ГОСТ 30519-97 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella (аутентичен ГОСТ Р 50480-93).
ГОСТ 30519-97
--------------------------
Группа Н09
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
Метод выявления бактерий рода Salmonella
Food products. Method for detection of Salmonella
МКС 07.100.30
ОКСТУ 9109
Дата введения 1994-01-01
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1 РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП) и Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки плодов и овощей"
2 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 26.12.93 N 24
Постановлением Госстандарта России от 16 апреля 1998 года N 122 ГОСТ 30519-97 введен в действие в качестве государственного стандарта Российской Федерации с момента принятия указанного постановления и признан имеющим одинаковую силу с ГОСТ Р 50480-93 на территории Российской Федерации в связи с полной аутентичностью их содержания
3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
4 ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение НТД, на который дана ссылка | Номер раздела, пункта |
3 | |
3 | |
3 | |
3 | |
3 | |
3, 4.2.2, 4.2.4, 4.2.6, 4.2.9, 4.2.10, 4.2.11, 4.2.12, 4.2.13, 4.2.14, 5.1, 5.6.1 | |
3 | |
2 | |
2 | |
4.2.7, 5.3 |
5 ПЕРЕИЗДАНИЕ
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске продукта бактерий рода Salmonella.
1 Сущность метода
Метод выявления бактерий рода Salmonella основан на высеве определенного количества продукта в жидкую неселективную среду, инкубировании посевов, последующем выявлении в этих посевах бактерий, способных развиваться в жидких селективных средах, образующих типичные колонии на агаризованных дифференциально-диагностических средах, имеющих типичные для бактерий рода Salmonella биохимические и серологические характеристики.
2 Отбор и подготовка проб
Отбор и подготовка проб - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669 или по нормативно-технической документации на анализируемый продукт.
3 Аппаратура, материалы, реактивы
Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1, а также указанные ниже:
весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104* с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности (для взвешивания реактивов);
_____________
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001.
весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 1 кг, 4-го класса точности (для взвешивания продукта);
петлю бактериологическую;
стекла предметные по ГОСТ 9284;
стекла покровные по ГОСТ 6672;
термостат с диапазоном рабочих температур 28-55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью ±1 °С.
спирт изобутиловый по ГОСТ 9536;
бриллиантовый зеленый;
желчь сухую или натуральную;
контрольный штамп* бактерий рода Salmonella, не относящихся к тифозной группе;
магний хлористый по ГОСТ 4209;
мочевину по ГОСТ 6691;
сухие агглютинирующие адсорбированные поливалентные сальмонеллезные сыворотки основных групп А, В, С, Д, Е и редких групп;
феноловый красный.
4 Подготовка к анализу
4.1 Приготовление растворов и реактивов
4.1.7 Сухие агглютинирующие адсорбционные поливалентные сальмонеллезные сыворотки готовят перед употреблением по прописи, указанной в прилагаемом к ним наставлении.
4.2 Приготовление питательных сред
4.2.2 Магниевая среда: готовят путем соединения трех растворов.
4.2.3 Селенитовая среда: готовят из двух растворов.
Стерилизация приготовленной среды не допускается, так как при этом происходит редукция кислого селенисто-кислого натрия, выпадает осадок красного цвета и среда становится непригодной.
Селенитовая среда выпускается в сухом виде и готовится по прописи, указанной на этикетке.
4.2.4 Тетратионатная среда (Мюллер-Кауфман)
Приготовленную основу стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.
Указанные растворы прибавляют к основе среды в приведенном выше порядке, перемешивая смесь после каждого прибавления.
Среду допускается использовать в течение одной недели после приготовления.
Указанные выше растворы, прибавляемые к основе среды, готовят следующим образом:
Раствор хранят в плотно закрытом темном сосуде;
раствор бриллиантового зеленого готовят по 4.1.1;
4.2.5 Дифференциально-диагностические среды (сухие):
висмут-сульфит агар (Вильсон-Блера);
среду Плоскирева;
среду Эндо;
среду Левина.
Среды готовят по прописи, указанной на этикетке.
4.2.7 Агар Кристенсена с мочевиной: среда готовится путем соединения основы среды и раствора мочевины.
Основу среды мерно разливают в колбы или флаконы и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 20 мин.
Раствор мочевины стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 или текучим паром в течение 30 мин.
4.2.8 После стерилизации среды, приготовленные по 4.2.6 и 4.2.7, скашивают так, чтобы оставался столбик высотой 2-2,5 см.
4.2.13 Среды с углеводами (среды Гисса): готовят по ГОСТ 10444.1 или используют сухие среды с углеводами, которые готовят по прописи, указанной на этикетке.
4.2.14 Мясо-пептонный агар: готовят по ГОСТ 10444.1 или используют среду, приготовленную из сухого питательного агара.
Среду из сухого питательного агара готовят по прописи, указанной на этикетке.
5 Проведение анализа
5.1 Неселективное предварительное обогащение
Навеску продукта, в массе (объеме) которой нормативно-технической документацией на анализируемый продукт предусматривается отсутствие бактерий рода Salmonella, высевают в забуференную пептонную воду, приготовленную по 4.2.1. Соотношение массы (объема) продукта и забуференной пептонной воды 1:9.
При посеве жидких высококислотных продуктов для предотвращения снижения рН питательных сред на 0,5 и более рН продукта перед посевом доводят до 7,0±0,2.
При посеве твердых высококислотных продуктов доводят рН до 7,0±0,2 в посевах.
Доведение рН проводят асептически с помощью стерильных растворов гидроокиси натрия и соляной кислоты, приготовленных по ГОСТ 10444.1. Количество добавляемого раствора гидроокиси натрия устанавливают опытным путем.
Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 18-20 ч.
5.2 Селективное обогащение
Посевы инкубируют в течение 24-48 ч на магниевой и селенитовой средах при температуре (36±1) °С, а на тетратионатной среде при температуре (43±1) °С.
5.3 Выделение и идентификация культур на агаризованных дифференциально-диагностических средах
Культуры через 24 и 48 ч инкубирования по 5.2 пересевают (по ГОСТ 26670) на три агаризованные среды, приготовленные по 4.2.5: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева и среду Эндо (или среду Левина).
Допускается использование одной чашки каждой из сред одновременного высева с двух селективных сред.
Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24-48 ч.
После 24 ч инкубирования посевов проводят предварительный учет результатов, а после 48 ч - окончательный.
После инкубирования посевов отмечают на дифференциально-диагностических средах рост колоний, характерных для бактерий рода Salmonella:
на висмут-сульфит агаре колонии черные с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком и с пигментированием среды под колониями;
на среде Плоскирева колонии бесцветные прозрачные, но более плотные, чем на среде Эндо;
на среде Эндо колонии круглые бесцветные или слегка розоватые, прозрачные;
на среде Левина колонии прозрачные, слабо-розовые или розовато-фиолетовые.
При отсутствии в посевах на дифференциально-диагностических средах характерных для бактерий рода Salmonella колоний дают заключение об отсутствии бактерий рода Salmonella в анализируемой навеске продукта.
При наличии хотя бы на одной дифференциально-диагностической среде характерных для бактерий рода Salmonella колоний проводят их дальнейшее изучение.
5.4 Биохимическое подтверждение принадлежности выделенных характерных колоний к бактериям рода Salmonella
5.4.1 Не менее трех характерных колоний с каждой дифференциально-диагностической среды (см. 5.3) пересевают на скошенную поверхность мясо-пептонного агара или среды из сухого питательного агара, приготовленных по 4.2.14, и часть колоний пересевают штрихом по поверхности и уколом в столбик трехсахарного агара, приготовленного по 4.2.6.
Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.
5.4.2 Из отобранных по п.5.4.1 для биохимического подтверждения колоний приготовляют мазки и окрашивают по Граму.
Бактерии рода Salmonella являются грамоотрицательными палочками с закругленными концами.
5.4.3 После инкубирования посевов, как указано в 5.4.1, проводят учет результатов ферментации лактозы, глюкозы и сахарозы на трехсахарном агаре:
пожелтение скошенной части среды указывает на ферментацию лактозы или сахарозы или обоих сахаров;
пожелтение столбика среды с разрывом агара или пузырьками газа указывает на ферментацию глюкозы с образованием газа, пожелтение столбика среды без разрывов или пузырьков газа указывает на ферментацию глюкозы без образования газа;
почернение среды в столбике указывает на образование сероводорода.
Типичными для бактерий рода Salmonella являются культуры, ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, образующие сероводород.
Дальнейшему изучению подвергают также лактозоположительные бактерии или бактерии, не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа.
5.4.4 У культур, отобранных согласно 5.4.3 и пересеянных предварительно, как указано в 5.4.1, на поверхность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара, изучают возможность расщепления мочевины, образования ацетоина и индола, ферментации сахарозы и маннита и подвижность.
5.4.5 Определение расщепления мочевины
Культуры пересевают штрихом на поверхность агара Кристенсена с мочевиной, приготовленного по 4.2.7.
Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.
При положительной реакции - расщеплении мочевины цвет среды от розового до светло-вишневого. Для уреазоположительных бактерий реакция часто становится видимой после 2 ч инкубирования.
Бактерии рода Salmonella не расщепляют мочевину.
5.4.6 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера)
Культуры пересевают в мясо-пептонный бульон с глюкозой, приготовленный по 4.2.10.
Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 48 ч.
Бактерии рода Salmonella не образуют ацетоина (реакция Фогес-Проскауера отрицательная).
5.4.7 Определение образования индола
Культуры пересевают в бульон Хоттингера, приготовленный по 4.2.11, или в мясо-пептонный бульон с L-триптофаном, приготовленный по 4.2.12.
Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.
Образование красного слоя указывает на положительную реакцию.
Бактерии рода Salmonella не образуют индол.
5.4.8 Определение ферментации маннита и сахарозы
Культуры пересевают в среды Гисса с маннитом или сахарозой, приготовленные по 4.2.13.
Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.
Бактерии рода Salmonella не сбраживают сахарозу, не сбраживают маннит. При сбраживании маннита цвет среды изменяется, образуется или не образуется газ.
5.4.9 Определение подвижности
Культуры пересевают уколом в полужидкий мясо-пептонный агар.
Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.
При росте подвижных культур отмечается диффузный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных культур - вдоль места укола.
Большинство штаммов бактерий рода Salmonella подвижны.
5.5 Результаты биохимического подтверждения культур оценивают, пользуясь таблицей приложения.
5.6 Серологическое подтверждение принадлежности культур к бактериям рода Salmonella
Серологическое подтверждение принадлежности к бактериям рода Salmonella проводят с культурами, давшими типичные биохимические реакции согласно приложению, и предварительно пересеянными, как указано в 5.4.1, на поверхность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара.
5.6.1 Определение самоагглютинирующих штаммов
Помещают каплю физиологического раствора, приготовленного по ГОСТ 10444.1, на тщательно очищенное предметное стекло. Диспергируют в этой капле часть тестируемой колонии так, чтобы получилась гомогенная и густая суспензия.
Покачивают осторожно стекло в течение 30-60 с. Отмечают результаты на темном фоне, лучше с помощью увеличительного стекла. Если наблюдается в разной степени склеивание бактерий, то есть образование осадка, то считают, что тестируемые штаммы обладают самоагглютинацией.
Штаммы бактерий, обладающие самоагглютинацией, не подвергают дальнейшей серологической идентификации.
5.6.2 Определение наличия 0-антигенов
Штаммы, у которых не выявлено самоагглютинации, испытывают в реакции агглютинации с агглютинирующими адсорбированными поливалентными сальмонеллезными сыворотками основных групп А, В, С, D, Е, а затем, если не выявлено 0-антигенов с сыворотками основных групп, ставят реакцию с сыворотками редких групп.
Подготовка сывороток к постановке реакции агглютинации и методика ее проведения указаны в наставлении, прилагаемом к сывороткам.
Агглютинация (наличие 0-антигенов) проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.
При отрицательной реакции агглютинации культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную смесь.
5.7 При определении биохимических и серологических характеристик выделенных культур в качестве контроля используют типичный по этим показателям штамм бактерий рода Salmonella, указанный в разд.3.
6 Оценка результатов
6.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
6.2 Интерпретация биохимических и серологических испытаний
Культуры, показавшие типичные биохимические и серологические реакции, относят к бактериям рода Salmonella.
Предположительно к бактериям рода Salmonella относят:
культуры, у которых не обнаружено самоагглютинации и 0-антигенов, но показавшие типичные биохимические реакции;
культуры, у которых обнаружена самоагглютинация и типичные биохимические реакции.
Культуры, у которых не обнаружено самоагглютинации, не давшие типичных биохимических и серологических реакций, не относят к бактериям рода Salmonella.
ПРИЛОЖЕНИЕ
(обязательное)
Биохимическая характеристика четырех подродов Salmonella
и атипичных видов, входящих в подрод Salmonella I
Наименование биохимических характеристик | Salmo- nella I | Salmo- nella II | Salmo- nella III-Arizona | Salmo- nella IV | Salmonella choleraesuis | Salmo- nella gallinarum | Salmonella paratyphi A | Salmo- nella pullorum | Salmo- nella typhi |
Образование индола | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
Образование ацетоина | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
Образование H S на трехсахарном агаре | + | + | + | + |  | + | - | + | + |
Расщепление мочевины | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
Подвижность | + | + | + | + | + | - | + | - | + |
Сбраживание глюкозы с образованием газа | + | + | + | + | + | - | + | (+) | - |
Сбраживание глюкозы с образованием кислоты | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
Сбраживание лактозы | - | - | | - | - | - | - | - | - |
Сбраживание сахарозы | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
Сбраживание маннита | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
Условные обозначения: "+" - 90-100% штаммов положительны; "(+)" - 76-89% штаммов положительны; " " - 26-75% штаммов положительны; "-" - 0-10% штаммов положительны. | |||||||||