ГОСТ 25999-83
Группа Н59
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКТЫ ПЕРЕРАБОТКИ ПЛОДОВ И ОВОЩЕЙ
Методы определения витаминов B
и В
Products of fruits and vegetables processing.
Methods of determination of vitamins B
and В
ОКСТУ 9109
Дата введения 1985-01-01
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством плодоовощного хозяйства СССР
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 14.12.83 N 5891
3. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
4. Ограничение срока действия снято по протоколу N 4-93 Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 4-94)
5. ПЕРЕИЗДАНИЕ
Настоящий стандарт распространяется на пищевые консервированные продукты из овощей, фруктов, ягод, овощей с мясом, крупами, молоком и устанавливает методы определения витаминов В
и В
.
Предел обнаружения массовой доли витамина B
составляет 0,008·10
%, витамина В
- 0,005·10
% при доверительной вероятности
=0,95.
1. ОТБОР ПРОБ
1.1. Отбор и подготовка проб - по ГОСТ 8756.0.
2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА B
(ТИАМИНА)
2.1. Сущность метода
Сущность метода основана на кислотном и ферментативном гидролизе связанных форм витамина, очистке гидролизата на колонке с катионитом, окислении тиамина в тиохром и измерении интенсивности флуоресценции при длинах волн 320-390 нм возбуждающего и 400-580 нм излучаемого света.
2.2. Аппаратура, материалы и реактивы
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, 1 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г.
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания 500 г и допускаемой погрешностью ±0,01 г.
рН-метр лабораторный с диапазоном измерений величины рН от 4 до 9 и допускаемой погрешностью ±0,05 рН в диапазоне измерений.
Термостат, обеспечивающий поддерживание температуры 37 °С, с погрешностью ±0,5 °С.
Флуорометр, с основной приведенной погрешностью не более 2%.
Электрошкаф сушильный лабораторный, обеспечивающий поддержание температуры 100 °С, с погрешностью ±8 °С.
Баня водяная.
Воронки делительные стеклянные по ГОСТ 25336 вместимостью 50 или 100 см
.
Воронки лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336 диаметром от 56 до 150 мм.
Колбы мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 1770 вместимостью 100, 250, 1000 см
.
Колбы лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336 вместимостью 250 см
.
Колонки для хроматографии. Состоят из соединенных между собой стеклянных трубок различного диаметра. Верхняя часть колонки должна быть длиной 9-10 см и внутренним диаметром 2,5-3,0 см, нижняя - длиной 14-15 см, внутренним диаметром 0,6-0,7 см. Колонку должны закрывать краном. При отсутствии крана в колонке она должна состоять из трех трубок: две верхние трубки должны иметь те же параметры, нижняя является капиллярной трубкой длиной 2,5-3,0 см, внутренним диаметром 0,10-0,15 см.
Палочки стеклянные по ГОСТ 25336.
Пипетки мерные лабораторные стеклянные по НТД вместимостью 1, 2, 5, 10, 20 см
.
Прибор для перегонки на шлифах.
Пробирки градуированные стеклянные по ГОСТ 25336 вместимостью 20, 25 см
.
Стаканы лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336 вместимостью 50, 200 см
.
Цилиндры мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 1770 вместимостью 10, 25, 50, 100, 250 см
.
Бумага индикаторная универсальная.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Аммоний роданистый по ГОСТ 27067, раствор с массовой долей 50%.
Калий железосинеродистый по ГОСТ 4206, раствор с массовой долей 1%. Хранят в темной склянке в течение двух дней.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, растворы с молярной концентрацией
(НСl)=0,1 моль/дм
и объемной долей 50%.
Калий хлористый по ГОСТ 4234, раствор с массовой долей 25% в растворе соляной кислоты
(НСl)=0,1 моль/дм
.
Кислота уксусная по ГОСТ 61, ледяная и раствор с массовой долей 3%.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, растворы с массовой долей 10 и 30%.
Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199, насыщенный раствор. Готовят растворением 200 г соли в 300 см
дистиллированной воды.
Катионит КРС-1п, КРС-ЗпТ40 или КРС-8п, фракция 0,5-1,0 мм.
Препарат ферментный амилоризин П10Х по ГОСТ 26142.
Препарат ферментный пектаваморин П10Х по НТД.
Спирт изобутиловый по ГОСТ 6016 (или
-бутиловый, изоамиловый). Перед использованием измеряют интенсивность флуоресценции. При наличии флуоресценции спирт очищают перегонкой.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962*.
___________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000.
Тиамина хлорид (или тиамина бромид), растворы с массовыми концентрациями 0,1; 0,001; 0,0001 г/дм
.
Фермент пепсин.
2.3. Подготовка к анализу
2.3.1. Приготовление стандартного раствора тиамина
Раствор готовят из тиамина следующим образом: тиамин предварительно высушивают в течение 2 ч в сушильном шкафу при 100 °С. Раствор с массовой концентрацией 0,1 г/дм
хранят в темной склянке в холодильнике в течение месяца. Растворы с массовыми концентрациями 0,01 и 0,0001 г/дм
готовят в день проведения анализа.
Для приготовления раствора с массовой концентрацией 0,1 г/дм
растворяют 0,100 г тиамина в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1000 см
, прибавляют 10 капель концентрированной соляной кислоты, доводят до метки водой и перемешивают.
Для приготовления раствора тиамина с массовой концентрацией 0,001 г/дм
1,0 см
раствора с концентрацией 0,1 г/дм
отбирают в мерную колбу вместимостью 100 см
, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.
Для приготовления раствора тиамина с массовой концентрацией 0,0001 г/дм
10,0 см
раствора с концентрацией 0,001 г/дм
отбирают в мерную колбу вместимостью 100 см
, доводят до метки дистиллированной водой и перемеш
ивают.
2.3.2. Обработка, регенерация катионита и заполнение колонок
Неиспользованный катионит предварительно заливают раствором соляной кислоты с объемной долей 50%, выдерживают в течение суток и промывают декантацией дистиллированной водой до удаления ионов железа. Отсутствие ионов железа проверяют по раствору роданистого аммония. Для этого в стакан вместимостью 50 см
прибавляют 5-10 см
воды после промывания катионита, 10 капель раствора соляной кислоты с объемной долей 50%, 3 см
раствора роданистого аммония. Промытый катионит должен иметь бесцветную реакцию промывной воды.
Перед заполнением колонки катионитом в нижнюю часть колонки над краном или над капиллярной трубкой помещают небольшое количество стеклянной ваты. Для заполнения колонки в нее наливают смесь катионита с водой после взбалтывания. Высота слоя катионита в колонке - 9-10 см.
Для регенерации катионита после проведения анализа в колонку наливают раствор гидроокиси натрия с массовой долей 10%, пропускают его до выхода из колонки и затем, закрыв кран, выдерживают 20-30 мин. При отсутствии в колонке крана на нижний конец ее должна быть надета резиновая трубка внутренним диаметром 0,3-0,4 см и поднята на уровень слоя жидкости в колонке. Катионит на колонке промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумаге.
2.3.3. Приготовление окислительной смеси
Окислительную смесь готовят смешиванием 2,0 см
раствора железосинеродистого калия с 10,0 см
раствора гидроокиси натрия с массовой долей 30%.
2.3.4. Приготовление гидролизата
Навеску пробы массой 50,0 г - для консервированного продукта без добавления витаминов, 20,0 г - с добавлением витаминов переносят в мерную колбу вместимостью 250 см
, прибавляют 150 см
раствора соляной кислоты
(НСl)=0,1 моль/дм
и нагревают на кипящей водяной бане в течение 40 мин. Затем охлаждают до комнатной температуры и проводят ферментативный гидролиз.
При анализе фруктовых и ягодных консервов с большим содержанием пектиновых веществ (из яблок, крыжовника, черной смородины и др.) используют ферментный препарат амилоризин П10Х и пектаваморин П10Х.
В остальных случаях используют только амилоризин П10Х.
Предварительно устанавливают величину рН 4,2-4,5. Для этого содержимое колбы помещают в стакан вместимостью 200 см
, прибавляют при постоянном перемешивании раствор уксуснокислого натрия до нужной величины рН. Измерение величины рН производят рН-метром, после этого содержимое стакана переносят в ту же колбу вместимостью 250 см
. Затем прибавляют 0,10 г амилоризина П10Х, или по 0,10 г амилоризина П10Х и пектаваморина П10Х перемешивают, закрывают пробкой и выдерживают в термостате при 37 °С в течение 12-16 ч. Гидролизат охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют.
Овощные консервы с мясом обрабатывают ферментами пепсином и амилоризином П10Х. Для этого в колбу помещают 0,10 г пепсина и выдерживают в термостате при 37 °С в течение 4 ч. Затем устанавливают величину рН 4,2-4,5, прибавляют 0,10 г амилоризина П10Х, перемешивают и снова выдерживают в термостате при той же температуре в течение 12-16 ч. После этого гидролизат охлаждают, доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют.
2.4. Проведение анализа
2.4.1. Очистка гидролизата
Перед очисткой гидролизата катионит на колонке переводят в Н-форму. Для этого через колонку пропускают 20,0 см
раствора уксусной кислоты, нагретой до температуры 60-70 °С. Затем в одну колонку вносят 20,0 см
гидролизата, в другую 20,0 см
стандартного раствора тиамина с массовой концентрацией 0,0001 г/дм
. Скорость пропускания через колонку - не менее 15 капель в 1 мин. После прохождения раствора катионит на колонке промывают дистиллированной водой три раза по 10 см
и вносят 20,0 см
раствора хлористого калия, нагретого до температуры 60-70 °С. Собирают 20,0 см
элюата в градуированные пробирки или цилиндры вместимостью 20 или 25 см
.
2.4.2. Окисление тиамина в тиохром
В две делительные воронки помещают по 5,0 см
элюата, полученного после очистки гидролизата пробы. В две другие - по 5,0 см
элюата, полученного после пропускания через колонку стандартного раствора тиамина. Затем в две воронки (с элюатами пробы и стандартного раствора) прибавляют по 1,20 см
окислительной смеси (окисленная форма), в две другие (с теми же растворами) - по 1,20 см
раствора гидроокиси натрия с массовой долей 30% (неокисленная форма). Содержимое воронок перемешивают, прибавляют по 10,0 см
изобутилового спирта и встряхивают в течение 1 мин. Для ускорения расслаивания после взбалтывания прибавляют по 0,50 см
этилового спирта. После расслаивания жидкостей нижний водный слой удаляют, а верхний органический слой сливают в кювету для измерения интенсивности флуоресценции. Измеряют сначала интенсивность флуоресценции стандартных растворов (окисленная и неокисленная форма), затем анализируемых проб.
2.5. Обработка результатов
Массовую долю витамина B
(
) в процентах вычисляют по формуле
,
где
- интенсивность флуоресценции окисленной формы анализируемого раствора;
- интенсивность флуоресценции неокисленной формы анализируемого раствора;
- интенсивность флуоресценции окисленной формы стандартного раствора;
- интенсивность флуоресценции неокисленной формы стандартного раствора;
- масса тиамина в 5 см
стандартного раствора, взятая для окисления, г;
- коэффициент пересчета тиамина бромида на тиамина хлорид, при использовании для приготовления стандартного раствора тиамина хлорида
=1; тиамина бромида
=1,17;
- общий объем гидролизата, см
;
- объем элюата, взятый для окисления, см
;
- масса навески продукта, г.
За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений с доверительной вероятностью 0,95, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать: 0,004·10
% абс. - при массовой доле витамина B
не более 0,050·10
%; 0,060·10
% абс. - при массовой доле витамина В
более 0,050·10
%.
3. РИБОФЛАВИНОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В
3.1. Сущность метода
Сущность метода основана на кислотном и ферментативном гидролизе связанных форм витамина, окислении пигментов марганцовокислым калием, восстановлении рибофлавина гидросульфитом натрия и измерении интенсивности флуоресценции до и после восстановления при длинах волн 360-480 нм возбуждающего и 510-650 нм излучаемого света.
Метод предназначен для анализа слабоокрашенных овощных, фруктовых и ягодных консервированных продуктов.
3.2. Аппаратура, материалы и реактивы
Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы, указанные в п.2.2, со следующими дополнениями.
Эксикатор вакуумный по ГОСТ 25336.
Колбы лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336 вместимостью 50 см
.
Водорода перекись по ГОСТ 10929, раствор с массовой долей 3%. Срок хранения семь дней.
Калий марганцовокислый по ГОСТ 20490, раствор с массовой долей 3%. Срок хранения семь дней.
Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор с массовой долей 93,6-95,6%.
Натрия гидросульфит технический по ГОСТ 246.
Рибофлавин, растворы с массовыми концентрациями 0,02 и 0,001 г/дм
.
3.3. Подготовка к анализу
3.3.1. Приготовление стандартного раствора рибофлавина
Раствор готовят из рибофлавина следующим образом: предварительно высушивают рибофлавин в вакуум-эксикаторе над концентрированной серной кислотой. Раствор с концентрацией 0,02 г/дм
хранят в холодильнике в течение месяца. Раствор с концентрацией 0,001 г/дм
готовят в день проведения анализа.
Для приготовления стандартного раствора рибофлавина с массовой концентрацией 0,02 г/дм
в мерную колбу вместимостью 1000 см
помещают 0,020 г рибофлавина, прибавляют около 750 см
дистиллированной воды, 1,0 см
ледяной уксусной кислоты и слегка нагревают при перемешивании до растворения. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки дистиллированной водой и снова перемешивают.
Для приготовления раствора рибофлавина с массовой концентрацией 0,001 г/дм
отбирают 5,0 см
раствора с массовой концентрацией 0,02 г/дм
в мерную колбу вместимостью 100 см
, доводят до метки дистиллированной водой и перемешив
ают.
3.3.2. Приготовление гидролизата
Приготовление гидролизата проводят по п.2.3.4, с дополнением, указанным ниже.
Для определения поправки на содержание витамина В
в ферментах одновременно проводят контрольный опыт. В мерную колбу вместимостью 250 см
помещают 150 см
раствора соляной кислоты
(НСl)=0,1 моль/дм
, устанавливают с помощью раствора уксуснокислого натрия величину рН 4,2-4,5. Прибавляют 0,10 г амилоризина П10Х или по 0,10 г амилоризина П10Х и пектаваморина П10Х и выдерживают в термостате при 37 °С в течение 12-16 ч.
При использовании амилоризина П10Х и пепсина в колбу с раствором соляной кислоты
(НСl)=0,1 моль/дм
прибавляют сначала 0,10 г пепсина и выдерживают в термостате 4 ч при той же температуре. Затем устанавливают величину рН 4,2-4,5, прибавляют 0,10 г амилоризина П10Х и снова выдерживают 12-16 ч при 37 °С. После этого содержимое колбы охлаждают, доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют.
Контрольный опыт проводят один раз для каждой партии ферментов
.
3.4. Проведение анализа
3.4.1. В две колбы вместимостью 50 см
каждая помещают по 10,0 см
гидролизата пробы, в третью колбу - 10,0 см
гидролизата контрольного опыта. В одну колбу с анализируемым гидролизатом прибавляют 1,0 см
стандартного раствора рибофлавина с концентрацией 0,001 г/дм
, в две другие - по 1,0 см
дистиллированной воды. Во все колбы прибавляют по 1,0 см
ледяной уксусной кислоты, 0,50 см
раствора марганцовокислого калия, перемешивают и выдерживают 2 мин. Затем прибавляют по 0,50 см
раствора перекиси водорода и снова перемешивают. Через 5 мин измеряют интенсивность флуоресценции сначала раствора с добавкой рибофлавина, затем раствора без добавки и контрольного опыта. Измерение интенсивности флуоресценции каждого раствора производят сначала без прибавления гидросульфита натрия, затем после его прибавления. Гидросульфит натрия прибавляют порциями по 0,02-0,05 г, быстро перемешивают и снова производят измерение. Эту операцию повторяют до установления наименьшей интенсивности флуоресценц
ии.
3.5. Обработка результатов
Массовую долю витамина В
(
) в процентах вычисляют по формуле
,
где
- интенсивность флуоресценции раствора анализируемой пробы до прибавления гидросульфита натрия;
- интенсивность флуоресценции раствора анализируемой пробы после прибавления гидросульфита натрия;
- интенсивность флуоресценции раствора контрольного опыта до прибавления гидросульфита натрия;
- интенсивность флуоресценции раствора контрольного опыта после прибавления гидросульфита натрия;
- интенсивность флуоресценции раствора анализируемой пробы с добавкой рибофлавина до прибавления гидросульфита натрия;
- интенсивность флуоресценции раствора анализируемой пробы с добавкой рибофлавина после прибавления гидросульфита натрия;
- масса рибофлавина в стандартном растворе рибофлавина, добавленная в гидролизат анализируемой пробы, г;
- общий объем гидролизата, см
;
- объем гидролизата, взятый для окисления, см
;
- масса навески продукта, г.
За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений с доверительной вероятностью 0,95, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать: 0,008·10
% абс. при массовой доле витамина В
не более 0,050·10
%; 0,020·10
% абс. - при массовой доле витамина В
более 0,050·10
%.
4. ЛЮМИНОФЛАВИНОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В
4.1. Сущность метода
Сущность метода основана на кислотном и ферментативном гидролизе связанных форм витамина, окислении пигментов марганцовокислым калием, облучении светом для перевода рибофлавина в люмифлавин, экстракции люмифлавина хлороформом и измерении интенсивности флуоресценции при длинах волн 360-480 нм возбуждающего и 510-650 нм излучаемого света.
Метод предназначен для анализа овощных консервов с мясом и крупами, а также темноокрашенных консервированных продуктов.
4.2. Аппаратура, материалы и реактивы
Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы, указанные в пп.2.2; 3.2, с дополнениями, указанными ниже.
Вентилятор бытовой по ГОСТ 7402.
Лампа накаливания электрическая общего назначения по ГОСТ 2239, мощностью 100, 150, 200 Вт.
Бюретки по НТД вместимостью 50, 100 см
.
Воронки лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336 диаметром 36 мм.
Воронки делительные стеклянные по ГОСТ 25336 вместимостью 250 см
.
Колбы лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336 плоскодонные или конические с взаимозаменяемым конусом, вместимостью 100 см
.
Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор с массовой долей 30%.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с молярной концентрацией
(NaOH)=7 моль/дм
.
Натрий сернокислый по ГОСТ 4166, безводный.
Хлороформ технический по ГОСТ 20015, высшего сорта. Перед использованием измеряют интенсивность флуоресценции. При наличии флуоресценции очищают перегонкой.
4.3. Подготовка к анализу
Подготовку к анализу проводят по пп.2.3.4; 3.3.1; 3.3.2.
4.4. Проведение анализа
4.4.1. Очистка гидролизата
В колбу вместимостью 250 см
помещают 100 см
анализируемого гидролизата, в другую - 100 см
гидролизата контрольного опыта. В обе колбы прибавляют по 2,0 см
раствора серной кислоты. Затем пипеткой с делениями по каплям при постоянном перемешивании прибавляют раствор марганцовокислого калия до слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Избыток розового окрашивания устраняют прибавлением по каплям раствора перекиси водорода. Отмечают израсходованные объемы растворов марганцовокислого калия и перекиси водорода. Полученный раствор переносят в делительную воронку вместимостью 250 см
, прибавляют 30-50 см
хлороформа и встряхивают 0,5 мин. Хлороформный слой удаляют, а водный экстракт используют для анализа.
4.4.2. Облучение экстракта и получение люмифлавина
В две колбы вместимостью 100 см
каждая прибавляют по 20,0 см
анализируемого экстракта, в третью - экстракт контрольного опыта. В колбу с анализируемым экстрактом прибавляют 2,0 см
стандартного раствора рибофлавина с массовой концентрацией 0,001 г/дм
и затем во все колбы по 4,0 см
раствора гидроокиси натрия с молярной концентрацией
(NaOH)=7 моль/дм
. Содержимое перемешивают, колбы закрывают пришлифованными пробками и облучают светом электролампы мощностью 100-200 Вт с расстояния (30±1) см в течение 40 мин.
Температура раствора должна быть от 15 до 25 °С. Для охлаждения используют настольный вентилятор. После облучения в колбы прибавляют по 4,0 см
ледяной уксусной кислоты, перемешивают, прибавляют по 20,0 см
хлороформа и снова перемешивают в течение 0,5 мин. Содержимое колб переносят в делительные воронки вместимостью 50 см
и после расслаивания хлороформный раствор фильтруют в кюветы для измерения интенсивности флуоресценции. Для обезвоживания хлороформного раствора на воронку с фильтром помещают около 2,5 г безводного сернокислого натрия.
После этого измеряют интенсивность флуоресценции сначала раствора с добавкой рибофлавина, затем раствора без добавки и контрольного оп
ыта.
4.5. Обработка результатов
Массовую долю витамина В
(
) в процентах вычисляют по формуле
,
где
- интенсивность флуоресценции хлороформного экстракта анализируемой пробы;
- интенсивность флуоресценции хлороформного экстракта контрольного опыта;
- интенсивность флуоресценции хлороформного экстракта анализируемой пробы с добавкой рибофлавина;
- масса рибофлавина в стандартном растворе, добавленная в экстракт анализируемой пробы, г;
- общий объем гидролизата, см
;
- объем гидролизата, взятый для окисления, см
;
- объем раствора серной кислоты с массовой долей 30%, прибавленный в гидролизат перед окислением, см
;
- объем раствора марганцовокислого калия, израсходованный на окисление гидролизата, см
;
- объем раствора перекиси водорода, израсходованный на устранение избытка марганцовокислого калия, см
;
- объем экстракта, взятый для облучения, см
;
- масса навески продукта, г.
За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений с доверительной вероятностью 0,95, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 0,010·10
% абс. - при массовой доле витамина В
не более 0,050·10
%; 0,070·10
% абс. - при массовой доле витамина В
более 0,050·10
%.
Текст документа сверен по:
официальное издание
Продукты переработки плодов и овощей.
Методы анализа: Сб. ГОСТов. -
М.: ИПК Издательство стандартов, 2002
