оказания помощи животным при родах и абортах, когда проводят ручное отделение плаценты. Заражение может произойти при переработке мясного сырья, кожи, шерсти, шкур больных бруцеллезом животных. В таких случаях инфицирование людей происходит через кожные покровы. Проникновение бруцелл может произойти через слизистые глаз, носа, ротовой полости при несоблюдении мер личной безопасности.
Алиментарный путь передачи бруцелл реализуется при употреблении пищевых продуктов, полученных от больных животных. Наибольшую опасность представляют сырое молоко и молочные продукты (брынза, сливки, сметана, кумыс и др.), которые являются причиной инфицирования людей, профессионально не связанных с животноводством (особенно жителей городов).
Аэрогенный путь заражения человека бруцеллезом возможен при стрижке шерсти, сборе пуха, уборке скотных дворов, обработке шкур, убое скота и других производственных процессах, связанных с уходом за больными животными, или при обработке продуктов и сырья, полученных от них, а также в бактериологических лабораториях во время манипуляций при работе с чистыми культурами (пересевы, центрифугирование и др.), когда образуются бактериальные аэрозоли.
3.6. Для бруцеллеза характерны подъемы заболеваемости, связанные с проведением окотной кампании и уходом за животными в послеродовой период. Спорадические случаи инфекции выявляются в течение всего года.
3.7. После перенесенного заболевания в сыворотке крови сохраняются антитела к антигенам возбудителя. Приобретенный после перенесенного заболевания иммунитет не предотвращает новые случаи заболевания, но способствует более легкому клиническому течению. Применение вакцины создает иммунитет продолжительностью 8-10 месяцев.
3.8. Бруцеллез поражает население всех возрастных групп, однако преимущественно болеют лица трудоспособного возраста. Заболеваемость бруцеллезом в большинстве случаев носит профессиональный характер и регистрируется среди лиц, имеющих контакт с больными животными или сырьем животного происхождения. К группам профессионального риска относятся работники животноводческих (звероводческих) хозяйств (ферм), мясомолочных комбинатов и других предприятий по переработке продуктов и сырья животного происхождения, убойных пунктов, пунктов стрижки, купки овец, ветеринарные работники, персонал бактериологических лабораторий, работающих с вирулентными культурами бруцелл.
4. Эпидемиологический надзор за бруцеллезом
4.1. Эпидемиологический надзор за бруцеллезом - это непрерывное наблюдение за динамикой эпидемических проявлений инфекции и эпизоотической ситуации, а также за факторами и условиями, способствующими циркуляции возбудителя с целью своевременной разработки комплекса санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий и принятия управленческих решений.
4.2. При осуществлении федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора осуществляется:
- слежение за заболеваемостью людей бруцеллезом, ее территориальным распространением и заболеваемостью отдельных групп населения (сельского, городского, по возрастным и профессиональным группам);
- активное выявление медицинскими организациями больных бруцеллезом из числа больных, с диагнозами, не исключающими заболевание бруцеллезом или сопоставимыми с этой инфекцией, лабораторное обследование на бруцеллез, в т.ч. на гемокультуру (по показаниям), длительно лихорадящих больных (более 5 дней);
- анализ эпизоотологической ситуации по бруцеллезу по материалам, представляемым государственной ветеринарной службой, включая анализ комплекса ветеринарно-санитарных мероприятий, направленных на ограничение рассеивания инфекции и предупреждение заражения здоровых животных;
- слежение за численностью контингентов, подвергающихся риску заражения на эндемичных по бруцеллезу территориях, а также за контингентами, профессионально связанными с риском заражения бруцеллезом;
- слежение за динамикой эпидемиологически значимых социальных явлений (миграция населения и сельскохозяйственных животных, характер хозяйственной деятельности, санитарно-гигиенические условия работы в сельскохозяйственном производстве и на предприятиях по переработке продуктов животноводства и сырья, уровень медицинского обслуживания и др.);
- разработка тактики специфической профилактики бруцеллеза;
- оценка качества, своевременности и эффективности осуществляемых профилактических и противоэпидемических мероприятий с целью их оптимальной корректировки;
- разработка прогнозов эпидемиологической ситуации.
4.3. Эпидемиологический надзор за бруцеллезом проводится органами и организациями, осуществляющими федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор.
4.4. Эпидемиологический надзор за бруцеллезом основан на результатах эпидемиологической, клинической и лабораторной диагностики.
4.4.1. Эпидемиологическая диагностика бруцеллеза.
4.4.1.1. Эпидемиологический анализ подразделяется на ретроспективный и оперативный.
4.4.1.2. Ретроспективный эпидемиологический анализ проводится специалистами территориальных органов Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации и включает изучение многолетней и помесячной динамики заболеваемости населения, анализ эпизоотологической ситуации на конкретной территории с определением факторов риска заболевания и причинно-следственных связей.
Ретроспективный анализ ситуации предусматривает следующее:
- характеристику многолетней динамики заболеваемости с определением тенденций (рост, снижение, стабилизация) и темпов роста (прироста) или снижения;
- анализ годового и помесячного уровней заболеваемости бруцеллезом;
- изучение заболеваемости по отдельным регионам, территориям, населенным пунктам;
- изучение заболеваемости по возрасту, полу, профессии, месту жительства, субъектам хозяйственной деятельности;
- распределение заболеваемости по характеру клинических проявлений и тяжести клинического течения;
- анализ многолетних данных о циркуляции возбудителя бруцеллеза по результатам лабораторных исследований материала от людей и животных (данные ветеринарной службы);
- изучение особенностей возбудителя (виды, биовары, генотипы);
- анализ факторов риска, включая сведения об эпизоотическом состоянии по бруцеллезу административной территории, населенного пункта.
4.4.1.3. Оперативный эпидемиологический анализ проводится за определенный промежуток времени на конкретной территории с целью оценки эпидемиологической обстановки, постановки эпидемиологического диагноза, разработки адекватных противоэпидемических (профилактических) мероприятий и составления прогноза развития эпидемиологической ситуации.
Оперативный анализ заболеваемости бруцеллезом основывается на данных регистрации первичных диагнозов и позволяет своевременно установить изменения эпидемической ситуации и их причины.
Основной задачей ретроспективного и оперативного анализов является своевременное выявление предпосылок и причин осложнения эпидемической ситуации.
4.4.1.4. В качестве предпосылок, способных обусловить возникновение заболевания бруцеллезом, могут являться:
- возникновение новых неблагополучных пунктов по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота на административной территории;
- увеличение заболеваемости бруцеллезом на соседних территориях;
- увеличение количества сельскохозяйственных животных эпидемиологически значимых видов, заболевших бруцеллезом;
- завоз сельскохозяйственных животных эпидемиологически значимых видов из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств, других территорий.
4.4.1.5. Предвестниками активизации эпидемического процесса являются:
- регистрация случаев заболевания людей бруцеллезом, число которых превышает среднемноголетний уровень для конкретной административной территории;
- регистрация эпидемических очагов бруцеллеза с групповой заболеваемостью на территории с неблагополучными по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота пунктами;
- установление миграции возбудителя бруцеллеза мелкого рогатого скота (B. melitensis) на крупный рогатый скот.
4.4.1.6. При регистрации впервые выявленных заболеваний бруцеллезом проводится эпидемиологическое расследование, осуществляемое в соответствии с действующими нормативными правовыми и методическими документами по профилактике бруцеллеза.
5. Клиническая диагностика бруцеллезной инфекции
5.1. Диагноз "бруцеллез" устанавливают на основании клинических, эпидемиологических данных и лабораторного подтверждения (обнаружение маркеров возбудителя бруцеллеза с использованием методов и диагностических препаратов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке).
5.2. При эпидемиологическом расследовании групповых случаев бруцеллеза (при регистрации 5 и более взаимосвязанных случаев заболеваний) обязательно проводят лабораторное обследование. Больным из очагов групповых заболеваний, в которых имеются лабораторно подтвержденные случаи, диагноз "бруцеллез" может быть установлен на основании клинико-эпидемиологических данных.
5.3. Окончательный диагноз должен включать: клиническую форму заболевания, тяжесть течения, осложнение и результаты лабораторных исследований.
5.4. Госпитализация больных проводится по клиническим показаниям.
5.5. Регистрация, учет и статистическое наблюдение случаев заболевания людей бруцеллезом осуществляется в соответствии с действующими нормативными правовыми и методическими документами по профилактике бруцеллеза.
6. Мониторинг за циркуляцией возбудителя
6.1. Микробиологический мониторинг за циркуляцией возбудителя осуществляют с целью изучения этиологической структуры бруцеллеза у людей, динамического слежения за распространением и циркуляцией возбудителя.
6.2. Микробиологический мониторинг возбудителя бруцеллеза проводят органы и организации, уполномоченные осуществлять государственный санитарно-эпидемиологический надзор по материалам, представленным, в том числе, лабораториями медицинских организаций и другими лабораториями, аккредитованными для проведения соответствующих исследований в установленном порядке.
6.3. Выделенные культуры бруцелл с атипичными свойствами из групповых очагов бруцеллеза направляются в установленном порядке для дальнейшего изучения в Референсцентр по мониторингу за возбудителем бруцеллеза (ФКУЗ "Ставропольский противочумный институт" Роспотребнадзора).
6.4. Результаты микробиологического исследования учитываются в ходе эпидемиологического анализа в рамках проведения эпидемиологического надзора за бруцеллезом.
7. Эпидемиологическое районирование административной территории субъекта Российской Федерации
7.1. Районирование территории по ПЭО заболевания людей бруцеллезом используется для осуществления дифференцированного подхода при проведении эпидемиологического надзора и профилактики данной инфекции в субъекте Российской Федерации.
7.2. Эпидемиологическое районирование по ПЭО базируется на официальных статистических данных о заболеваемости людей и животных в муниципальных районах субъекта Российской Федерации за определенный период времени.
7.3. При проведении эпидемиологического районирования территории субъекта Российской Федерации по ПЭО учитываются показатели заболеваемости населения и частота эпидемических проявлений бруцеллеза в разрезе административных районов субъекта Российской Федерации, что позволяет объединить их в группы по степени эпидемической опасности и составить шкалу картограмм для эпидемиологического районирования.
7.4. Результаты эпидемиологического районирования территории субъекта Российской Федерации по уровню ПЭО представляются в виде картограммы, которая выполняется одним из способов:
- в автоматическом режиме с применением современных географических информационных систем (ГИС): ArcGis, Maplnfo;
- в ручном режиме - данные могут наноситься на карту с административно-территориальным делением субъекта Российской Федерации (бумажный носитель) окраской определенной степени насыщенности (фоновая картограмма).
7.5. Данные по районированию административных территорий субъектов Российской Федерации по ПЭО, полученные в результате анализа многолетней заболеваемости, используются для оценки эпидемиологической обстановки по бруцеллезу при проведении эпидемиологического анализа и планировании комплекса противобруцеллезных мероприятий.
7.6. Методика проведения эпидемиологического районирования субъекта Российской Федерации по риску эпидемической опасности представлена в прилож.1.
8. Эпидемиологический прогноз
Результаты оперативного, ретроспективного анализов заболеваемости бруцеллезом, районирования административной территории по ПЭО позволяют обосновать прогноз развития эпидемической ситуации как на краткосрочную перспективу (до 1 месяца), так и на среднесрочную (до 1 года).
Точность эпидемиологического прогноза при бруцеллезе зависит от правильности постановки эпидемиологического диагноза и оценки факторов, обусловливающих возможность активной реализации механизма передачи возбудителя, адекватности мероприятий, проводимых в отношении источников инфекции, прерывания путей распространения инфекции и защиты угрожаемого контингента населения.
9. Лабораторная диагностика бруцеллеза
Лабораторная диагностика бруцеллеза проводится согласно нормативным правовым и методическим документам, определяющим порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней.
Для лабораторной диагностики бруцеллеза у людей применяются три группы методов: первая - тесты, позволяющие выявить возбудителя заболевания и его растворимые антигены; вторая - методы определения специфических антител; третья - тесты, свидетельствующие о сенсибилизации организма.
При выделении культуры возбудителя бруцеллеза определяют ее чувствительность к антибактериальным препаратам, проводят генотипирование.
9.1. Отбор, транспортирование материала и подготовка проб для исследования
Отбор, транспортирование материала и подготовка проб для исследования осуществляются в соответствии с нормативными правовыми и методическими документами, определяющими порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней.
9.1.1. Отбор и транспортирование проб клинического материала
Отбор проб клинического материала для исследования, их упаковку и транспортирование осуществляет медицинский персонал в соответствии с требованиями действующих нормативных правовых и методических документов по безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности), по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности.
Клиническим материалом для отбора проб, предназначенных для дальнейшего исследования на бруцеллез, от лиц с подозрением на бруцеллез, больных людей в зависимости от клинической формы болезни являются: кровь, костный мозг, спинномозговая жидкость, пунктат из лимфатических узлов, моча, желчь, суставная жидкость (при артритах), гной (при абсцессах), мокрота, грудное молоко.
Материал от больных с подозрением на бруцеллез отбирают при поступлении больного до начала антибиотикотерапии.
При всех формах болезни берут кровь в объеме 10-15 мл с учетом необходимости проведения бактериологических, серологических исследований и полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Непосредственно у постели больного 10 мл крови засевают в две емкости с бифазной средой для выделения гемокультуры или по 5 мл вносят иглой через предварительно обработанную спиртом резиновую пробку во флаконы с жидкой питательной средой для транспортирования материала и накопления бруцелл, использование которой позволяет совместить этапы транспортирования материала в лабораторию и подращивания бруцелл.
Кровь у больного берут натощак из локтевой вены в количестве 5-10 мл, соблюдая правила асептики, шприцем или с использованием вакуумной системы: с активатором сыворотки - для иммунологических исследований и с цитратом натрия или ЭДТА - для ПЦР. При взятии крови шприцем для получения сыворотки и предотвращения гемолиза пробирку с кровью оставляют при комнатной температуре в скошенном положении до образования сгустка. Полученную сыворотку отбирают в пластиковую пробирку, герметично закрывают и направляют в лабораторию для исследования на наличие специфических антител к возбудителю бруцеллеза.
Костный мозг получают путем пункции грудины шприцем с короткой и несколько затупленной иглой. Полученный костный мозг (в количестве нескольких капель) засевают в пробирку на питательные среды.
Спинномозговую жидкость отбирают после пункции поясничной области в количестве 0,1-0,3 мл и засевают на питательные среды.
Пробу мокроты, полученную в результате глубокого кашля, собирают в специальный стерильный одноразовый контейнер с завинчивающейся крышкой.
Пунктат из лимфатических узлов, материал, отобранный из полости сустава (синовиальная жидкость), гной (при абсцессах) после взятия вносят иглой через предварительно обработанную спиртом резиновую пробку во флаконы с жидкой питательной средой для транспортирования материала и накопления бруцелл или в стерильную одноразовую пробирку.
При исследовании мочи собирают ее среднюю порцию (10-20 мл) в специальный одноразовый контейнер с завинчивающейся крышкой.
Пробы желчи (среднюю порцию) собирают при зондировании в процедурном кабинете. Над пламенем спиртовки открывают пробирку для сбора материала, полученную желчь (10-12 мл) помещают в одноразовую стерильную пробирку с завинчивающейся пробкой. При использовании стерильной стеклянной пробирки, закрытой газопроницаемой пробкой, после наполнения емкости обжигают горлышко и пробку в пламени спиртовки, закрывают пробирку. При использовании пробирки с газопроницаемой пробкой пробу доставляют в лабораторию в строго вертикальном положении, чтобы не замочить пробку желчью.
Отобранный клинический материал засевают на питательные среды по методу Кастанеда или на питательную среду для накопления бруцелл.
При обследовании больных, прошедших курс лечения антибиотиками, через 1 месяц и спустя 4-6 месяцев после окончания курса антибиотикотерапии, а также больных хронической формой бруцеллеза в период обострения перед началом лечения рекомендуется проводить посевы крови, пунктатов костного мозга и лимфатических узлов на специальную питательную среду для выделения L-форм бруцелл.
Материалом для исследования методом ПЦР являются: кровь, сыворотка крови, пунктат из лимфатических узлов, синовиальная жидкость. Забор, транспортирование и хранение биологического материала для проведения ПЦР осуществляют в соответствии с действующими методическими указаниями по организации работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности.
9.1.2. Отбор и транспортирование проб сырья животного происхождения и объектов окружающей среды
Отбор проб сырья животного происхождения и объектов окружающей среды проводят с целью установления источника, факторов и путей передачи инфекции, условий, способствующих заражению, а также для организации и проведения санитарных мероприятий по локализации и ликвидации очага инфекции.
Отбор материала, его упаковка и транспортирование осуществляется с соблюдением требований безопасности работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями I-II группы патогенности (опасности).
Отбор и транспортирование проб полевого материала и сырья животного происхождения для лабораторного исследования на бруцеллез осуществляют в соответствии с нормативными правовыми и методическими документами по организации работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности, рекомендациями по правилам перевозки инфекционных материалов (WHO/HSE/EPR/2008.10), а также согласно действующим нормативным документам (ГОСТ) в зависимости от вида продукции.
9.1.3. Упаковка проб
9.2. Методы выделения возбудителя и его растворимых антигенов
9.2.1. Бактериологический метод
Работа по выделению и дифференциации бруцелл из исследуемого материала должна проводиться в условиях, исключающих возможность инфицирования персонала и обсеменения возбудителем объектов окружающей среды, в строгом соответствии с требованиями нормативных правовых и методических документов по безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности).
Характерной особенностью представителей рода Brucella является медленный рост на питательных средах, особенно в первых генерациях. При посевах крови, костного мозга и мочи культуры бруцелл обнаруживаются через 5-10 дней, а иногда через 20-30 дней после посева. При этом первые генерации культур B. abortus и B. ovis способны расти только при наличии в атмосфере повышенного содержания углекислого газа (5-10%). B. abortus 5-го, 6-го и 7-го биоваров могут расти в обычных аэробных условиях.
Для выделения культур бруцелл рекомендуются следующие среды: сывороточно-декстрозный агар, агар из картофельного настоя с добавлением сыворотки и кровяной агар (5% овечьей крови в среде), Albimi-агар, среда "Д", печеночные и мясопептонные агары и бульоны (рН сред - 6,8-7,2). Рецепты приготовления сред приведены в прилож.2. В настоящее время в практике широко используется коммерческая среда для выделения бруцелл - эритрит агар. Данная среда является высокоэффективной для выделения первой генерации возбудителя, однако при последующих пересевах на этом агаре изучаемая культура бруцелл может диссоциировать.
Посевы следует производить на предварительно проверенные питательные среды. Проверку сред осуществляют согласно нормативным правовым и методическим документам по контролю диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза.
9.2.1.1. Исследование крови и другого биологического материала.
При бактериологическом обследовании больных, прошедших курс лечения антибиотиками, через 1 месяц и спустя 4-6 месяцев после окончания курса антибиотикотерапии, а также больных хронической формой бруцеллеза в период обострения (особенно при субфебрильной температуре) перед началом лечения рекомендуется проводить посевы крови, пунктатов костного мозга и лимфатических узлов на специальные питательные среды для выделения бруцелл в L-форме (прилож.2).
Способ бактериологического посева материала для выделения L-культур идентичен методу выделения бактериальных гемокультур. Посевы выдерживаются в термостате не менее 35-40 дней.
Бруцеллы можно выделить также из костного мозга, мочи, спинномозговой жидкости, экссудата из бурситов, грудного молока, желчи, мокроты, трупного материала. Посевы производят на твердые и жидкие питательные среды. В случаях исследования загрязненного материала для задержки роста посторонней микрофлоры в среду следует добавлять генцианвиолет из расчета 1:200000. С этой целью также добавляют антибиотики, в частности полимиксин В - 3 мкг/мл и амфоглюкамин - 3 мкг/мл.
9.2.2. Биологический метод
Для выделения бруцелл из материала, загрязненного посторонней микрофлорой, и при малой концентрации бруцелл в исследуемом материале используются биопробные животные - морские свинки (массой 300-350 г) или белые мыши (массой 17-18 г). Исследуемый материал вводят подкожно в паховую область в дозах не более 0,5 мл для мышей и 1 мл для морских свинок.
Вскрытие белых мышей проводится через 20-25 дней, морских свинок - через 30-35 дней после введения исследуемого материала. Перед вскрытием у свинок следует взять кровь из сердца для исследования сыворотки в реакции агглютинации на наличие специфических антител. Для посевов у морских свинок берут лимфатические узлы (регионарные к месту введения исследуемого материала): паховый, подчелюстной, шейный, парааортальный, кусочки селезенки, печени, костный мозг, кровь, мочу; у белых мышей - лимфатические узлы: паховый, акселярный, парааортальный, подчелюстной, кусочки селезенки и печени. Лимфатические узлы, кусочки печени и селезенки помещают в стерильную чашку. Костный мозг для посева берут пипеткой из рассеченной бедренной кости. Посевы крови из сердца, а также мочи и костного мозга проводят стерильной пипеткой непосредственно на питательные среды (агар и бульон). Лимфатические узлы животных перед посевом рекомендуется надсекать ножницами. После этого каждый лимфатический узел и кусочки органов берут "уколом" стерильной деревянной палочки (палочка должна быть длиной 25-30 см, диаметром 4-5 мм с гладкой поверхностью и несколько заостренным концом) и вносят первоначально в пробирку с агаром, где той же палочкой материал раздавливают и тщательно втирают в поверхность питательной среды. Затем остатки посевного материала переносят в пробирку с бульоном. После использования палочки погружают на 1 ч в дезинфицирующий раствор (3%-й раствор перекиси водорода) или кипятят в воде 40 мин, после чего тщательно промывают, стерилизуют для последующего использования. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37°C 20-25 дней. Просмотр посевов в пробирках с агаром и бульоном проводят каждые 3-4 дня, из помутневших бульонов делают высевы в пробирки со скошенным агаром.
Результат исследования оценивается положительно при выделении хотя бы одной колонии бруцелл из организма животного или при выявлении специфических антител в сыворотках крови животных в РА в титре не менее 1:20.
Для выделения бруцелл в L-форме морских свинок рекомендуется вскрывать на 7-е, 14-е и 30-е сутки после введения исследуемого материала, так как вероятность получения изолятов в L-форме на 7-е, 14-е сутки выше, чем на 30-е сутки.
9.2.3. Методы идентификации бруцелл
Для определения принадлежности выделенных культур к роду Brucella используют следующие методы: изучение морфологии колоний, микроскопия окрашенных препаратов по Граму или Козловскому, люминесцентная микроскопия и проба со специфической сывороткой в реакции агглютинации на стекле, выявление родоспецифичных локусов методом ПЦР, ИФА.
Морфология колоний. Колонии бруцелл на агаре бесцветны, выпуклы (холмиком) с гладкой поверхностью, гомогенны, иногда с нежной зернистостью в центре колонии. С возрастом нежные и прозрачные колонии постепенно мутнеют. В падающем свете белесоватые, в проходящем - янтарно-желтого цвета.
Величина колоний может быть различной. Наряду с крупными, достигающими в диаметре 3-4 мм и больше, могут быть очень мелкие - точечные колонии диаметром 0,1-0,05 мм. Различные факторы (pH питательной среды, влажность, наличие бактериофага в культуре и др.), влияющие на биологию культуры, могут привести также к изменению внешнего вида колоний (встречаются зернистые, стекловидные колонии, растущие в толще агара, эрозированные, сухие, слизистые, радиально исчерченные и др.).
Для изучения структуры колоний целесообразно использовать стереоскопическую лупу, обычный световой микроскоп с объективом наименьшего увеличения.
Микроскопия окрашенных препаратов. При окраске по Граму бруцеллы окрашиваются в красный цвет (грамотрицательны). Окрашивание препаратов по способу Козловского: фиксированные препараты окрашивают 0,5%-м водным раствором сафранина при подогревании до появления пузырьков, промывают дистиллированной водой и докрашивают 0,5%-м водным раствором малахитовой или бриллиантовой зелени в течение 40-50 с. Бруцеллы сохраняют красную окраску сафранина. Другие бактерии окрашиваются в зеленый цвет.
Проба со специфической сывороткой. Для предварительной, быстрой идентификации культуры ставят реакцию агглютинации на стекле. На предметное стекло наносят каплю бруцеллезной поливалентной сыворотки, разведенной 1:25 0,9%-м раствором натрия хлорида, в которой эмульгируют одну петлю исследуемой культуры. В положительных случаях быстро (в течение 1 мин) наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев, в отрицательных - суспензия остается гомогенной. Для контроля исследуемую культуру эмульгируют в капле нормальной кроличьей сыворотки или 0,9%-м растворе натрия хлорида.
Люминесцентная микроскопия (см. раздел 9.5.2 "Метод флуоресцирующих антител (МФА)").
Полимеразная цепная реакция (см. раздел 9.5.6 "Полимеразная цепная реакция (ПЦР)").
Иммуноферментный анализ (см. раздел 9.5.4 "Иммуноферментный анализ (ИФА)").
9.2.4. Методы идентификации L-форм бруцелл
Для определения принадлежности выделенных L-культур к роду Brucella используют следующие методы: изучение характера роста и морфологии колоний, микроскопия нативных препаратов, проба со специфической сывороткой в реакциях слайд-агглютинации и объемной РА, а также ПЦР-анализ.
Характер роста и морфология L-форм бруцелл. Бруцеллы в L-форме могут быть изолированными или в виде нежного сплошного налета. На плотных питательных средах формируются колонии различного размера: мелкие 0,5-2 мм и крупные до 5 мм, круглые, янтарно-желтого цвета в проходящем и серо-голубоватого в падающем свете, имеют слизистую или крошковатую консистенцию, часто врастают в агар, плохо снимаются петлей. При просмотре через стереоскопическую лупу L-колонии могут иметь вид "яичницы" - плотный центр и ажурные светлые края.
Микроскопия нативных препаратов. Для изучения морфологии L-клеток отбирают характерные колонии и готовят нативные препараты: на предметное стекло наносят каплю 0,9%-го раствора натрия хлорида, в которой эмульгируют одну петлю исследуемой культуры, закрывают покровным стеклом, края заливают парафином и просматривают в световом микроскопе в фазовом контрасте с иммерсией.
По морфологии L-формы бруцелл представляют собой полиморфные клетки в виде шаров, грушевидных и неправильной формы тел от 1 до 6 мкм с цитоплазмой разной оптической плотности с вакуолями и зернистостью. Зерна-гранулы могут располагаться внутри крупных клеток, или находиться в виде свободных зернистых масс. В препарате могут находиться гетероморфные клетки от 0,2 до 0,5 мкм или близкие по морфологии к S-формам бруцелл.
Проба со специфической сывороткой. L-культуры бруцелл сохраняют антигенное родство с исходными штаммами бруцелл. Для предварительной быстрой идентификации L-культур бруцелл ставят реакцию агглютинации на стекле со специфической агглютинирующей поливалентной сывороткой в разведении 1:25. Необходимо учитывать, что L-культуры бруцелл очень плохо эмульгируются, что затрудняет учет реакции. Рекомендуется сначала петлю культуры тщательно растереть стеклянной палочкой в небольшом количестве 0,9%-го раствора натрия хлорида и после этого каплю эмульсии перенести в каплю специфической сыворотки на предметном стекле и параллельно в каплю нормальной кроличьей сыворотки или 0,9%-го раствора натрия хлорида в качестве контроля.
Для дальнейшего изучения бруцелл в L-форме необходимо проводить их реверсию на питательных средах без трансформирующего агента или на лабораторных животных.
9.2.5. Методы дифференциации бруцелл
После идентификации культуры бруцелл проверяют на диссоциацию с применением следующих тестов: проба с трипафлавином, реакция термоагглютинации (проба с нагреванием), проба Уайт-Вильсона. Дифференциации подлежат культуры бруцелл, находящиеся только в S-форме.
Проба с раствором трипафлавина. На предметное стекло наносят каплю солевого (0,85%-го) раствора трипафлавина 1:500, в котором эмульгируют испытуемую культуру. У диссоциированных культур через 1-2 минуты наступает агглютинация с образованием хлопьев. Взвесь из культур в S-форме остается гомогенной.
Проба Уайт-Вильсона. Проба основана на способности диссоциированных колоний окрашиваться красителем кристаллическим фиолетовым. Для постановки пробы на агаровую пластинку со средой Альбими проводят посев взвеси исследуемой культуры в концентрации, позволяющей получить изолированные колонии. Посевы инкубируют при 37°C в течение 2-4 суток. Когда сформируются колонии на поверхность агара наливают раствор кристаллического фиолетового в разведении 1:2000 (водный раствор) и выдерживают в течение 5 мин, после чего краску отбирают при помощи пипетки. Колонии культур после окрашивания просматривают с помощью лупы или стереоскопического микроскопа. При этом S-колонии остаются неокрашенными, а диссоциированные принимают окраску красителя: от темно-фиолетового до светло-синего.
Для получения доступа к полной версии без ограничений вы можете выбрать подходящий тариф или активировать демо-доступ.