ГОСТ Р 53244-2008 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот.
ГОСТ Р 53244-2008
(ИСО 21570:2005)
Группа Н09
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Продукты пищевые
МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ И ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ НИХ ПРОДУКТОВ
Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот
Foodstuffs. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Quantitative nucleic acid based methods
ОКС 65.120
67.040
ОКСТУ 9109
9209
9709
Дата введения 2010-01-01
Предисловие
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Институтом физиологии растений им. К.А.Тимирязева Российской академии наук при участии Ассоциации "Биологическая, экологическая и продовольственная безопасность" на основе аутентичного перевода международного стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 447 "Биологическая безопасность пищевых продуктов, кормов и товаров народного потребления и методы ее контроля"
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 25 декабря 2008 г. N 781-ст
4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 21570:2005 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот" (ISO 21570:2005 "Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Quintitative nucleic acid basid methods").
При этом в него не включены приложение C в части С3, C6 и C7 и приложение D в части D1 примененного международного стандарта, которые преждевременно применять в национальной стандартизации в связи с тем, что линии кукурузы Event176 и Bt11 не входят в перечень генно-инженерно-модифицированных организмов, разрешенных для реализации населению и использования в пищевой промышленности в Российской Федерации (2008 г.).
При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены курсивом*.
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам Российской Федерации, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок, указанные в приложении Е
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
Введение
Поиск ингредиентов полученных генетически модифицированных организмов осуществляется путем следующих последовательных (или одновременных) стадий. После отбора анализируемой пробы из лабораторной пробы экстрагируются нуклеиновые кислоты. Экстрагированные нуклеиновые кислоты могут далее очищаться в процессе экстракции или после него. Затем производят его количественное определение (при необходимости), разбавление (при необходимости), и он подвергается аналитическим процедурам (таким как ПЦР). Эти стадии подробно изложены в настоящем Международном стандарте и в следующих Международных стандартах:
ИСО 21569 Продукты пищевые. Методы анализа, предназначенные для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на качественном определении нуклеиновых кислот [1];
ИСО 21571 Продукты пищевые. Методы анализа, предназначенные для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот [2].
Международная организация по стандартизации (ИСО) обращает внимание на тот факт, что заявлено, что соблюдение настоящего документа может включать использование патента, касающегося технологии ПЦР.
ИСО было проинформировано, что Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. и Hoffman-La Roche являются держателями патентных прав, касающихся технологии ПЦР. Компании гарантировали ИСO, что они намерены вести переговоры о лицензиях на приемлемых и не дискриминационных условиях с заявителями по всему миру. В этой связи заявления держателей этих патентных прав зарегистрированы ИСO. Информация может быть получена от:
Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404, USA
и
Roche Molecular Systems, Inc.
Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501, USA.
Обращается внимание на возможность того, что некоторые элементы настоящего документа могут быть предметом патентных прав иных, чем определенные выше. ИСО не может нести ответственность за идентификацию какого-либо одного или всех патентных прав.
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, а также корма и растительные образцы, отобранные из окружающей среды.
Настоящий стандарт устанавливает количественные методы определения генетически модифицированных организмов (далее - ГМО) в пищевых продуктах, а также в кормах и растительных образцах, отобранных из окружающей среды с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), и общие требования к специфической амплификации целевых последовательностей дезоксирибуноклеиновой кислоты (ДНК) с целью количественного определения содержания ДНК из ГМО, а также для подтверждения идентичности амплифицированной последовательности ДНК.
Основные принципы, минимальные требования и критерии исполнения, изложенные в настоящем стандарте, предназначены для обеспечения сравнимости, точности и воспроизводимости результатов, получаемых в разных лабораториях.
Методы количественного определения содержания ДНК из ГМО и подтверждения идентичности амплифицированной последовательности ДНК приведены в приложениях A-D.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения
ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ Р 50779.11-2000 (ИСО 3534-2-93) Статистические методы. Статистическое управление качеством. Термины и определения
ГОСТ Р 52173-2003 Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения
ГОСТ Р 52174-2003 Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа
ГОСТ Р 53214-2008 (ИСО 24276:2006) Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 50779.11 и ГОСТ Р 53214.
4 Принцип
4.1 Общие положения
Каждый количественный метод, приведенный в приложениях A-D, определяет конкретную целевую последовательность (и) ДНК*.
________________
* Количественное определение допускается проводить с использованием конкурентной ПЦР [3], [4] или ПЦР в реальном времени [5], [6].
Результат количественного определения должен явно выражать (в процентах) содержание целевой последовательности относительно количества специфического стандарта, соответствующих калибровок и контролей и быть внутри динамического диапазона применяемого аналитического метода и анализируемой пробы.
Количественное определение* состоит:
- из амплификации одной или большего числа специфических целевых последовательностей;
- обнаружения и подтверждения специфичности продукта(ов) ПЦР и
- определения содержания амплифицированных фрагментов (продуктов ПЦР) относительно калибровок.
________________
* В случае использования ПЦР в реальном времени амплификация, обнаружение и подтверждение происходят одновременно.
Отбор проб - по ГОСТ Р 52173, ГОСТ Р 52174.
4.2 Амплификация, обнаружение и подтверждение продуктов ПЦР
Принципы амплификации, обнаружения и подтверждения последовательностей ДНК - в соответствии с ИСО 21569 [1].
4.3 Количественное определение продуктов ПЦР
Принцип количественного определения состоит в определении соотношения (выраженного в процентах) двух целевых последовательностей ДНК, т.е. последовательности, представляющей интересующий генетически модифицированный организм и последовательности (эндогенной), специфической для целевого таксона.
Материалы, применяющиеся для калибровки, которые используют для количественного определения, должны быть пригодными для контроля с сертифицированными эталонными материалами (СЭМ), если таковые имеются. Если такие материалы отсутствуют, следует использовать другие подходящие эталонные материалы*.
________________
* Примерное руководство приведено в [7]. Информация об исследованиях подтверждения достоверности и погрешности измерений собраны в международных исследованиях [8], [9], [10], [11].
5 Реактивы
Все реактивы и материалы, используемые для анализа, должны быть идентичны или эквивалентны определенным в методе. В противном случае все реактивы и материалы должны иметь квалификацию "для молекулярно-биологических работ" (molecular biology grade). Эти реактивы следует хранить и использовать, как рекомендовано производителем или в соответствии с техническими требованиями обеспечения качества лабораторных работ в соответствии с ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025.
6 Приборы и оборудование
См. приложения A-D и ГОСТ Р 53214.
7 Руководство, касающееся процедуры
7.1 Общие положения
Общие требования, имеющие отношение к ПЦР-амплификации для обнаружения ГМО, описаны в ИСО 21569 [1].
В приложениях A-D описаны методы ПЦР-детектирования наряду с деталями их возможностей и применения. Для каждого метода подробно описаны демонстрируемые рабочие характеристики.
Концентрация анализируемой последовательности ДНК должна находиться внутри динамического диапазона метода.
Примечание - Для определения достаточно ли качество кодирующей нити ДНК (по длине и структурной целостности), а также достаточны ли ее чистота и количество для обеспечения обнаружения и количественного определения ГМО, принадлежащего к целевому таксону, может быть проведен контроль, специфический для целевого таксона. Он может быть тем более обоснован, когда ДНК экстрагирована из композитного или подвергнувшегося глубокой обработке материала.
ДНК, экстрагированная из каждой анализируемой пробы, должна быть проанализирована не менее чем в двух повторностях.
Должны быть использованы соответствующие контроли [см. ГОСТ Р 53214 (таблица 1)].
Таблица 1 - Выражение результатов
|
|
Результат | Выражение результата |
Последовательность, специфическая для целевого таксона, не обнаружена | См. ИСО 21569 [1].
"Для вида  *" ДНК не обнаружена" |
Последовательность, специфическая для целевого таксона, обнаружена, но не обнаружена целевая последовательность, происходящая из ГМО | В соответствии с ИСО 21569 [1].
"Для вида " ДНК, происходящая из ГМО, не обнаружена". В надлежащих случаях, кроме того, добавляется "Фактический предел детектирования составляет  %" (указывают используемые единицы измерения) |
Обнаружены как последовательность, специфическая для целевого таксона, так и целевая последовательность, происходящая из ГМО, однако, количество, по крайней мере, одной из целевых последовательностей ниже предела количественного определения | Для каждого ГМО констатируется:
"ДНК, происходящая из ГМО (специфицируется ГМО), обнаружена с помощью (специфицируется целевая последовательность), полученной из (специфицируется вид)".
В надлежащих случаях, кроме того, добавляется "Фактический предел количественного определения составляет %" (указывают используемые единицы измерения) |
Обнаружены как последовательность, специфическая для целевого таксона, так и целевая последовательность, происходящая из ГМО, и количество обеих целевых последовательностей выше предела количественного определения | Для каждого ГМО констатируется:
"Содержание ДНК, происходящей из ГМО (специфицируется ГМО), обнаруженное с помощью (специфицируется целевая последовательность) полученной из (специфицируется вид), составляет ±погрешность, %" (указывают используемые единицы измерения) |
* Указывают таксономическую принадлежность анализируемого растения. Например, "ДНК сои не обнаружена". | |
7.2 Стабильность целевой последовательности
Для сортов различного географического и филогенетического происхождения следует учитывать стабильность целевой последовательности как аллельную, так и по числу копий.
7.3 Калибровка анализа
В качестве альтернативы геномной ДНК в качестве эталонного материала для калибровки допускается использовать, например, серию разбавлений плазмиды или синтетической двухцепочечной ДНК, содержащих целевую последовательность, при условии, что она демонстрирует при калибровке поведение, аналогичное эталонному материалу геномной ДНК и геномной ДНК, экстрагированной из анализируемой пробы.
7.4 Особенности количественного определения
Методы ПЦР должны быть соответствующим образом разработаны с целью минимизации вариабельности.
Примечание - В зависимости от применяемого метода и/или анализируемого материала присутствие конструкций, включающих несколько целевых генов, может привести к преувеличению фактического содержания ГМО.
Предел количественного определения (LOQ) - в соответствии с ГОСТ Р 53214.
На расчет содержания ГМО, основанный на числе копий целевых последовательностей в гаплоидном геноме, влияет гомо- и гетерозиготность изучаемых проб (см. приложения A-D).
7.5 Требования к обеспечению качества
Для установления достоверности изменений необходимо знание относительного стандартного отклонения воспроизводимости метода в соответствии с ГОСТ Р 5725-1* и ГОСТ Р 5725-6*. Если наличие происходящей из ГМО ДНК (в процентах) запротоколировано, необходимы:
a) согласованность результатов для каждой лабораторной пробы, достигающаяся:
- через отбраковку измерений меньших, чем предел количественного определения, и
- через максимальное отклонение, наблюдаемое между разбавлениями и индивидуальными измерениями, равное значению, ожидаемому, исходя из соответствующего фактора разбавления, ±33%;
b) согласованность между тестируемыми частями лабораторной пробы:
Для того чтобы гарантировать точность измерений для количества происходящей из ГМО ДНК следует выбирать и анализировать стандартный материал (СМ), предпочтительно сертифицированный (ССМ), с соответствующим уровнем метрологической надежности и с надлежащим сходством вещества продукта. В отсутствие ССМ может быть приготовлен СМ собственного производства с помощью процедуры, обеспечивающей стабильность, однородность и единство измерений и гарантирующей отсутствие систематической погрешности. Оцененная количественно погрешность должна удовлетворять требуемой для калибровки (см. ИСО Руководство 32) [12].
8 Интерпретация результатов
Результаты ПЦР могут быть либо
a) пригодными для количественной оценки целевой последовательности при условии, что
- результат положительный в соответствии с ИСО 21569 (подраздел 8.1) [1] и таблицей 2 ГОСТ Р 53214;
- наблюдаемое ингибирование реакции незначительно;
- аналитические процедуры дают недвусмысленные значения измерений;
- количество целевой последовательности находится внутри динамического диапазона метода и
- проведена калибровка аналитической процедуры в соответствии с 7.3,
либо
b) не пригодными для количественной оценки целевой последовательности, если любое из перечисленных выше условий не было соблюдено.
Для того чтобы лаборатория могла дать обоснованное заключение, погрешность измерения должна быть достаточно мала.
В приложениях A-D приведены измерения количества целевой ДНК. Эти количества могут быть использованы для расчета количества ГМО. Эти расчеты обычно принимают во внимание такие биологические факторы, как гомо- и гетерозиготность целевых последовательностей.
Если количество целевой ГМ-последовательности или последовательности, специфической для целевого таксона, установленное в ходе испытания, ниже предела количественного определения (LOQ), результат следует выражать только качественно (в анализируемой пробе ДНК из ГМО присутствует).
Примечание - Утверждение, что количество происходящей из ГМО ДНК ниже предела количественного определения, сопровождающееся спецификацией этого предела количественного определения, рассматривают как качественное выражение результата.
9 Выражение результата
Результаты должны ясно констатировать количество целевой ГМ-последовательности относительно последовательности, специфической для целевого таксона. Результаты должны также содержать значения погрешности измерения, такие как стандартное отклонение или относительное стандартное отклонение. Кроме того, следует приводить значения предела детектирования и предела количественного определения метода и фактические пределы детектирования и количественного определения.
Целевая последовательность может быть, а может и не быть обнаружена, или количество, по крайней мере, одной из них может быть ниже предела количественного определения. В таблице 1 описаны четыре альтернативных случая и соответствующее им выражение результата, которые должны быть включены в протокол испытания.
Допускается также указывать содержание ДНК, происходящей из ГМО, с учетом погрешности измерения как в том случае, когда оно превышает конкретное значение, так и когда не достигает его.
10 Протокол испытания
Протокол испытания - в соответствии с ГОСТ Р 53214 и ИСО 21569 [1] и должен содержать следующую дополнительную информацию:
a) предел количественного определения (LOQ) метода и материал, с помощью которого он был установлен;
b) фактический предел количественного определения;
c) ссылку на метод, который был использован для экстракции ДНК;
d) ссылку на использованные материалы;
e) результаты, выраженные в соответствии с разделом 9.
Приложение А
(рекомендуемое)
Метод, специфический для целевого таксона
А.1 Метод определения абсолютного количественного содержания ДНК гена adh1 из кукурузы (специфический для целевого таксона) с использованием метода ПЦР в реальном времени
А.1.1 Введение
В этом приложении описан метод специфической амплификации и количественного определения (вспомогательного) гена adh1 (кодирующего алкогольдегидрогеназу 1) из кукурузы (Zea mays) для определения содержания ДНК кукурузы или для обнаружения присутствия/отсутствия в растворах ДНК, экстрагированной из продуктов, содержащих кукурузную ДНК, например, из пищевых продуктов, детектируемых количеств ингибиторов ПЦР.
Ограничения см. в А.1.8.
А.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров
А.1.2.1 Общие положения
Метод был оптимизирован для ДНК, экстрагированной из чистых размолотых кукурузных зерен, листьев кукурузы и сертифицированных стандартных материалов (серий IRMM-411, IRMM-412, IRMM-413 [13], [14]).
Воспроизводимость описанного метода была проверена с помощью совместных испытаний лабораторий с использованием неизвестных образцов (от U1 до U6), состоящих из ДНК кукурузы дикого типа с различным числом копий соответствующей целевой последовательности (см. А.1.2.2), а также в других совместных испытаниях лабораторий в комбинации с методами, специфическими для трансформационных событий ГМ-кукурузы.
Число копий целевой последовательности на гаплоидный геном должно быть равно единице [14].
Должна быть установлена аллельная стабильность целевой последовательности [14].
А.1.2.2 Совместные испытания лабораторий*
________________
* Подтверждение достоверности (валидация) метода было проведено в ходе совместных испытаний лабораторий, организованных Объединенным исследовательским центром Еврокомиссии (EC-JRC) и Институтом защиты здоровья и потребителей (IHCP) в соответствии с Международным протоколом гармонизации [15].
Для построения калибровочной кривой для определения абсолютного количества гаплоидных геномов кукурузы в неизвестных образцах были использованы шесть образцов (S1-S6) ДНК кукурузы дикого типа (экстрагированной из материала листьев [16], содержащей известное абсолютное число копий (183486, 61162, 20387, 6796, 2265 и 755) гаплоидных геномов кукурузы. Абсолютное число копий в известных образцах было определено путем деления массы ДНК (определенной методом флуориметрического количественного определения двухцепочечной ДНК производства фирмы PicoGreen, Molecular Probes, Cat. Number P-7589) на опубликованное среднее значение 1С для геномов кукурузы (2,725 пг) [17].
Шесть образцов (U1-U6) ДНК кукурузы дикого типа (экстрагированной из материала листьев [16]) были использованы в качестве неизвестных образцов. Ожидаемое число копий в неизвестных образцах было определено тем же методом, что и в известных образцах.
Результаты подтверждения достоверности метода, полученные в ходе совместных испытаний лабораторий, суммированы в таблице А.1.
Таблица А.1 - Данные валидации
|
|
|
|
|
|
|
Наименование показателя | Образец | |||||
| U1 | U2 | U3 | U4 | U5 | U6 |
Число участвовавших лабораторий | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Число лабораторий, имевших возвратные результаты | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
Число неработоспособных (invalid) лабораторий | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Число поддержанных лабораторий | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 |
Число образцов на лабораторию | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
Число выбросов по Кохрану | 1 | 1 | 1 | 1 | - | - |
Число выбросов по Груббсу | - | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Число принятых образцов | 35 | 34 | 34 | 34 | 35 | 35 |
Ожидаемое число копий | 7339 | 18349 | 36697 | 55046 | 91743 | 146788 |
Среднее число копий | 9985 | 23885 | 46918 | 75161 | 100541 | 122080 |
Отклонение от истинного значения, % | 36,1 | 30,2 | 27,9 | 36,5 | 9,6 | -16,8 |
Стандартное отклонение повторяемости  | 1318,59 | 1463,60 | 5796,58 | 4539,57 | 11306,89 | 14843,41 |
Относительное стандартное отклонение повторяемости, %  | 13,21 | 6,13 | 12,35 | 6,04 | 11,25 | 12,16 |
Стандартное отклонение воспроизводимости  | 2013,12 | 2083,57 | 6145,39 | 6806,85 | 14592,04 | 17777,70 |
Относительное стандартное отклонение воспроизводимости, % | 20,16 | 8,72 | 13,10 | 9,06 | 14,51 | 14,56 |
 Выражается как число копий. Выражается как процент от среднего значения . | ||||||
Валидация метода была также проведена в комбинации с методами, специфическими для трансформационных событий для нескольких образцов ГМ-кукурузы, например, для сладкой кукурузы Bt11. Подробности комбинированных испытаний (относительного количественного определения) см. в [18] и [19].
А.1.2.3 Молекулярная специфичность
А.1.2.3.1 Общие положения
Метод был разработан для использования в качестве целевой части последовательности, описанной в EMBL/GenBank/DDBJ, регистрационный номер X04050. Эта последовательность является уникальной для Zea mays (кукуруза/маис) и Zea mays subsp. diploperennis (теосинте мексиканского) [14].
А.1.2.3.2 Теоретическая специфичность
Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска в базах данных EMBL/GenBank/DDBJ с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN на сайте Национального института здравоохранения США [9 октября 2003 г.]. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемыми целевыми последовательностями.
А.1.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности
Специфичность метода была проверена в отношении широкого диапазона нецелевых таксонов и 20 различных линий кукурузы, представляющих географическое и филогенетическое разнообразие образцов [14]. Не было обнаружено перекрестной реактивности с нецелевыми таксонами (за исключением теосинте мексиканского Zea mays subsp. diploperennis, дикого предка культурной кукурузы) [14], [20]. Были установлены число копий и аллельная стабильность целевой последовательности у различных линий кукурузы [14].
А.1.2.4 Оптимизация
А.1.2.5 Предел детектирования (LOD)
В соответствии с рекомендациями разработчика метода LOD составляет 10 копий целевой последовательности [14]. Наименьшее число копий целевой последовательности, включенных в совместные испытания лабораторий, составляло 7399 копий целевой последовательности.
А.1.2.6 Предел количественного определения (LOQ)
В соответствии с рекомендациями разработчика метода LOQ составляет 100 копий целевой последовательности [14]. Наименьшее число копий целевой последовательности, включенных в совместные испытания лабораторий, составляло 7399 копий целевой последовательности.
А.1.3 Адаптация
Специфическая информация отсутствует.
А.1.4 Принцип
Таблица А.2 - Олигонуклеотиды
|
|
|
Наименование олигонуклеотида | Последовательность олигонуклеотидной ДНК | Окончательная концентрация при ПЦР |
ADH-FF3 | 5’-CgT CgT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3’ | 300 нмоль/ дм  |
ADH-RR4 | 5’-CCA CTC CgA gAC CCT CAg TC-3’ | 300 нмоль/ дм |
ADH1-MDO | 5 ’ -FAM-AAT CAg ggC TCA TTT TCT CgC TCC TCA-TAMRA-3 | 200 нмоль/ дм |
FAM: 6-карбоксифлуоресцеин; TAMRA: 6-карбокситетраметилродамин. | ||
А.1.5 Реактивы
А.1.5.1 Общие положения
Для получения информации о качестве реактивов, которые могут использоваться, см. ГОСТ Р 53214 (подраздел 6.6).
А.1.5.2 Вода
А.1.5.6 Олигонуклеотиды
Характеристики применяемых олигонуклеотидов приведены в таблице А.2.
Длина ампликона adh1 составляет 134 п.о.
А.1.5.7 Термостабильная ДНК-полимераза
А.1.5.8 Урацил-N-гликозилаза (необязательно)
А.1.5.9 Реакционная смесь для амплификации
Подробно о реакционной смеси для амплификации см. в таблице А.3.
Таблица А.3 - Реакционная смесь для амплификации, окончательные объем/концентрация на одну реакционную пробирку
|
|
|
Суммарный реакционный объем | 25 мкл | |
Кодирующая нить ДНК (максимум 250 нг) | 5 мкл | |
Taq-ДНК-полимераза | TaqMan Universal Master Mix 2 | 12,5 мкл |
Деконтаминационная система (дУТФ, включая урацил-N-гликозилазу) |
|
|
Реакционный буфер (содержащий пассивный стандартный ROX) |
|
|
Смесь дНТФ |
|
|
Праймеры | См. таблицу А.2 | См. А.1.5.6 |
Зонд | См. таблицу А.2 | См. А.1.5.6 |
ROX - карбокси-Х-родамин. | ||
А.1.6 Прибор
А.1.6.1 Общие положения
Следует использовать стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.
А.1.6.2 Термоциклер
А.1.6.3 Реакционные пробирки
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных, если может быть показано, что их применение приводит к тем же результатам.
А.1.7 Процедура: порядок проведения ПЦР
А.1.7.1 Общие положения
Порядок проведения ПЦР для целевой последовательности референсного гена и для целевой последовательности ГМО следует проводить в отдельных пробирках, если иное не указано в соответствующем приложении для ГМ-специфических целевых последовательностей.
Метод изложен для суммарного объема реакционной смеси ПЦР 25 мкл с реактивами, список которых приведен в таблице А.3.
А.1.7.2 Контроли ПЦР
Если контроли не дают ожидаемого результата, результаты анализа должны быть аннулированы, а сам анализ должен быть повторен.
В качестве положительного контроля и/или стандартного материала для калибровки может быть использована высококачественная чистая геномная ДНК, экстрагированная из кукурузы (например, ССМ от JRC, IRMM [16]. Должны быть проведены все соответствующие контроли, как это описано в ГОСТ Р 53214.
А.1.7.3 Температурно-временная программа
Таблица А.4 - Процедура: условия реакции
|
|
|
|
Этапы определения | Время, с | Температура, °С | |
Пред-ПЦР: деконтаминация | 120 | 50 | |
Пред-ПЦР: активация ДНК-полимеразы и денатурация кодирующей нити ДНК | 600 | 95 | |
ПЦР (50 циклов) | |||
Стадия 1 | Денатурация | 15 | 95 |
Стадия 2 | Отжиг и элонгация | 60 | 60 |
А.1.8 Ограничения и интерпретация результатов
Для использования этого метода в комбинации с методом количественного определения происходящей из ГМО ДНК важно, чтобы абсолютное количество кодирующей нити ДНК (нг) было таким же, как при adh1-ПЦР, так и при ГМО-специфической ПЦР. Если это будет не так, то абсолютное число копий, полученное в ходе этих реакций, не может быть сравнено непосредственно и будет необходимо приведение этих чисел в соответствие. В противном случае относительная концентрация ГМО не может быть рассчитана.
А.1.9 Калибровка и результаты расчетов
Калибровочные точки получают с ДНК, содержащей определенное количество (в абсолютных числах копий) гаплоидной геномной ДНК кукурузы, включающей целевую последовательность.
Калибровочную кривую используют для определения абсолютного числа гаплоидных геномных копий кукурузной ДНК неизвестных образцов. Несмотря на то, что ДНК образца может быть деградирована вследствие процесса приготовления продукта, либо может содержать ингредиенты, иные, чем кукуруза, это не будет влиять на рассчитываемое число гаплоидных геномных копий неизвестных образцов.
Приложение B
(рекомендуемое)
Методы скрининга
B.1 Метод скрининга для определения относительного количественного содержания ДНК 35S-промотора сои линии GTS 40-3-2 с использованием метода ПЦР в реальном времени
B.1.1 Введение
Ограничения см. в B.1.8.
B.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров
B.1.2.1 Общие положения
Метод был оптимизирован для сертифицированных стандартных материалов (ССМ IRMM-410) [21], состоящих из высушенной муки соевых бобов, включающих смеси сои GTS 40-3-2 и обычной сои.
Воспроизводимость приведенных методов была проверена в ходе совместных испытаний лабораторий с использованием неизвестных образцов (образцы, помеченные как SA-SE, см. таблицу B.1), состоявших из смеси стандартных материалов, тип которых упомянут выше [22]. Кроме того, были протестированы коммерчески доступные пищевые продукты [23].
Таблица B.1 - Данные валидации 35S-промотор-специфического обнаружения ГМО в 1999 г.
|
|
|
|
|
|
Наименование показателя | Образцы | ||||
| SA | SB | SC | SD | SE |
Число лабораторий, имевших возвратные результаты | 11 | 11 | 11 | 11 | 11 |
Число образцов на лабораторию | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Число исключенных лабораторий | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
Число лабораторий, оставшихся после исключения | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 |
Число принятых образцов | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 |
Ожидаемое значение, % ГМО | 1,4 | 1,8 | 3 | 0,7 | 1 |
Среднее значение, % ГМО | 1,63 | 1,76 | 4,04 | 0,88 | 1,73 |
Среднее линейное значение, % ГМО | 1,62 | 1,70 | 3,46 | 1,00 | 1,60 |
Стандартное отклонение воспроизводимости  % ГМО | 0,28 | 0,39 | 1,36 | 0,21 | 0,35 |
Относительное стандартное отклонение воспроизводимости, % | 17 | 22 | 34 | 24 | 20 |
Предел воспроизводимости  (  2,8 ) | 0,80 | 1,08 | 3,82 | 0,58 | 0,97 |
Число копий каждой из целевых последовательностей на геном подробно оценено не было [24], [25].
Метод был опубликован в [26].
B.1.2.2 Совместные испытания лабораторий
Пять неизвестных образцов, содержащих от 0,7% до 3% (по массе) высушенной соевой муки из сои GTS 40-3-2, были проанализированы одиннадцатью участниками.
Метод, специфичный для детектирования 35S-промотора, дал относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 17% до 34% (см. таблицу B.1). В ходе начальных экспериментов совместных испытаний лабораторий было определено, что 1%-ный соевый ССМ не соответствовал заявленному значению. Исследования показали, что различавшиеся стандартные материалы были изготовлены разными способами в разное время, что и привело к разному уровню деградации ДНК. Участники совместного испытания лабораторий были поставлены в известность о необходимости в ходе этого совместного испытания применять 2%-ный ССМ и разбавлять его для получения раствора 1%-ной стандартной ДНК для использования при количественном определении.
Образцы анализировались в двух повторностях.
Так как образцы, помеченные SA-SE, представляли собой смеси этих различных стандартов, результаты, полученные с помощью этих образцов, не могут быть использованы для оценки истинности предложенного метода ПЦР в реальном времени. Однако эти результаты могут быть использованы для оценки точности этого метода, в силу чего описанные обстоятельства отражают наихудший вариант, ведущий к недооценке точности прикладного метода ПЦР в реальном времени [22].
Кроме того, четырьмя участниками межлабораторных испытаний были проанализированы четыре неизвестных коммерчески доступных образца пищевой продукции, содержавшей от 0,3% до 36% (по массе; средние значения) генетически модифицированной сои линии GTS 40-3-2. Метод, специфический для детектирования 35S-промотора, показал относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 17% до 28% [23].
B.1.2.3 Молекулярная специфичность
B.1.2.3.1 Общие положения
Список генетически модифицированных растений, содержащих CaMV 35S-промотор, приведен в [28].
Может быть получен ложноположительный результат вследствие того, что амплифицированная последовательность происходит из цветной капусты и других представителей семейства Brassicaceae (Cruciferae), а также Resedaceae и Solanaceae, инфицированных вирусом мозаики цветной капусты [29], [30]. Поэтому положительные результаты, касающиеся Brassicaceae, Resedaceae и Solanaceae, должны тщательно рассматриваться. Положительные результаты могут указывать на присутствие продуктов, происходящих из ГМ-растений, но не должны интерпретироваться как доказательство присутствия продуктов, происходящих из ГМ-растений, без дополнительного подтверждения.
Для того, чтобы отличить вирусную инфекцию от ГМ-материала, допускается использовать методы обнаружения вируса мозаики цветной капусты [31].
B.1.2.3.2 Теоретическая специфичность
Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска в базах данных GenBank/EMBL/DDBJ с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN 2.2.3 [24 апреля 2002 г.]. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемыми целевыми последовательностями.
B.1.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности
Экспериментальная специфичность метода была оценена путем анализа ССМ IRMM-410 из высушенной соевой муки производства IRMM, содержащей от 0% до 5% сои линии GTS 40-3-2 и стандартного материала фирмы Leatherhead Food Research Association International - соевой муки с полным содержанием масла (Lot No. 2/99-01), содержащей 0%, 0,3%, 1,25% и 2% сои линии GTS 40-3-2, соответственно.
Исследованным коммерческим пищевым материалом были соевая мука, белковые изоляты сои, композитные пищевые продукты, содержащие соевую муку и соевый белок.
B.1.2.4 Оптимизация
B.1.2.5 Предел детектирования (LOD)
Поскольку метод является количественным, LOD прямо не оценивался. LOD должен быть лучше или равным пределу количественного определения, т.е. 50 геномных копий сои линии GTS 40-3-2 в 82000 геномных копиях обычной соевой муки.
B.1.2.6 Предел количественного определения (LOQ)
Концентрации, исследованные в совместном испытании лабораторий, приведены в таблице B.1.
Примечание - Число копий в совместном испытании лабораторий не определялось.
B.1.3 Адаптация
Специфическая информация отсутствует.
B.1.4 Принцип
B.1.5 Реактивы
B.1.5.1 Общие положения
Для получения информации о качестве используемых реактивов см. ГОСТ Р 53214 (подраздел 6.6).
B.1.5.2 Вода
B.1.5.6 Олигонуклеотиды
Характеристики применяемых олигонуклеотидов приведены в таблице B.2.
Таблица B.2 - Олигонуклеотиды
|
|
|
|
|
Наименование олигонуклеотида | ДНК-последовательность олигонуклеотида | Окончательная концентрация при ПЦР | ||
Целевая последовательность референсного гена | ||||
Лектин-F | 5’-TCC ACC CCC ATC CAC ATT T-3’ | 900 нмоль/дм | ||
Лектин-R | 5’-ggC ATA gAA ggT gAA gTT gAA ggA-3’ | 900 нмоль/дм | ||
Лектин -TMP | 5 ’ -FAM-AAC Cgg TAg CgT TgC CAg CTT Cg-TAMRA-3 | 100 нмоль/дм | ||
Целевая последовательность ГМО | ||||
35S-F | 5’-gCC TCT gCC gAC AgT ggT-3’ | 300 нмоль/дм | ||
35S-R | 5’-AAg ACg Tgg TTg gAA CgT CTT C-3’ | 900 нмоль/дм | ||
35S-TMP | 5 ’ -FAM-CAA AgA Tgg ACC CCC ACC CAC g-TAMRA-3 | 100 нмоль/дм | ||
FAM: 6-карбоксифлуоресцеин; TAMRA: 6-карбокситетраметилродамин. | ||||
Длина лектинового ПЦР-продукта составляет 81 п.о.; длина 35S ПЦР-продукта составляет 82 п.о.
B.1.5.7 Термостабильная ДНК-полимераза
В.1.5.8 Урацил-N-гликозилаза (необязательно).
B.1.6 Прибор
B.1.6.1 Общие положения
Следует использовать стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.
B.1.6.2 Термоциклер
B.1.6.3 Реакционные пробирки
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных, если может быть показано, что их применение приводит к тем же результатам.
B.1.7 Процедура: порядок проведения ПЦР
B.1.7.1 Общие положения
Порядок проведения ПЦР для целевой последовательности референсного гена и целевой последовательности ГМО следует проводить в отдельных пробирках. Мультиплексная ПЦР (с использованием различных флуоресцентных меток для зондов) не была протестирована или валидирована.
Метод изложен для суммарного объема реакционной смеси ПЦР 50 мкл с реактивами, приведенными в таблице B.3.
Таблица B.3 - Окончательный объем реакционной смеси амплификации (концентрация на одну реакционную пробирку)
|
|
|
|
Целевая последовательность референсного гена | |||
Суммарный объем | 50 мкл | ||
Кодирующая нить ДНК (максимальное количество 200 нг) | 10 мкл | ||
ДНК-полимераза | AmpliTaq Gold | 1,25 ед. | |
Деконтаминационная система | дУТФ | 400 мкмоль/дм | |
| Урацил-N-гликозилаза AmpErase | 0,5 ед. | |
Реакционный буфер | Буфер A TaqMan (содержащий пассивный стандартный ROX) | 1 | |
MgCl | 5 ммоль/дм | ||
Праймеры | Лектин-F и Лектин-R (см. таблицу B.2) | См. таблицу B.2 | |
дНТФ | дАТФ, дЦТФ, дГТФ | 200 мкмоль/дм каждого | |
Зонд | Лектин-TMP (см. таблицу B.2) | См. таблицу B.2 | |
Целевая последовательность ГМО | |||
Суммарный объем | 50 мкл | ||
Кодирующая нить ДНК (максимальное количество 200 нг) | 10 мкл | ||
ДНК-полимераза | AmpliTaq Gold | 1,25 ед. | |
Деконтаминационная система | дУТФ | 400 мкмоль/дм | |
| Урацил-N-гликозилаза AmpErase | 0,5 ед. | |
Реакционный буфер | Буфер A TaqMan (содержащий пассивный стандартный ROX) | 1 | |
MgCl | 5 ммоль/дм | ||
Праймеры | 35S-F и 35S-R (см. таблицу B.2) | См. таблицу B.2 | |
дНТФ | дАТФ, дЦТФ, дГТФ | 200 мкмоль/дм каждого | |
Зонд | 35S-TMP (см. таблицу B.2) | См. таблицу B.2 | |
ROX - карбокси-Х-родамин. | |||
B.1.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительного контроля и стандартного материала для калибровки могут быть использованы сертифицированные стандартные материалы GTS 40-3-2 (материалы, содержащие от 0,1% до 5% генетически модифицированной сои), производимые IRMM, Geel, Бельгия (серии IRMM-410) [21].
Следует провести все соответствующие контроли, как это описано в ГОСТ Р 53214.
B.1.7.3 Температурно-временная программа
Условия реакции приведены в таблице B.4.
Таблица B.4 - Процедура: условия реакции
|
|
|
|
Этапы определения | Время, с | Температура, °С | |
Пред-ПЦР: деконтаминация | 120 | 50 | |
Пред-ПЦР: активация ДНК-полимеразы и денатурация кодирующей нити ДНК | 600 | 95 | |
ПЦР (45 циклов) | |||
Стадия 1 | Денатурация | 15 | 95 |
Стадия 2 | Отжиг и элонгация | 60 | 60 |
B.1.8 Ограничения и интерпретация результатов
Так как некоторые ГМО, а не только соя линии GTS 40-3-2, могут содержать последовательность ДНК 35S-промотора, метод пригоден только для количественного определения ДНК сои линии GTS 40-3-2 в отсутствии ГМО, иных, чем соя GTS 40-3-2. Во всех других случаях метод может быть применен только для скрининга и целей контроля.
Приведенный метод пригоден для измерения соотношения ДНК 35S-промотора и соевой ДНК в отсутствие других ГМО и вируса мозаики цветной капусты. Это соотношение отражает количество сои линии GTS 40-3-2 в соевом ингредиенте исследуемого пищевого продукта. Содержание 1% сои линии GTS 40-3-2 может быть определено, если количество соевого ингредиента в исследуемом пищевом продукте превышает 5%.
Примечание - Если обработка пищевого продукта в ходе его приготовления привела к деградации или удалению ДНК (например, при получении рафинированного соевого масла или рафинированных соевых лектинов), описанный метод не дает достоверных результатов.
B.1.9 Калибровка и расчет результатов
Для этой альтернативной процедуры при расчете результатов важно, чтобы абсолютное количество кодирующей нити ДНК (нг) было одинаковым для каждой ПЦР, использованной для калибровки.
Другая альтернативная процедура описана в C.2.
Приложение С
(рекомендуемое)
Методы, специфические для конструкций
С.1 Метод количественного определения содержания сои линии GTS 40-3-2 (специфический для конструкции) с использованием ПЦР в реальном времени (метод 1)
C.1.1 Введение
Ограничения см. в С.1.7.
С.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров
С.1.2.1 Общие положения
Метод был оптимизирован для сертифицированных стандартных материалов (ССМ IRMM-410) [21], состоящих из высушенной муки соевых бобов, включающих смеси сои GTS 40-3-2 и обычной сои.
Воспроизводимость приведенных методов была проверена в ходе совместных испытаний лабораторий с использованием неизвестных образцов (образцы, помеченные как SA-SE, см. таблицу C.1), состоявших из смеси стандартных материалов, тип которых упомянут выше [22]. Кроме того, были протестированы коммерчески доступные пищевые продукты [23].
Число копий каждой из целевых последовательностей на геном подробно оценено не было [24], [25].
Метод был опубликован в [26].
С.1.2.2 Совместные испытания лабораторий
Пять неизвестных образцов, содержащих от 0,7% до 3% (по массе) высушенной соевой муки из сои линии GTS 40-3-2, были проанализированы одиннадцатью участниками.
Метод, специфичный для детектирования конструкции GTS 40-3-2, дал относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 16% до 28% (см. таблицу С.1). В ходе начальных экспериментов совместных испытаний лабораторий было определено, что 1%-ный соевый ССМ не соответствовал заявленному значению. Исследования показали, что различавшиеся стандартные материалы были изготовлены разными способами в разное время, что и привело к разному уровню деградации ДНК. Участники совместного испытания лабораторий были поставлены в известность о необходимости в ходе этого совместного испытания применять 2%-ный ССМ и разбавлять его для получения раствора 1%-ной стандартной ДНК для использования при количественном определении.
Таблица C.1 - Данные валидации 35S-промотор-специфического обнаружения ГМО в 1999 г.
|
|
|
|
|
|
Наименование показателя | Образцы | ||||
| SA | SB | SC | SD | SE |
Число лабораторий, имевших возвратные результаты | 11 | 11 | 11 | 11 | 11 |
Число образцов на лабораторию | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Число исключенных лабораторий | 3 | 2 | 3 | 3 | 3 |
Число лабораторий, оставшихся после исключения | 8 | 9 | 8 | 8 | 8 |
Число принятых образцов | 8 | 9 | 8 | 8 | 8 |
Ожидаемое значение, % ГМО | 1,4 | 1,8 | 3 | 0,7 | 1 |
Среднее значение, % ГМО | 1,70 | 1,89 | 3,65 | 0,86 | 1,58 |
Среднее линейное значение, % ГМО | 1,71 | 1,90 | 3,68 | 0,85 | 1,49 |
Стандартное отклонение воспроизводимости , % ГМО | 0,27 | 0,53 | 0,57 | 0,15 | 0,38 |
Относительное стандартное отклонение воспроизводимости, % | 16 | 28 | 16 | 17 | 24 |
Предел воспроизводимости ( 2,8 ) | 0,77 | 1,48 | 1,60 | 0,42 | 1,06 |
Образцы анализировались в двух повторностях.
Поскольку образцы, помеченные SA-SE, представляли собой смеси этих различных стандартов, результаты, полученные с помощью этих образцов, не могут быть использованы для оценки истинности предложенного метода ПЦР в реальном времени. Однако эти результаты могут быть использованы для оценки точности этих методов, в силу чего описанные обстоятельства отражают наихудший вариант, ведущий к недооценке точности прикладного метода ПЦР в реальном времени [22].
Кроме того, четырьмя участниками межлабораторных испытаний были проанализированы четыре неизвестных коммерчески доступных образца пищевой продукции, содержавшей от 0,3% до 36% (по массе; средние значения) генетически модифицированной сои линии GTS 40-3-2. Метод, специфический для детектирования конструкции GTS 40-3-2, показал относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 23% до 36% [23].
C.1.2.3 Молекулярная специфичность
C.1.2.3.1 Общие положения
С.1.2.3.2 Теоретическая специфичность
Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска в базах данных GenBank/EMBL/DDBJ с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN 2.2.3 [24 апреля 2002 г.]. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемыми целевыми последовательностями.
C.1.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности
Экспериментальная специфичность метода была оценена путем анализа ССМ IRMM-410 из высушенной соевой муки производства IRMM, содержащей от 0% до 5% сои линии GTS 40-3-2 и стандартного материала фирмы Leatherhead Food Research Association International - необезжиренной соевой муки (Lot No.2/99-01), содержащей 0%, 0,3%, 1,25% и 2% сои линии GTS 40-3-2, соответственно.
Исследованным коммерческим пищевым материалом были соевая мука, белковые изоляты сои, композитные пищевые продукты, содержащие соевую муку и соевый белок.
C.1.2.4 Оптимизация
C.1.2.5 Предел детектирования (LOD)
Поскольку метод является количественным, LOD прямо не оценивался. LOD должен быть лучше или равным пределу количественного определения, т.е. 50 геномных копий сои линии GTS 40-3-2 в 82000 геномных копиях обычной соевой муки.
C.1.2.6 Предел количественного определения (LOQ)
Концентрации, исследованные в совместном испытании лабораторий, приведены в таблице С.1.
Примечание - Число копий в совместном испытании лабораторий не определялось.
С.1.3 Адаптация
Специфическая информация отсутствует.
С.1.4 Принцип
С.1.5 Реактивы
С.1.5.1 Общие положения
Для получения информации о качестве используемых реактивов см. ГОСТ Р 53214 (подраздел 6.6).
C.1.5.2 Вода
С.1.5.6 Олигонуклеотиды
Харатеристики применяемых олигонуклеотидов приведены в таблице C.2.
Таблица С.2 - Олигонуклеотиды
|
|
|
|
Наименование олигонуклеотида | ДНК-последовательность олигонуклеотида | Окончательная концентрация при ПЦР | |
Целевая последовательность референсного гена | |||
Лектин-F | 5’-TCC ACC CCC ATC CAC ATT T-3’ | 900 нмоль/дм | |
Лектин-R | 5’-ggC ATA gAA ggT gAA gTT gAA ggA-3’ | 900 нмоль/дм | |
Лектин-TMP | 5 ’ -FAM-AAC Cgg TAg CgT TgC CAg CTT Cg-TAMRA-3 | 100 нмоль/дм | |
Целевая последовательность ГМО | |||
RRS-F | 5’-gCC ATg TTg TTA ATT TgT gCC AT-3’ | 900 нмоль/дм | |
RRS-R | 5’-gAA gTT CAT TTC ATT Tgg AgA ggA C-3’ | 900 нмоль/дм | |
RRS-TMP | 5 ’ -FAM-CTT gAA AgA TCT gCT AgA gTC AgC TTg TCA gCg-TAMRA-3 | 100 нмоль/дм | |
FAM: 6-карбоксифлуоресцеин; TAMRA: 6-карбокситетраметилродамин. | |||
Длина лектинового ПЦР-продукта составляет 81 п.о.; длина ПЦР-продукта RRS составляет 83 п.о.
С.1.5.7 Термостабильная ДНК-полимераза
C.1.5.8 Урацил-N-гликозилаза (необязательно).
C.1.6 Прибор
C.1.6.1 Общие положения
Следует использовать стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.
C.1.6.2 Термоциклер
C.1.6.3 Реакционные пробирки
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных, если может быть показано, что их применение приводит к тем же результатам.
C.1.6.4 Процедура: порядок проведения ПЦР
Порядок проведения ПЦР для целевой последовательности референсного гена и целевой последовательности ГМО следует проводить в отдельных пробирках. Мультиплексная ПЦР (с использованием различных флуоресцентных меток для зондов) не была протестирована или валидирована.
Метод приведен для суммарного объема реакционной смеси ПЦР 50 мкл с реактивами, приведенными в таблице C.3.
Таблица C.3 - Окончательный объем реакционной смеси амплификации/концентрация на одну реакционную пробирку
|
|
|
|
Целевая последовательность референсного гена | |||
Суммарный объем | 50 мкл | ||
Кодирующая нить ДНК (максимальное количество 200 нг) | 10 мкл | ||
ДНК-полимераза | AmpliTaq Gold | 1,25 ед. | |
Деконтаминационная система | дУТФ | 400 мкмоль/дм | |
| Урацил-N-гликозилаза AmpErase | 0,5 ед. | |
Реакционный буфер | Буфер A TaqMan® (содержащий пассивный стандартный ROX) | 1 | |
MgCl | 5 ммоль/дм | ||
Праймеры | Лектин-F и Лектин-R (см. таблицу C.2) | См. таблицу C.2 | |
дНТФ | дАТФ, дЦТФ, дГТФ | 200 мкмоль/дм каждого | |
Зонд | Лектин-TMP (см. таблицу C.2) | См. таблицу C.2 | |
Целевая последовательность ГМО | |||
Суммарный объем | 50 мкл | ||
Кодирующая нить ДНК (максимальное количество 200 нг) | 10 мкл | ||
ДНК-полимераза | AmpliTaq Gold | 1,25 ед. | |
Деконтаминационная система | дУТФ | 400 мкмоль/дм | |
| Урацил-N-гликозилаза AmpErase | 0,5 ед. | |
Реакционный буфер | Буфер A TaqMan (содержащий пассивный стандартный ROX) | 1 | |
MgCl | 5 ммоль/дм | ||
Праймеры | RRS-F и RRS-R (см. таблицу С.2) | См. таблицу C.2 | |
дНТФ | дАТФ, дЦТФ, дГТФ | 200 мкмоль/дм каждого | |
Зонд | RRS-TMP (см. таблицу С.2) | См. таблицу C.2 | |
ROX - карбокси-Х-родамин. | |||
С.1.6.5 Контроли ПЦР
В качестве положительного контроля и стандартного материала для калибровки могут быть использованы сертифицированные стандартные материалы GTS 40-3-2 (материалы, содержащие от 0,1% до 5% генетически модифицированной сои), производимые IRMM, Geel, Бельгия (серии IRMM-410) [21].
Следует провести все соответствующие контроли, как это предусмотрено в ГОСТ Р 53214.
С.1.6.6 Температурно-временная программа
Условия реакции приведены в таблице С.4.
Таблица С.4 - Процедура: условия реакции
|
|
|
|
Этапы определения | Время, с | Температура, °С | |
Пред-ПЦР: деконтаминация | 120 | 50 | |
Пред-ПЦР: активация ДНК-полимеразы и денатурация кодирующей нити ДНК | 600 | 95 | |
ПЦР (45 циклов) | |||
Стадия 1 | Денатурация | 15 | 95 |
Стадия 2 | Отжиг и элонгация | 60 | 60 |
С.1.7 Ограничения и интерпретация результатов
Поскольку ГМО иные, чем соя линии GTS 40-3-2, они могут содержать часть трансгена, использовавшегося для конструирования сои линии GTS 40-3-2, в частности, 35S-промотор, CTP-последовательность из Petunia hybrida и специфический участок соединения между этими двумя генетическими элементами, метод пригоден для количественного определения ДНК сои линии GTS 40-3-2 в отсутствие других ГМО, как определено выше.
Приведенный метод пригоден для измерения соотношения ДНК из сои линии GTS 40-3-2 и ДНК обычной сои. Это соотношение отражает количество сои линии GTS 40-3-2 в соевом ингредиенте исследуемого пищевого продукта.
Если количество соевого ингредиента в исследуемом пищевом продукте превышает 5%, маловероятно, что содержание 1% сои линии GTS 40-3-2 может быть определено.
Примечание - Если обработка пищевого продукта в ходе его приготовления привела к деградации или удалению ДНК (например, при получении рафинированного соевого масла или рафинированных соевых лектинов), описанный метод не дает достоверных результатов.
C.1.8 Калибровка и расчет результатов
Для этой альтернативной процедуры для расчета результатов важно, чтобы абсолютное количество кодирующей нити ДНК (нг) было одинаковым для каждой ПЦР, использованной для калибровки.
Другая альтернативная процедура приведена в C.2.
С.2 Метод количественного определения содержания сои линии GTS 40-3-2 (специфический для конструкции) с использованием ПЦР в реальном времени (метод 2)
Для получения доступа к полной версии без ограничений вы можете выбрать подходящий тариф или активировать демо-доступ.