ГОСТ Р 51650-2000 Продукты пищевые. Методы определения массовой доли бенз(а)пирена.

ГОСТ Р 51650-2000

Группа Н09

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Методы определения массовой доли бенз(а)пирена

Food stuffs. Methods for determination of benz(a)pyren fraction of total mass

ОКС 67.040

ОКСТУ 9109

Дата введения 2001-07-01

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Государственным научно-исследовательским институтом биосинтеза белковых веществ Министерства экономики Российской Федерации (ГОСНИИСИНТЕЗБЕЛОК), Институтом питания Российской академии медицинских наук (ИП РАМН), Всероссийским онкологическим научным центром Российской Академии медицинских наук (ВОНЦ РАМН)

ВНЕСЕН Техническим комитетом ТК 326 "Биотехнологическая продукция немедицинского назначения" и Техническим комитетом ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 3 октября 2000 г. N 247-ст

3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

      1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на продовольственное сырье, пищевые продукты, пищевые и вкусовые добавки и устанавливает методы определения массовой доли бенз(а)пирена с применением спектрофлуориметрии при низкой и комнатной температуре и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

      2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартной безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартной безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартной безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 427-75 Линейка измерительная металлическая. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 2603-79 Ацетон. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 5777-84 Калий марганцовокислый технический. Технические условия

ГОСТ 5789-78 Толуол. Технические условия

ГОСТ 5815-77 Ангидрид уксусный. Технические условия

ГОСТ 5955-75 Бензол. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 20289-74 Диметилформамид. Технические условия

ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 24363-80 Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29224-91 Посуда лабораторная стеклянная. Термометры жидкостные стеклянные лабораторные. Принципы устройства, конструирования и применения

ГОСТ 29228-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания

ГОСТ 29229-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные с временем ожидания 15 с

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

      3 Отбор проб

3.1 Отбор и подготовку лабораторной пробы к испытаниям проводят в соответствии с нормативным документом на испытуемый вид продукции.

Из объединенной лабораторной пробы для испытания отбирают две параллельные навески.

      4 Метод низкотемпературной спектрофлуориметрии

Сущность метода заключается в экстракции углеводородов, в том числе бенз(а)пирена, гексаном из продукта, предварительно обработанного спиртовым раствором едкого калия, выделении фракции полициклических углеводородов тонкослойной хроматографией на окиси алюминия и количественном определении в полученной фракции бенз(а)пирена методом низкотемпературной спектрофлуориметрии.

Диапазон определяемых величин массовой доли бенз(а)пирена в анализируемых продуктах - 0,0002-0,005 мг/кг или 0,2х10

-5,0х10

%. Оптимальный диапазон определения массовых концентраций бенз(а)пирена в растворе составляет 0,01-0,05 мкг/см

.

      4.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Спектрофотометр флуоресцентный с криогенной приставкой для выполнения измерений при температуре жидкого азота (-196) °С и спектральным диапазоном длин волн 360-420 нм.

Осветитель ультрафиолетовый типа "Хроматоскоп" со спектральным диапазоном 250-700 нм и лампой типа БУВ-15 в качестве источника УФ-излучения.

Шкаф сушильный лабораторный, обеспечивающий температуру (250±4) °С.

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104*.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Испаритель ротационный ИР-1М.

Баня водяная.

Электроплитка бытовая с закрытой спиралью и регулятором нагревания по ГОСТ 14919.

Сосуд Дьюара для жидкого азота любой вместимости.

Ванны для хроматографирования (фотокюветы эмалированные).

Пластины стеклянные размером 15х30 и 20х40 см.

Колбы К-1-250-29/32 ТХС, К-1-100-29/32 ТХС, К-1-500-29/32 ТХС или П-1-500-29/32 ТХС по ГОСТ 25336.

Холодильники ХПТ-1-300-14/23 ХС или ХПТ-1-400-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Холодильники ХПТ-2-400-29/32 ХС и ХПТ-1-300-29/32 или ХПТ-400-29/32 ХС по ГОСТ 25336.

Дефлегматор 250-19/26-29/32 ТС или дефлегматор 300-19/26-29/32 ТС по ГОСТ 25336.

Пробирки стеклянные П2-10-180 ХС по ГОСТ 25336.

Алонж АИО-14/23-50 ТС по ГОСТ 25336.

Насадка П-1-19/26-14/23 ТС или Н2-19/23 по ГОСТ 25336.

Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.

Пипетки вместимостью 1, 2, 5, 10 см

по ГОСТ 29228 и ГОСТ 29229.

Воронка ВФО-32-ПОР 100-14/23 ХС или ВФО-32-ПОР 160-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Пробирки мерные П-2-15-14/23 ХС по ГОСТ 1770.

Воронка делительная ВД-1-500 или ВД-3-500 по ГОСТ 25336.

Цилиндры мерные 1-100, 1-250 или 3-100, 3-250 по ГОСТ 25336.

Стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-14/8, или СВ-19/9, или СВ-24/10, или СВ-34/12 по ГОСТ 25336.

Термометр с пределами измерения температуры 0-250 °С с ценой деления 1 °С по ГОСТ 29224.

Линейка измерительная с ценой деления 0,1 см по ГОСТ 427.

Колбы мерные 2-100-2 по ГОСТ 25336.

Капилляры стеклянные, палочки стеклянные.

н.октан, ч., по нормативному документу [1].

н.гексан, ч., по нормативному документу [2].

Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300 или спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652.

Эфир петролейный фракция 40-70 °С по нормативному документу [3].

Хлороформ по ГОСТ 20015.

Бензол по ГОСТ 5955.

Алюминия окись для хроматографии 2 степени активности по нормативному документу [4].

Калия гидроокись по ГОСТ 24363.

Бенз(а)пирен, содержание основного вещества не менее 98%.

1,12-Бензперилен, содержание основного вещества не менее 98%.

Азот жидкий по ГОСТ 9293.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных.

      4.2 Подготовка к испытанию

4.2.1 Очистка растворителей

Растворители (н.октан, этиловый спирт, петролейный эфир, хлороформ и н.гексан) перегоняют общепринятым способом с дефлегматором.

4.2.2 Подготовка окиси алюминия

Окись алюминия высушивают в сушильном шкафу при температуре (250±4) °С в течение 4 ч и хранят в сосуде с пришлифованной пробкой.

4.2.3 Приготовление раствора бенз(а)пирена для тонкослойной хроматографии (раствор "свидетель").

В бюксу отвешивают около 10 мг бенз(а)пирена, приливают несколько миллилитров петролейного эфира до полного растворения взятой навески.

Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см

и доводят объем раствора до метки петролейным эфиром. Срок хранения раствора не более трех месяцев в холодильнике.

4.2.4 Приготовление стандартного раствора бенз(а)пирена

В бюксу отвешивают (10,0±0,2) мг бенз(а)пирена, приливают несколько миллилитров н.октана до полного растворения взятой навески. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 см

и доводят до метки н.октаном. Массовая концентрация бенз(а)пирена в полученном растворе 100 мкг/см

. Раствор хранят в холодильнике. Срок годности раствора не более трех месяцев.

4.2.5 Приготовление рабочих растворов бенз(а)пирена

Рабочие растворы бенз(а)пирена массовой концентрации 0,1; 0,04 и 0,02 мкг/см

в н.октане готовят последовательным разведением исходного стандартного раствора бенз(а)пирена, приготовленного по 4.2.4, в мерных колбах с притертой пробкой вместимостью 100 см

. Растворы хранят в холодильнике. Срок годности растворов не более одного месяца.

4.2.6 Приготовление стандартного раствора 1,12-бензперилена (внутренний стандарт)

Для приготовления исходного раствора в бюксу отвешивают (10,0±0,2) мг 1,12-бензперилена, приливают несколько миллилитров н.октана до полного растворения взятой навески. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 см

и доводят до метки н.октаном. Массовая концентрация 1,12-бензперилена в полученном растворе 100 мкг/см

. Раствор хранят в холодильнике. Срок годности раствора не более трех месяцев.

4.2.7 Приготовление рабочих растворов 1,12-бензперилена (растворы внутреннего стандарта)

Рабочие растворы 1,12-бензперилена массовой концентрации 0,01; 0,005; 0,002 и 0,001 мкг/см

готовят в н.октане последовательным разведением исходного стандартного раствора, приготовленного по 4.2.6, в мерных колбах с притертой пробкой вместимостью 100 см

. Растворы хранят в холодильнике. Срок годности растворов не более одного месяца.

      4.3 Проведение испытания

4.3.1 Выделение бенз(а)пирена из продукта

В круглодонную колбу вместимостью 500 см

помещают навеску продукта массой 25 г, добавляют в колбу 20 см

дистиллированной воды, 200 см

этилового спирта и 20 г гидроокиси калия. Содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане при кипении реакционной смеси в течение 3 ч. Затем в колбу через холодильник добавляют 150 см

воды; колбу снимают с бани и охлаждают до комнатной температуры.

После охлаждения жидкую фазу реакционной смеси декантацией переносят в делительную воронку, оставляя остаток продукта в колбе. В колбу с остатком добавляют 150 см

н.гексана, содержимое колбы энергично перемешивают и н.гексан декантируют в делительную воронку.

Воронку закрывают пробкой и энергично встряхивают, затем закрепляют в штативе и оставляют для расслаивания жидкостей. Для разделения образовавшейся эмульсии к смеси в делительной воронке добавляют 20 см

этилового спирта. После расслаивания нижнюю водно-спиртовую фазу сливают обратно в колбу с осадком, а гексановый экстракт переливают в колбу вместимостью 500 см

.

Такую обработку реакционной смеси проводят еще два раза, используя для экстракции н.гексан по 100 см

и этиловый спирт для расслаивания эмульсии, порциями по 20 см

.

По окончании экстракции остаток в колбе и гидролизат отбрасывают, а экстракт промывают в делительной воронке дистиллированной водой три раза по 50 см

и упаривают порциями в предварительно взвешенной с точностью до второго знака после запятой круглодонной колбе вместимостью 250 см

на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 60 °С. Колбу с экстрактом оставляют в вытяжном шкафу для удаления следов растворителя, после чего вновь взвешивают. По разности между взвешиваниями определяют массу выделенного экстракта.

От экстракта в колбе отбирают

часть в бюксу, не взвешивая. Колбу с остатком экстракта взвешивают. В бюксу с частью экстракта добавляют 0,1-0,2 см

раствора "свидетеля" бенз(а)пирена, приготовленного по 4.2.3. Содержимое бюксы и остаток в колбе растворяют в небольшом объеме петролейного эфира.

Для хроматографического разделения экстракта на стеклянную пластину размером 20х40 см равномерно насыпают окись алюминия. Затем с помощью стеклянной палочки, разделенной на три части (14, 1 и 3 см) резиновыми колечками толщиной 1 мм и шириной 3 мм, тщательно разравнивают окись алюминия.

Полученные растворы количественно наносят на подготовленную пластину стеклянными капиллярами: на узкую часть - раствор из бюксы ("свидетель"), на широкую - экстракт продукта из колбы. Растворы наносят равномерно сплошной полосой, отступив от нижнего края пластины 7-8 см.

Пластину помещают в ванну для хроматографирования под небольшим 20°-25° углом, наливают петролейный эфир так, чтобы он не доходил до линии нанесения пробы. Ванну накрывают стеклом и проводят хроматографию, доводя фронт растворителя до верхнего края пластины.

Не высушивая пластину, облучают ее ультрафиолетовым светом и по светящейся полосе "свидетеля" определяют место нахождения бенз(а)пирена в исследуемой пробе. Отмечают границы полосы бенз(а)пирена на хроматограмме исследуемой пробы. Пластину высушивают на воздухе в вытяжном шкафу.

Отмеченную на хроматограмме исследуемой пробы полоску окиси алюминия с помощью предметного стекла снимают с пластины и количественно переносят на пористую пластину фильтрующей воронки. Воронку соединяют с круглодонной колбой вместимостью 100 см

и бенз(а)пирен элюируют с окиси алюминия 50 см

бензола, добавляя бензол небольшими порциями и перемешивая окись алюминия на воронке палочкой. Бензол упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 60 °С. Остаток в колбе октаном количественно переносят в пробирку. Объем раствора в пробирке не должен превышать 5 см

.

При анализе некоторых продуктов не происходит полного и четкого разделения флуоресцирующих компонентов образца при первичном хроматографировании выделенного из продукта экстракта. В этом случае на пластине выделяют более широкую полоску окиси алюминия на уровне "свидетеля"; бенз(а)пирен элюируют с окиси алюминия бензолом так, как описано выше, и остаток после упаривания растворяют в этиловом спирте и полученный спиртовой экстракт повторно хроматографируют.

Для хроматографического разделения спиртового экстракта используют пластину размером 15х30 см толщиной слоя окиси алюминия 0,3 мм. На пластине отделяют две полосы шириной 10 и 3 см. На широкую часть пластины наносят с помощью стеклянного капилляра спиртовой экстракт анализируемого продукта, на узкую - раствор бенз(а)пирена в петролейном эфире (раствор "свидетель"). Пластину помещают в ванну под углом 20-25° и проводят хроматографию в хлороформе, доводя фронт растворителя до верхнего края пластины. В ультрафиолетовом свете отмечают по "свидетелю" полосу окиси алюминия с бенз(а)пиреном исследуемого продукта. Затем бенз(а)пирен элюируют с окиси алюминия бензолом и проводят все дальнейшие операции так, как указано выше.

Раствор бенз(а)пирена в н.октане переносят в пробирку. Объем раствора не должен превышать 5 см

при исходной навеске продукта 25 г.

В полученном растворе (экстракте) определяют содержание бенз(а)пирена методом низкотемпературной спектрофлуориметрии, используя для количественной оценки метод добавок или метод внутреннего

 стандарта.

4.3.2 Определение содержания бенз(а)пирена в растворе (экстракте), полученном по 4.3.1, методом добавок.

В три пробирки наливают пипеткой по 1 см

полученного раствора бенз(а)пирена в н.октане. Затем в первую пробирку приливают 2 см

н.октана. Во вторую пробирку приливают 1,5 см

н.октана и 0,5 см

рабочего раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 0,1 мкг/см

, приготовленного по 4.2.5. В третью пробирку вносят 1 см

н.октана и 1 см

того же рабочего раствора бенз(а)пирена, что и во вторую пробирку.

Спектрофлуориметрический анализ начинают с третьей пробирки. Для этого третью пробирку помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом перед входной щелью спектрофотометра; устанавливают аналитическую линию флуоресценции бенз(а)пирена 403 нм при длине волны возбуждающего света 367 нм. Регулировкой коэффициента усиления и раскрытием щели, а также одновременной юстировкой пробирки в сосуде Дьюара добиваются максимального сигнала по регистрирующему прибору спектрофотометра (до 50-80%), после чего записывают спектрограмму бенз(а)пирена в области 401-404 нм, фиксируя значение регистрирующего прибора спектрофотометра при длине волны 401 нм. Запись спектра повторяют дважды.

Затем последовательно замораживают в жидком азоте вторую и первую пробирки и записывают спектры флуоресценции в области длин волн 401-404 нм, обязательно выставляя перо самописца при длине волны 401 нм в то же положение, что при сканировании пробы в третьей пробирке.

Массовую концентрацию бенз(а)пирена в анализируемом экстракте определяют по графику, на котором по оси абсцисс откладывают значение добавки бенз(а)пирена (мкг), а по оси ординат - высоту пика максимума характеристической линии бенз(а)пирена при 403 нм, измеренную по полученным спектрограммам в миллиметрах.

Если массовая концентрация бенз(а)пирена в исследуемом растворе попадает в область, пригодную для измерений, то полученные экспериментальные точки лежат на одной прямой. Экстраполяция этой прямой до пересечения с осью абсцисс дает на ней отрезок, соответствующий содержанию бенз(а)пирена в растворе без добавки, т.е. в 1 см

исследуемого раствора. В случае, если массовая концентрация бенз(а)пирена в анализируемом растворе выше верхнего предела диапазона измеряемых прибором концентраций, то проводят разбавление анализируемого раствора н.октано

м.

4.3.3 Определение содержания бенз(а)пирена в растворе (экстракте), полученном по 4.3.1, методом внутреннего стандарта

В качестве внутреннего стандарта используют 1,12-бензперилен. В пробирку наливают 3 см

раствора бенз(а)пирена в н.октане, полученного по 4.3.1, и помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом перед входной щелью спектрофотометра, устанавливают аналитическую линию 403 нм при длине волны возбуждающего света 367 нм и проводят запись спектра раствора в области длин волн 401-409 нм. По интенсивности линии (по высоте пика максимума характеристической линии бенз(а)пирена при 403 нм) оценивают приблизительное содержание бенз(а)пирена в пробе. В соответствии с этой оценкой далее в пробирку с 3 см

раствора бенз(а)пирена в н.октане добавляют раствор 1,12-бензперилена в таком количестве, чтобы в спектре пробы интенсивность 1,12-бензперилена при 406,3 нм была в 3-5 раз больше интенсивности линии бенз(а)пирена при длине волны 403 нм.

Проводят запись спектра в интервале длин волн 401-409 нм дважды.

Интенсивности характеристических линий бенз(а)пирена при 403 нм и 1,12-бензперилена при 406,3 нм (

и

соответственно) определяют по спектрограммам, измеряя высоты пиков в максимумах характеристических линий этих соединений в миллиметрах. В расчетах принимают среднюю величину. Рассчитывают коэффициент отношения (

) интенсивности линии бенз(а)пирена (

) к интенсивности линии 1,12-бензперилена (

),

.

Далее определяют этот коэффициент для стандартных растворов бенз(а)пирена (

). Для этого в две пробирки наливают по 3 см

стандартных растворов бенз(а)пирена с массовой концентрацией 0,02 и 0,04 мкг/см

. В каждую из пробирок наливают такое же количество 1,12-бензперилена, что и в пробирку с пробой. Проводят дважды запись спектров каждого раствора в интервале длин волн 401-409 нм.

При этом обязательно следят за тем, чтобы положение пера самописца при длине волны 401 нм во всех случаях фиксировалось на одном уровне.

Далее по спектрограммам определяют интенсивность характеристических линий бенз(а)пирена при 403 нм и 1,12-бензперилена при 406,3 нм (

и

соответственно). В расчетах принимают среднее значение. Рассчитывают

для каждой концентрации бенз(а)пирена.