ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе.

ГОСТ 10444.1-84

Группа Н09

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

КОНСЕРВЫ

Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

Canned food. Preparation of reagent solutions, dyes, indicators and culture media for microbiological analysis

МКС 07.100.30     

ОКСТУ 9109

Дата введения 1985-07-01

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 17.01.84 дата введения установлена 01.07.85

Ограничение срока действия снято по протоколу N 4-93 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 4-94)

ВЗАМЕН ГОСТ 10444.1-75

ИЗДАНИЕ (апрель 2010 г.) с Изменением N 1, утвержденным в июле 1990 г. (ИУС 11-90)

Настоящий стандарт распространяется на методы приготовления растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Для приготовления растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред (если нет специальных указаний) применяют:

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72;

реактивы квалификации х.ч. и ч.д.а. по ГОСТ 13867-68;

вспомогательные реактивы и растворы по ГОСТ 4517-87;

растворы индикаторов по ГОСТ 4919.1-77.

1.2. Растворы реактивов, красок, индикаторов приготовляют, используя стеклянную, лабораторную, мерную посуду, вымеренную для слива, класса А; для приготовления питательных сред (если нет специальных указаний) используют стеклянную лабораторную мерную посуду, вымеренную для слива, класса Б.

1.3. Питательные среды приготовляют в эмалированной или стеклянной посуде. Новую стеклянную посуду, в том числе колбы, пробирки, пипетки, бактериологические чашки Петри, перед употреблением выдерживают в течение 12-24 ч в растворе соляной кислоты

(HCl)=0,25-0,50 моль/дм

, промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой и автоклавируют при температуре (121±1) °С в течение 1 ч.

1.4. Если в технологии приготовления питательных сред не указаны условия растворения питательных сред или компонентов, то их растворяют при перемешивании в воде комнатной температуры до полного растворения не менее 15 мин и затем, при необходимости, нагревают до растворения среды или ее компонентов.

1.5. Необходимое значение рН питательных сред устанавливают с помощью раствора гидроокиси натрия концентрации 100 г/дм

или раствора лимонной кислоты концентрации 200 г/дм

, или раствора соляной кислоты концентрации 36,5 г/дм

, по каплям прибавляя при перемешивании раствор к питательной среде и определяя значение рН в периодически отбираемой пробе потенциометрически или с помощью индикатора. Значение рН питательных сред при стерилизации может изменяться. При подщелачивании среды щелочью рН после кипячения и стерилизации снижается примерно на 0,2, а при приготовлении сред с настоем печени - на 0,3-0,4. Поэтому при приготовлении сред устанавливают рН на 0,2-0,4 выше заданного, кипятят, пока рН не понизится на 0,2-0,3, снова проверяют рН, исправляют, при необходимости, и стерилизуют в автоклаве. Обязательно проверяют рН после стерилизации.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

1.6. Питательные среды, если нет специальных указаний, стерилизуют по ГОСТ 26668-85.

1.7. Готовые питательные среды хранят, если нет специальных указаний, при комнатной температуре не более 3 сут и при температуре около 4 °С не более одного месяца.

 2. АППАРАТУРА

Для приготовления растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред применяются:

автоклав для стерилизации питательных сред;

стерилизатор паровой медицинский по ГОСТ 19569-89*;

________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51935-2002.

пластины асбестовые фильтрующие и стерилизующие по ГОСТ 480-78;

баня водяная с терморегулятором, позволяющая поддерживать температуру от 20 до 100 °С с отклонением до 1 °С от заданной;

весы лабораторные по ГОСТ 24104-88*;

________________

* С 1 июля 2010 г. введен в действие ГОСТ Р 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.

воронки для горячего фильтрования;

воронки стеклянные по ГОСТ 25336-82;

гомогенизатор или смеситель лабораторный;

горелка газовая или спиртовка по ГОСТ 25336-82;

дистиллятор электрический марки Д N 9;

капельницы;

кастрюли разные;

колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости по ГОСТ 25336-82;

кюветы разные для окрашивания препаратов;

марля медицинская по ГОСТ 9412-93;

мясорубка по ГОСТ 4025-95;

ножи;

ножницы;

палочки стеклянные по ГОСТ 25336-82;

пинцеты по ГОСТ 21241-89;

пипетки Мора;

пипетки разной вместимости;

плитка электрическая по ГОСТ 14919-83;

рН-метр;

пробирки разной вместимости по ГОСТ 25336-82;

промывалка;

рефрактометр;

ареометр по ГОСТ 18481-81;

сетки асбестовые;

стекла часовые;

ступки фарфоровые по ГОСТ 9147-80;

термометры химические от 0 до 50 °С и от 50 до 100 °С по ГОСТ 28498-90;

термостаты, позволяющие поддерживать температуру в пределах от 28 до 55 °С с отклонением до 0,5 °С от заданной;

фильтры Зейтца;

фильтры мембранные N 2;

флаконы вместимостью 100-200 см

;

холодильник по ГОСТ 16317-87;

центрифуга, обеспечивающая частоту вращения 50 с

(3000 об/мин);

цилиндры разной вместимости по ГОСТ 1770-74;

часы песочные ОСТ 25-11-38-84*;

чашки Петри бактериологические по ГОСТ 25336-82;

шкаф сушильный;

шпатели металлические;

шпатели стеклянные;

шприцы по ГОСТ 22967-90.

 3. РЕАКТИВЫ, РАСТВОРЫ И МАТЕРИАЛЫ

Для приготовления растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред применяются:

агар микробиологический по ГОСТ 17206-96;

агар сухой питательный;

аммоний лимоннокислый;

аммоний щавелевокислый 1-водный по ГОСТ 5712-78;

ацетон по ГОСТ 2603-79;

бром по ГОСТ 4109-79;

бромкрезолпурпур;

бромтимоловый синий;

водорода пероксид по ГОСТ 10929-76;

бумага фильтровальная по ГОСТ 12026-76;

вата гигроскопическая медицинская по ГОСТ 5556-81;

вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

глицин;

глицерин по ГОСТ 6824-96;

глюкоза по ГОСТ 6038-79;

дрожжи хлебопекарные прессованные по ГОСТ 171-81;

желатин пищевой по ГОСТ 11293-89;

железоаммонийные квасцы;

железо (II) сернокислое 7-водное по ГОСТ 4148-78;

железо треххлористое 6-водное по ГОСТ 4147-74;

инфузорная земля;

йод по ГОСТ 4159-79;

калий азотнокислый по ГОСТ 4217-77;

калий двухромовокислый по ГОСТ 4220-75;

калий сернокислый по ГОСТ 4145-74;

калий йодистый по ГОСТ 4232-74;

калий углекислый по ГОСТ 10690-73;

калия теллурит;

калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75 или двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493-75;

кальций углекислый по ГОСТ 4530-76;

капуста по ГОСТ 1724-85;

картофель по ГОСТ 7176-85;

кислота аскорбиновая;

кислота лимонная пищевая по ГОСТ 908-2004;

кислота молочная пищевая по ГОСТ 490-2006;

кислота серная по ГОСТ 4204-77;

кислота соляная по ГОСТ 3118-77;

кислота уксусная по ГОСТ 61-75;

крахмал растворимый по ГОСТ 10163-76;

кристаллический фиолетовый;

кровь кролика;

кровь крупного рогатого скота, лошади или барана;

лакмус или лакмоид;

лактоза;

литий хлористый 6-водный;

маннит;

масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164-78;

медь (II) сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165-78;

молоко коровье пастеризованное по ГОСТ 13277-79*;

________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52090-2003.

мясо говядина по ГОСТ 779-55, мясо баранина по ГОСТ 1935-55*;

________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52843-2007.

мясо-телятина по ГОСТ 779-55;

мясо-конина по ГОСТ 27095-86;

мука кукурузная по ГОСТ 14176-69;

натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77;

натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280-76;

натрия пируват;

натрий сернистокислый;

натрий углекислый по ГОСТ 83-79;

натрий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 11773-76 и однозамещенный 2-водный по ГОСТ 245-76;

натрий уксуснокислый 3-х водный по ГОСТ 199-78;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77;

натрия азид;

1-нафтол;

парадиметиламинобензальдегид;

парафин по ГОСТ 23683-89;

панкреатин (порошок, в 1 г - 25 ед.);

поджелудочная железа убойного скота;

пирогаллол;

плазма крови кроличья или человеческая;

пепсин;

пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805-76;

печень говяжья, телячья, кроличья, не содержащая ингибиторов, роста микроорганизмов;

рыба треска или пикша, судак, щука по ГОСТ 814-96;

сахароза по ГОСТ 5833-75;

сафранин: О или Т;

солод ячменный;

соль закиси железа и аммония двойная сернокислая - соль Мора по ГОСТ 4208-72;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67*;

____________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000.

спирт этиловый сырец по ГОСТ 131-67*;

 ________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52193-2003.

сок томатный по ГОСТ 937-91*;

________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52183-2003.

трипсин;

триптон;

триптический гидролизат казеина;

триптофан;

2, 3, 5-трифенилтетразолиум хлорид;

уголь активный по ГОСТ 4453-74;

фенолфталеин (индикатор);

фуксин (основной и кислый);

хлороформ по ГОСТ 20015-88;

цистеина гидрохлорид;

экстракт дрожжевой сухой;

экстракт мясной;

яйца куриные по ГОСТ 27583-88*.

________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52121-2003.

 4. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ РЕАКТИВОВ, КРАСОК, ИНДИКАТОРОВ И КОМПОНЕНТОВ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

4.1. Агар голодный

2,0 г агара растворяют в 98 см

дистиллированной воды, стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

Применяют для наслаивания на посевы с целью предотвращения соприкосновения посевов с кислородом воздуха.

4.2. Взвесь (эмульсия) яично-желточная в физиологическом растворе.

Из яйца, протертого с поверхности спиртом с объемной долей 70%, извлекают пипеткой желток и смешивают его со 100 см

физиологического раствора. Желточную эмульсию приготовляют аналогично, но берут два желтка и смешивают их с 10 см

физиологического раствора.

Добавляют к питательным средам для определения лецитиназной активности микроорганизмов.

Допускается яично-желточную эмульсию приготовлять следующим образом: свежие куриные яйца моют, ополаскивают холодной водой, опускают в раствор этилового спирта с объемной долей 70% и высушивают. Соблюдая правила асептики, разбивают каждое яйцо в стерильную чашку Петри и отделяют желток от белка. Помещают желток в стерильную колбу или флакон с четырьмя объемами стерильной воды и энергично перемешивают. Нагревают смесь на водяной бане при температуре (45±1) °С в течение 2 ч, оставляют на 18-24 ч при температуре от 0 до плюс 5 °С для формирования осадка.

Соблюдая правила асептики, собирают эмульсию над осадком. Эмульсию хранят при температуре от 0 до плюс 5 °С не более 72 ч.

4.3. Вода бромная

3-3,5 см

брома растворяют в 100 см

дистиллированной воды. Приготовляют бромную воду в вытяжном шкафу. Хранят в темной склянке с притертой пробкой в защищенном от света месте.

Применяют в качестве индикатора при определении содержания триптофана в питательных средах. При наличии триптофана в присутствии 3-4 капель бромной воды жидкость принимает розово-фиолетовую окраску.

4.2, 4.3. (Измененная редакция, Изм. N 1).

4.4. Вода пептонная

1 г пептона растворяют в 1 дм

дистиллированной воды, разливают по 10 см

в пробирки и по 100 см

в колбы. Затем стерилизуют 20 мин при температуре (121±1) °С.

4.5. Глюкоза концентрации 5, 10, 100 и 200 г/дм

, водные растворы

0,5; 1; 10; 20 г глюкозы переносят, смывая стерильной дистиллированной водой, в мерную колбу вместимостью 100 см

и доводят объем до метки. Разливают приготовленный раствор глюкозы в стерильные пробирки и стерилизуют при температуре (112±1) °С в течение 15 мин или при температуре (100±1) °С в течение 3 сут по 30 мин, или фильтрованием через мембранный фильтр.

Применяют в качестве источника углеводов в питательных средах и восстанавливающего вещества в питательных средах для анаэробных микроорганизмов.

4.6. Индикатор Андреде

0,5 г кислого фуксина растворяют в 100 см

дистиллированной воды, прибавляют 16,4 см

раствора гидроокиси натрия

(NaOH)=1 моль/дм

и стерилизуют при температуре (100±1) °С в течение 5 мин. Индикатор должен иметь соломенно-желтый цвет. Хранят во флаконе из темного стекла (с притертой пробкой).

Применяют для приготовления среды Гисса.

4.7. Индикатор бромкрезолпурпур - щелочной раствор, готовят по ГОСТ 4919.1-77.

Применяют для определения кислотообразующей способности микроорганизмов.

4.8. Индикатор бромтимоловый синий - щелочной раствор, готовят по ГОСТ 4919.1-77.

Применяют для контроля рН питательных сред.

4.9. Кальций углекислый стерильный

Фасуют от 2 до 100 г углекислого кальция в пробирки, колбы или флаконы и стерилизуют воздухом по ГОСТ 26668-85.

Добавляют к питательным средам, предназначенным для посева в них кислотных продуктов.

4.10. Раствор аскорбиновой кислоты концентрации 50 г/дм

готовят по ГОСТ 4517-87 и стерилизуют фильтрованием через мембранный фильтр N 2.

Применяют в качестве восстановителя, связывающего кислород в питательных средах для анаэробных микроорганизмов.

4.11. Раствор лимонной кислоты концентрации 200 г/дм

.

20 г лимонной кислоты переносят в мерную колбу, доводят водой объем до 100 см

, растворяют и разливают в пробирки или колбы, стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

Применяют для подкисления питательных сред.

4.10, 4.11. (Измененная редакция, Изм. N 1).

4.12. Кусочки мяса, фарша, мясная вода, мясной отвар

Освобожденное от костей, жира, сухожилий мясо говядины или конины для приготовления мясного отвара режут на мелкие кусочки или для приготовления мясной воды пропускают через мясорубку, заливают водой из расчета 1 дм

воды на 500 г мяса и оставляют на ночь в холодильнике. На следующий день смесь мяса с водой медленно нагревают до кипения и кипятят до готовности, периодически помешивая и доливая воду до первоначального объема. Небольшое количество смеси (до 5 дм

) можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания частичек мяса.

Большое количество лучше кипятить в котлах с паровой рубашкой. Для определения готовности смеси фильтруют сначала небольшое количество ее в пробирку через бумажный фильтр; если жидкость прозрачна, кипячение прекращают. Смесь вновь оставляют до следующего дня в холодильнике. рН охлажденной смеси доводят до 7,0-7,2, фильтруют через ткань, отжимая из кусочков мяса или фарша всю жидкость. Мясную воду или мясной отвар и кусочки мяса или фарша стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

Применяют в качестве компонентов питательных сред.

4.13. Кусочки печени, печеночная вода, печеночные отвар и бульон

Свежую печень освобождают от пленок и жира. Для приготовления печеночного отвара режут на кусочки массой 30-40 г, для приготовления печеночной воды пропускают через мясорубку. Печень заливают водой из расчета 1 дм

воды на 500 г печени, выдерживают при температуре от 4 до 8 °С в течение 2 ч и кипятят в течение 20 мин. После кипячения устанавливают рН 7,0-7,2 и вновь кипятят в течение 10 мин. Смесь процеживают через ткань, жидкость используют для приготовления воды, отвара или бульона. Устанавливают рН жидкости 7,0-7,2 и доводят объем жидкости до первоначального. Печеночные воду или отвар стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин. Для приготовления печеночного бульона к печеночной жидкости перед стерилизацией добавляют пептон из расчета 1 г на 100 см

жидкости и поваренную соль из расчета 0,5 г на 100 см

печеночной жидкости (контролируя рН 7,0-7,2), разливают во флаконы, колбы или пробирки и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

Кусочки печени разрезают на более мелкие по 1,5-3 г, заливают раствором двууглекислого натрия и кипятят в течение 10-15 мин (не допуская бурного кипения). После этого кусочки печени промывают в дуршлаге под струей водопроводной воды в течение 1 ч и несколько раз дистиллированной водой. Кусочки печени: должны иметь рН 7,0-7,2; значение рН печени контролируют погружением кусочков в индикатор; бромтимоловый синий индикатор должен иметь сине-зеленую окраску. Кусочки печени фасуют в пробирки, колбы или флаконы и стерилизуют при (121±1) °С в течение 20 мин. Применяют в качестве компонентов питательных сред для анаэробных микроорганизмов.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.14. Лакмус водно-спиртовой раствор (лакмусовая настойка), приготовляют по ГОСТ 4919.1-77.

Добавляют в питательные среды для определения способности микроорганизмов к редукции лакмуса.

4.15. Масло вазелиновое

Масло разливают по 20-50 см

в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

Применяют для наслаивания на жидкие питательные среды для анаэробных микроорганизмов.

4.16. Молоко обезжиренное

Молоко доводят до кипения, оставляют на сутки в холодильнике, освобождают от сливок, вторично доводят до кипения, вновь оставляют на 1 сут в холодильнике и вторично снимают верхний слой. Обезжиренное молоко может быть приготовлено путем сепарирования. Обезжиренное молоко разливают в стерильную посуду и стерилизуют при температуре 100 °С в течение 3 сут по 30 мин или однократно при температуре (116±1) °С в течение 20 мин. После стерилизации молоко не должно принимать коричневый оттенок.

Обезжиренное молоко применяют в качестве компонента питательных сред.

4.17. Раствор гидроокиси натрия концентрации 100 г/дм

готовят по ГОСТ 4517-87.

Применяют для подщелачивания питательных сред.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.18. Пептонно-солевой раствор, готовят по ГОСТ 26669-85.

Применяют для приготовления разведений.

4.19. Пирогаллол, щелочной раствор, готовят по ГОСТ 4517-87.

Применяют для поглощения кислорода в емкостях, предназначенных для анаэробных микроорганизмов.

4.20. Цитратная плазма крови

5 см

свежеполученной крови, взятой из сердца кролика, помещают в центрифужную пробирку с 1 см

раствора лимоннокислого натрия концентрации 50 г/дм

(5 г лимоннокислого натрия переносят, смывая дистиллированной водой, в мерную колбу вместимостью 100 см

и доводят объем до метки). Центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин или оставляют на холоде. Плазму отделяют, разводят физиологическим раствором 1:4 и разливают в стерильные пробирки по 0,5 см

.

Плазма кролика может быть заменена человеческой. Не допускается использовать плазму крови человека, которому незадолго до взятия крови вводилась глюкоза.

Человеческая плазма не может быть использована, если исследуемая культура выращивалась в атмосфере углекислоты. В обоих случаях происходит угнетение реакции плазмокоагуляции. Допускается использовать сухую цитратную плазму кролика.

Применяют для определения коагулазной способности микроорганизмов.

4.21. Растворы для определения сульфитредуцирующей способности клостридий:

сернистокислый натрий - раствор концентрации 10 г/дм

, сернокислое железо - раствор концентрации 4 г/дм

.

Оба раствора стерилизуют раздельно при температуре (115±1) °С в течение 30 мин.

Добавляют по 5 см

каждого раствора в 100 см

охлажденной, регенерированной питательной среды для клостридий непосредственно перед посевом.

4.22. Раствор Люголя

2 г йодистого калия растворяют в 5-10 см

воды в мерной колбе вместимостью 300 см

, добавляя 1 г кристаллического йода, оставляют на несколько часов до полного растворения йода и после этого доводят водой объем раствора до метки.

Применяют для контроля степени осахаривания сусла.

4.23. Раствор I-нафтола

5 г I-нафтола, имеющего точку плавления 92,5 °С, вносят в мерную колбу вместимостью 100 см

и доливают этиловым спиртом с объемной долей 96% до метки.

Раствор применяют свежеприготовленным для контроля ацетилметилкарбинола.

4.24. Раствор панкреатина

4 г панкреатина растворяют в 100 см

физиологического раствора и оставляют при температуре (4±1) °С на 16-17 ч. Перед применением полученную жидкость фильтруют через плотный бумажный фильтр, а затем через стерилизующую пластинку фильтра Зейтца до получения прозрачной опалесцирующей жидкости. Готовый раствор панкреатина может сохраняться при температуре (4±1) °С в течение двух недель.

Полученный раствор в объеме 0,5 см

не должен убивать белую мышь массой 16-18 г при внутривенном введении. При подкожном введении морским свинкам 0,2 см

раствора обычно появляется некроз участка кожи размером 0,5х0,5 см.

Раствор применяют для активации протоксина возбудителей ботулизма.

4.25. Растворы и реактивы для окраски по Граму

4.25.1. Основной красящий раствор по Хукеру

2 г кристалл-виолета с массовой долей сухих веществ 85-90% растворяют в 20 см

спирта;

0,8 г щавелевокислого аммония растворяют в 80 см

воды; растворы смешивают и выдерживают в течение 24 ч при комнатной температуре перед употреблением.

4.25.2. Йодный раствор по Бурке

2 г йодистого калия растворяют в 5-10 см

воды в мерной колбе вместимостью 100 см

, добавляют 1 г кристаллического йода, оставляют на несколько часов до полного растворения йода и после этого доводят водой объем раствора до метки.

4.25.3. Контрастный красящий раствор

0,25 г сафранина растворяют в 10 см

спирта и полученный раствор смешивают со 100 см

воды.

4.25.4. Допускается использовать: в качестве основного красящего раствора - водный раствор кристаллического фиолетового концентрации 10 г/дм

; в качестве контрастного красящего раствора - водный раствор сафранина Т концентрации 5 г/дм

или спиртовой раствор основного фуксина концентрации 5 г/дм

.