ГОСТ Р 53139-2008 Соки и соковая продукция. Идентификация. Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом.

ГОСТ Р 53139-2008

Группа Н59

 НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 СОКИ И СОКОВАЯ ПРОДУКЦИЯ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ

 Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом

 Juices and juice products. Identification. Determination of ascorbic acid by enzymatic method

ОКС 67.080

ОКСТУ 9109

Дата введения 2010-01-01

 Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования "Московский государственный университет пищевых производств" Министерства образования и науки Российской Федерации (ГОУ ВПО МГУПП)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки фруктов, овощей и грибов" и Государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования "Московский государственный университет пищевых производств" Министерства образования и науки Российской Федерации (ГОУ ВПО МГУПП)

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 декабря 2008 г. N 568-ст

4 В настоящем стандарте учтены основные нормативные положения следующих международных (региональных) стандартов:

- CODEX-STAN 247-2005 "Единый стандарт на фруктовые соки и нектары" (CODEX-STAN 247-2005 "Codex general standard for fruit juices and nectars") в части требований к обеспечению качества, подлинности, необходимого состава и методов оценки показателей соков и нектаров;

- ИФУ N 5:2000 "Рекомендации к анализу витамина С" Сборник методов физико-химического анализа соков Международной федерации производителей фруктовых соков [IFU Recommendation No. 5, 2000 "Recommendations for Vitamin C Analysis", (International Federation of Fruit Juice Produces)]

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

      1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на соки и соковую продукцию, включая соки и соковую продукцию для детского питания, в т.ч. фруктовые и овощные соки, нектары, морсы и сокосодержащие напитки, фруктовые и овощные пюре, а также на концентрированные фруктовые и овощные соки, концентрированные морсы, концентрированные фруктовые и овощные пюре и устанавливает метод ферментативного определения массовой концентрации аскорбиновой кислоты (витамина С) в виде кислоты или ее соли. Диапазон определения массовой концентрации аскорбиновой кислоты составляет от 0,0003 до 0,2 г/дм

включительно.

      2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 245-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 841-64* Реактивы. Кислота метафосфорная. Технические условия

ГОСТ 1625-89 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3652-69 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб

ГОСТ 26671-85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-2-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

      3 Обозначения и сокращения

В настоящем стандарте применены следующие сокращения и обозначения:

МТТ - бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия,

ФМС - переносчик электронов - феназинметосульфат,

МТТ - формазан - комплекс МТТ и формазана,

АО - аскорбатоксидаза.

      4 Сущность метода

Аскорбиновая кислота (витамин С) и другие редуцирующие вещества

восстанавливают бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия (МТТ) в присутствии переносчика электронов феназинметосульфата (ФМС) при рН 3,5 до комплекса МТТ-формазана. В кювете с пробой измеряют сумму редуцирующих веществ:

Для обеспечения специфичного определения аскорбиновой кислоты в контрольной кювете проводят окисление аналита аскорбатоксидазой (АО) в присутствии кислорода воздуха. Образующаяся дегидроаскорбиновая кислота не взаимодействует с МТТ и ФМС:

.

Количество образовавшегося комплекса МТТ-формазан, эквивалентное количеству аскорбиновой кислоты в исходной пробе, определяют спектрофотометрическим измерением оптической плотности исследуемого раствора пробы при длине волны 578 нм.

      5 Отбор проб

5.1 Отбор проб - по ГОСТ 26313, подготовка проб - по ГОСТ 26671.

      6 Проведение определения

      6.1 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

Гидроокись калия по ГОСТ 24363, ч.д.а., раствор молярной концентрации

(KОН)=10 моль/дм

.

Поливинилполипирролидон (код пищевой добавки Е1202) с содержанием основного вещества не менее 95% по [1].

Фосфорнокислый однозамещенный 2-водный натрий, NaH

PO

·2

Н

О по ГОСТ 245, ч.д.а.

Лимонная кислота моногидрат, С

Н

О

·

Н

О, по ГОСТ 3652, ч.д.а.

Аскорбиновая кислота, С

Н

О

по [2], [3], х.ч.

Формалин по ГОСТ 1625, раствор с объемной долей 5%.

3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолий бромид (МТТ) с содержанием основного вещества не менее 95% по [1].

Феназинметосульфат (феназин/ФМС) с содержанием основного вещества не менее 95% по [1].

Аскорбатоксидаза (сухой лиофилизат/АО), Е 1.10.3.3 с содержанием основного вещества не менее 95% по [1].

Метафосфорная кислота, (НРО

)

, по ГОСТ 841, раствор массовой концентрации 15 г/дм

.

Дистиллированная вода по ГОСТ 6709.

Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения при длине волны 578 нм, или фотометр фотоэлектрический с шириной спектральной полосы не более 10 нм и допустимой абсолютной погрешностью измерений не более ±1%, или спектрофотометр на ртутной лампе, позволяющий проводить измерения при 578 нм.

Кюветы из оптического стекла или полимерных материалов с длиной оптического пути 1 см.

Держатель для кювет.

Иономер или рН-метр с погрешностью измерения не более ±0,05 рН.

Пипетки номинальной вместимостью 0,01, 0,02, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5 и 10 см

с относительной погрешностью дозирования

±1%

по ГОСТ 29227 1-го класса точности или дозаторы пипеточные с аналогичными или изменяемыми объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более

±1% [4]

или импортные с аналогичными характеристиками.

Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 100, 250 и 1000 см

.

Стаканы по ГОСТ 25336 вместимостью 20 и 200 см

.

Цилиндры по ГОСТ 1770 вместимостью 50 и 100 см

.

Лабораторная воронка по ГОСТ 25336 диаметром 5 см.

Часы лабораторные.

Электроплитка.

Термометр жидкостный стеклянный по ГОСТ 28498 для диапазона температур от 0 °С до 100 °С с пределом допускаемой погрешности не более ±1 °С.

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,1 мг.

Шпатели пластиковые или палочки стеклянные оплавленные длиной от 8 до 10 см диаметром 2-3 мм для перемешивания содержимого кювет при проведении ферментативного определения.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Водяной или воздушный термостат, обеспечивающий поддержание заданной температуры ферментативной реакции в диапазоне 30 °С - 40 °С и контроль температуры с погрешностью не более 0,5 °С.

Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательные устройства с техническими характеристиками, а также реактивы, в том числе готовые наборы реактивов, по качеству не ниже перечисленных в настоящем разделе.

      6.2 Приготовление растворов реактивов*

________________

* Допускается использование готового набора реактивов для ферментативного определения аскорбиновой кислоты производства "Roche Diagnostics/R-Biopharm AG" (номер набора 10 409 677 035) согласно схеме дозирования и смешивания реактивов, прилагаемой к набору. Указанный набор реактивов является рекомендуемым для применения. Эта информация дана для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение этого набора реактивов.

6.2.1 Фосфатно-цитратный буферный раствор (натрий фосфорнокислый однозамещенный молярной концентрации 0,2 моль/дм

, раствор моногидрата лимонной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм

, рН 3,6)

Растворяют 35,6 г натрия фосфорнокислого однозамещенного в мерной колбе вместимостью 1000 см

в 500 см

дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.

Растворяют 21,0 г лимонной кислоты моногидрата в мерной колбе вместимостью 1000 см

в 500 см

свежей дистиллированной воды. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.

Для приготовления фосфатно-цитратного буферного раствора с рН 3,6 смешивают 31,6 частей раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного молярной концентрации 0,2 моль/дм

и 68,4 частей раствора моногидрата лимонной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм

.

Фосфатно-цитратный буферный раствор годен для применения в течение 1 мес при условии хранения при температуре 4 °С. Перед использованием необходимо контролировать рН и температуру фосфатно-цитратного буферного раствора, значения которых должны составлять соответственно 3,6 и 20 °С - 25 °С. Контроль температуры осуществляют термометром. При отклонении от требуемого значения рН фосфатно-цитратный буферный раствор готовят заново.

6.2.2 Рабочий раствор МТТ массовой концентрации 5 мг/см

Растворяют 200 мг МТТ в 40 см

фосфатно-цитратного буферного раствора с рН 3,6 (см. 6.2.1). Объем рабочего раствора МТТ достаточен для проведения примерно 20 отдельных определений аскорбиновой кислоты (см. 6.4).

Рабочий раствор МТТ годен для применения в течение 1 мес при условии хранения при температуре 4 °С (без доступа света!). Перед использованием необходимо контролировать рН и температуру рабочего раствора МТТ, значения которых должны составлять соответственно 3,6 и 20 °С - 25 °С. Контроль температуры осуществляют термометром. При отклонении от требуемого значения рН рабочий раствор МТТ готовят заново.

6.2.3 Рабочий раствор ФМС массовой концентрации 0,6 мг/см

Растворяют 30 мг ФМС в 50 см

дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива и нагретой на электроплитке до 40

°

С - 50 °С. Рабочий раствор ФМС годен для применения в течение 12 мес при условии хранения при температуре 4

°

С. Незначительно красное окрашивание, которое может появиться при хранении рабочего раствора ФМС, не влияет на результаты ферментативного определения аскорбиновой кислоты.

6.2.4 Рабочий раствор АО (1700 U/см

)

*

________________

* Допускается использовать в определении готовые препараты аскорбатоксидазы. Аскорбатоксидаза, иммобилизованная на пластиковом шпателе на целлюлозной подложке (рабочая активностью фермента 17 U), входит в состав готового набора реактивов для определения аскорбиновой кислоты производства "Roche Diagnostics/R-Biopharm AG" (номер набора 10 409 677 035). Пример схемы ферментативного определения с использованием готового набора реактивов приведен в таблице 3. Указанный набор реактивов является рекомендуемым для применения. Эта информация дана для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение этого набора реактивов.

Навеску сухого лиофилизата, соответствующую активности фермента 1700 U, растворяют в 1,0 см

фосфатно-цитратного буферного раствора с рН 3,6 (см. 6.2.1). Раствор готовят непосредственно перед использованием.

6.2.5 Раствор гидроокиси калия молярной концентрации

(KОН)=10 моль/дм

Растворяют 14,03 г гидроокиси калия в мерной колбе вместимостью 250 см

в 150 см

дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки.

6.2.6 Раствор формалина с объемной долей 5%

В химический стакан на 20 см

вносят 3 см

раствора формалина с объемной долей формальдегида 35%. Добавляют 4 см

дистиллированной воды. Раствор перемешивают стеклянной палочкой и используют для подготовки пробы согласно 6.3.3.

6.2.7 Раствор метафосфорной кислоты массовой концентрации (НРО

)

=15 г/дм

Растворяют 15 г метафосфорной кислоты массовой долей 33,5% в мерной колбе вместимостью 1000 см

в 500 см

дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки.

      6.3 Подготовка пробы

Концентрированные соки и пюре перед определением восстанавливают согласно нормативным документам свежей дистиллированной водой до содержания растворимых сухих веществ согласно нормативным документам для соответствующего вида продукции.

6.3.1 Прозрачные или мутные слабоокрашенные пробы

С помощью раствора гидроокиси калия (10 моль/дм

) проводят корректировку рН пробы до значения 3,5-4,0. В зависимости от количества аскорбиновой кислоты пробу разбавляют дистиллированной водой или раствором метафосфорной кислоты (15 г/дм

) согласно таблице 1.

Таблица 1

Массовая концентрация аскорбиновой кислоты в пробе*, г/дм	Разбавление	Фактор разбавления F
<0,20	-	1
0,20-2,0	1+9	10
2,0-20,0	1+99	100
>20	1+999	1000
* Для оценки количества аскорбиновой кислоты используют документы, содержащие сведения о составе соков и соковой продукции [5].

Пробу, содержащую мутную взвесь, после разбавления фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Для определения аскорбиновой кислоты используют визуально прозрачный слабоокрашенный фильтрат в количестве 0,100 см

.

6.3.2 Прозрачные или мутные сильноокрашенные пробы

С помощью раствора гидроокиси калия молярной концентрации 10 моль/дм

проводят корректировку рН пробы до значения 3,5-4,0. В зависимости от количества аскорбиновой кислоты пробу разбавляют дистиллированной водой или раствором метафосфорной кислоты массовой концентрации 15 г/дм

согласно таблице 1.

Для удаления природных красящих пигментов к 10 см

пробы добавляют 100 мг поливинилполипирролидона. Пробу перемешивают в течение 1 мин, затем фильтруют через бумажный складчатый фильтр.

Для определения аскорбиновой кислоты используют визуально прозрачный слабоокрашенный фильтрат в количестве 0,100 см

.

6.3.3 Подготовка проб, содержащих в повышенных количествах диоксид серы

К 10 см

пробы добавляют одну каплю разбавленного раствора формалина объемной долей 5%. Пробу перемешивают и выдерживают 5 мин при комнатной температуре. Значение рН пробы при необходимости корректируют раствором гидроокиси калия (10 моль/дм

) и разбавляют согласно таблице 1. Мутные пробы дополнительно фильтруют (см. 6.3.1, 6.3.2). Сильноокрашенные пробы обрабатывают поливинилполипирролидоном согласно 6.3.2.

В определении по 4.5 используют от 0,200 до 0,500 см

фильтрата.

      6.4 Условия определения

Длина волны при фотометрическом измерении составляет 578 нм. Для измерения используют стеклянную кювету* с толщиной оптического слоя 1 см, равной ширине грани. Ферментативное определение проводят при температуре 37

°

С. Общий объем инкубационной смеси в кювете составляет 2,70 см

.

________________

* Вместо кювет из оптического стекла допускается использование одноразовых кювет из полимерных материалов.

Измерение оптической плотности инкубационной смеси проводят против воздуха (без кюветы в световом пути прибора). Проба в инкубационной смеси в кювете должна содержать от 0,5 до 20 мкг аскорбиновой кислоты в 0,1-1,6 см

пробы.

      6.5 Ферментативное определение

Ферментативное определение аскорбиновой кислоты в пробе проводят по схеме дозирования и смешивания реактивов, приведенной в таблице 2. Если в определении используют иммобилизованную АО и готовые наборы реактивов, дозирование и смешивание реактивов проводят по схеме таблицы 3.

Таблица 2 - Схема дозирования и смешивания реактивов для ферментативного определения аскорбиновой кислоты

Дозирование в кювету	Контрольная проба	Проба
Рабочий раствор МТТ* (см. 6.2.2)	1,000 см	1,000 см
Дистиллированная вода	1,490 см	1,500 см
Проба** (см. 6.3)	0,100 см	0,100 см
Рабочий раствор АО (см. 6.2.4)	0,01 см	-
Перемешивают. Помещают контрольную кювету и кювету с пробой в термостат при температуре 37 ° С. В течение 6 мин*** интенсивно перемешивают содержимое кюветы с контрольной пробой пластиковой или стеклянной палочкой с целью насыщения инкубационной смеси воздухом (необходимое условие полного окисления аскорбиновой кислоты в контрольной пробе!). После выдержки в контрольной кювете и в кювете с пробой измеряют значение оптической плотности . Продолжают реакцию добавлением:
Рабочий раствор ФМС**** (см. 6.2.3)	0,100 см	0,100 см
Перемешивают. Инкубируют (в темноте!) при температуре 37 ° С в течение 15 мин, после чего немедленно измеряют значение оптической плотности в кювете с контрольной пробой и в кювете с пробой.
* Температура раствора должна составлять 37 °С.     ** Перед дозированием в кювету пипетку или наконечник дозатора следует ополоснуть фильтратом пробы (см. 6.3).     *** При определении аскорбиновой кислоты в пробах, содержащих повышенные количества диоксида серы, время выдержки кюветы с контрольной пробой увеличивают до 10 мин.     **** После внесения рабочего раствора ФМС кюветы изолируют от доступа света.

Таблица 3 - Схема дозирования и смешивания реактивов для ферментативного определения аскорбиновой кислоты при использовании иммобилизованной АО

Дозирование в кювету	Контрольная проба		Проба
Рабочий раствор МТТ (см. 6.2.2)	1,000 см		1,000 см
Дистиллированная вода	1,500 см		1,500 см
Проба (см. 6.3)	0,100 см		0,100 см
Иммобилизованная АО	Один шпатель		-
Перемешивают. Помещают контрольную кювету и кювету с пробой в термостат при температуре 37 ° С. В течение 6 мин интенсивно перемешивают содержимое кюветы с контрольной пробой шпателем с иммобилизованной АО с целью насыщения инкубационной смеси воздухом (необходимое условие полного окисления аскорбиновой кислоты в контрольной пробе!). После выдержки в контрольной кювете и в кювете с пробой измеряют значение оптической плотности . Продолжают реакцию добавлением:
Рабочий раствор ФМС (см. 6.2.3)	0,100 см		0,100 см
Перемешивают. Инкубируют (в темноте!) при температуре 37 ° С в течение 15 мин, после чего немедленно измеряют значение оптической плотности в кювете с контрольной пробой и в кювете с пробой.

      7 Обработка результатов измерений

Значение разницы между конечным и начальным значениями оптической плотности контроля и пробы рассчитывают по формуле

.                                      (1)

Значение разницы оптических плотностей

должно составлять не менее 0,100.

Искомую массовую концентрацию аскорбиновой кислоты в исходной пробе, г/дм

, рассчитывают по общей формуле

,                                                (2)

где

- общий объем инкубационной смеси, см

;

- объем пробы, см

;

- молекулярный вес аскорбиновой кислоты или аскорбата (176,13 и 175,12 г/моль соответственно);

- длина оптического пути кюветы, см;

- молярный коэффициент оптической плотности формазана (при измерении и длине волны 578 нм составляет 16,9 дм

/ммоль·см).

Подставляя в формулу (2) необходимые значения для аскорбиновой кислоты, получают модифицированную формулу (3) для расчета массовой концентрации аскорбиновой кислоты (в г/дм

) в пробе:

.                              (3)

Если перед ферментативным определением проба подвергалась разбавлению, то результат, полученный по формуле (3), умножают на коэффициент разбавления

.

В случае концентрированных соков или пюре результат определения выражают в г/100 г продукта. Расчет осуществляют с учетом навески, взятой для получения восстановленного продукта (см. 6.3), по формуле

,*                                                           (4)

где

* - массовая концентрация аскорбиновой кислоты в исследованной пробе, рассчитанная по формуле (2), г/дм

;

- навеска концентрированного сока или пюре, взятая для получения восстановленного продукта (см. 6.3), г.

      8 Дополнительные указания

8.1 Факторы, влияющие на определение

Если общая разница оптических плотностей

менее 0,100, то необходимо повторно провести определение, используя большую навеску или увеличенный объем пробы, дозируемой в инкубационную смесь (до 1,490 см

по схеме дозирования таблицы 2 или до 1,500 см

по схеме дозирования таблицы 3). В этом случае объем воды, добавляемой в кювету, должен быть уменьшен на соответствующее значение для сохранения общего объема инкубационной смеси (2,70 см

) в кювете с неизменными контролем и пробой. Увеличенный объем пробы необходимо принимать во внимание при расчете конечного результата согласно формуле (3).

8.2 Специфичность определения

Метод специфичен для определения общей аскорбиновой кислоты, включающей D- и L-изомеры.

В анализе коммерческих препаратов аскорбиновой кислоты (например, витаминов) в свежеприготовленных растворах можно ожидать, что степень повторного нахождения искомого вещества составит 94% - 100%. На качество результатов определения степени повторного нахождения влияет срок хранения коммерческого препарата аскорбиновой кислоты и растворитель, используемый для получения растворов. Рекомендуется использовать раствор метафосфорной кислоты (см. 4.1) с доведением рН пробы до 3,5-4,0.

На стабильность аскорбиновой кислоты в водных растворах сильно влияет присутствие ионов металлов, например железа и меди, а также наличие в пробе кислорода. В этом случае ожидаемая степень повторного нахождения будет составлять менее 100%, что обусловливается частичной потерей аскорбиновой кислоты.

С помощью настоящего ферментативного метода нельзя определить L-аскорбилпальмитат, так как в ходе щелочного гидролиза происходит спонтанное разрушение свободной аскорбиновой кислоты.

8.3 Причины возможных ошибок при проведении определения

Сахароза, содержащаяся в соках и соковой продукции, не мешает определению, если ее концентрация в кювете не превышает 30 мг.

Определению аскорбиновой кислоты мешает D-сорбит (при концентрации более 20 мг в кювете), который ингибирует аскорбатоксидазу, а также этанол в высоких концентрациях, превышающих 100 мг/кювета. Влияние большинства мешающих факторов на результат определения исключается путем увеличения длительности инкубации контрольной пробы с аскорбатоксидазой до 10 мин.

Диоксид серы в высоких концентрациях, превышающих 50 мкг/кювета, взаимодействует с МТТ и ФМС и вызывает тем самым медленно текущую реакцию. В этом случае пробу подвергают предварительной обработке согласно 6.3.3.

Ионы металлов в концентрациях более 100 мкг/кювета могут понизить рН системы и, тем самым, ингибировать действие аскорбатоксидазы.

Нитрит, который может содержаться в некоторых овощных соках, не мешает определению. Однако его присутствие в системе может привести к спонтанному распаду аскорбиновой кислоты.

Ионы оксалата в концентрациях от 30 мкг/кювета способны оказывать значительное ингибирующее действие на аскорбатоксидазу. Высокую концентрацию оксалата устраняют путем добавления ионов кальция до концентрации 30 мкг/кювета и выше, а также созданием в системе слабокислой среды (рН 5-6).

8.4 Выявление и устранение мешающих факторов при проведении анализа.

Контроль ферментативного определения

8.4.1 Общие указания

Если разница оптических плотностей

менее 0,100, следует провести повторную подготовку пробы к определению, увеличив ее навеску или уменьшив разбавление. Значение рН пробы в любом определении должно находиться в интервале от 3,5 до 4,0.

8.4.2 Операции с контрольной пробой

Содержимое кюветы с контрольной пробой интенсивно перемешивают стеклянной или пластиковой палочкой (или шпателем с иммобилизованной АО

) в течение предварительной реакции.

После внесения рабочего раствора ФМС реакция проявляет повышенную чувствительность к свету, поэтому инкубирование при температуре 37 °С необходимо проводить в полной темноте. Для чего кюветы, находящиеся, например, в держателе, помещенном в водяной или воздушный термостат, накрывают плотной светонепроницаемой тканью. Попадание света приводит к возникновению нежелательной медленно текущей реакции.

В случае медленно текущей реакции, вызванной попаданием света, значение оптической плотности

системы определяют в соответствии с рекомендациями 6.4.5. Так как кюветы с пробой и контрольной пробой содержат одинаковый объем инкубационной смеси, медленно текущие реакции в них идентичны. От экстраполяции в этом случае можно отказаться. Однако необходимо принимать во внимание, что оптическую плотность

в кювете с контрольной пробой и в кювете с пробой необходимо измерять непосредственно одну за другой.

Если разница оптических плотностей

контрольной пробы менее 0,020, то следует соблюдать следующие правила: рабочий раствор МТТ должен храниться в темноте; при использовании рабочего раствора МТТ его нельзя подвергать прямому облучению солнечным или электрическим светом; содержимое кюветы с контрольной пробой необходимо интенсивно перемешивать стеклянной или пластиковой палочкой (или шпателем с иммобилизованной АО) с целью насыщения инкубационной смеси воздухом; после внесения в инкубационную смесь рабочего раствора ФМС кюветы с контрольной пробой и пробой защищают от солнечного или электрического света.

8.4.3 Стабильность аскорбиновой кислоты

Водные растворы аскорбиновой кислоты нестабильны. При анализе твердых проб рекомендуется проводить выделение аскорбиновой кислоты раствором метафосфорной кислоты концентрации 15 г/дм

. После экстрагирования рН вытяжки корректируют раствором гидроокиси калия (10 моль/дм

) до 3,5-4,0.

Для стабилизации аскорбиновой кислоты не рекомендуется применять растворы оксалатов, так как их ионы ингибируют аскорбатоксидазу.

Разбавление пробы дистиллированной водой или метафосфорной кислотой проводят непосредственно перед определением. В этом случае нет необходимости в проведении корректировки рН до 3,5-4,0.

8.4.4 Медленно текущие реакции

Из практики применения метода следует, что оптическая плотность инкубационной смеси может увеличиваться даже после окончания ферментативной реакции (возникает медленно текущая реакция). В этом случае расчет значения конечной оптической плотности проводят экстраполированием на момент внесения в инкубационную смесь рабочего раствора ФМС (см. 6.2.3).

Экстраполяцию проводят графическим способом или согласно следующей схеме: по истечении 15 мин после добавления в кюветы рабочего раствора ФМС (см. 6.2.3) проводят измерение оптической плотности

, измерения повторяют каждые две минуты до тех пор, пока приращение

не будет принимать постоянные значения. Измерения останавливают и действительное значение конечной оптической плотности инкубационной смеси на момент внесения рабочего раствора ФМС (см. приложение А) рассчитывают по формуле

.                                          (5)

Затем по формуле (1) рассчитывают значение разницы между значениями конечной и начальной оптической плотности контроля и пробы.

8.5 Контроль ферментативного определения

Контроль определения осуществляют при необходимости проверки качества реактивов, оценки уровня квалификации персонала лаборатории, осуществляющего анализ аскорбиновой кислоты, а также для выявления и устранения случайных и систематических ошибок определения.

8.5.1 Приготовление стандартного раствора аскорбиновой кислоты

Берут навеску в 200 мг аскорбиновой кислоты и количественно переносят ее в мерную колбу вместимостью 100 см

. Объем раствора в колбе доводят до метки метафосфорной кислотой (15 г/дм

), затем тщательно перемешивают. Переносят 10 см

приготовленного раствора в другую мерную колбу вместимостью 100 см

, затем доводят объем раствора до метки метафосфорной кислотой (15 г/дм

). Содержимое колбы тщательно перемешивают.

Стандартный раствор аскорбиновой кислоты стабилен в течение суток при температуре 20 °С, в течение трех дней при температуре 4 °С и в течение одной недели при минус 20 °С. В схемах дозирования и определения (таблицы 2, 3 и 4) допускается использовать в качестве внешнего стандарта только свежеприготовленный стандартный раствор аскорбиновой кислоты.

8.5.2 Применение стандартного раствора аскорбиновой кислоты в качестве внутреннего стандарта

Ферментативное определение с применением стандартного раствора аскорбиновой кислоты (см. 6.5.1) в качестве внутреннего стандарта проводят по следующей схеме дозирования (см. таблицу 4):

По формуле (1) рассчитывают разницу значений оптических плотностей для кювет "Проба + стандарт (внутренний)", "Стандарт (внешний)" и "Проба". Степень повторного нахождения (

, %) для аскорбиновой кислоты, содержащейся в стандартном растворе (см. 6.5.1), рассчитывают по формуле

.                              (6)

Ферментативное определение проведено без ошибок, если степень повторного нахождения аскорбиновой кислоты находится в интервале от 95% до 100%.

Таблица 4 - Схема дозирования и смешивания реактивов для ферментативного определения с использованием раствора аскорбиновой кислоты в качестве внешнего и внутреннего стандарта (8.5.2)

Дозируют в кювету

Контрольная проба

Проба

Стандарт (контроль)

Стандарт (внешний)

Контроль + стандарт (внутренний)

Проба + стандарт (внутренний)

Рабочий раствор МТТ (см. 6.2.2)

1,000 см

1,000 см

1,000 см

1,000 см

1,000 см

1,000 см

Дистиллирован- ная вода

1,490* см

1,490* см

1,490* см

1,490* см

1,490* см

1,490* см

(1,500** см )

(1,500** см )

(1,500** см )

(1,500** см )

(1,500** см )

(1,500** см )

Проба (см. 6.3)

0,100 см

0,100 см

-

-

0,050 см

0,050 см

Стандартный раствор аскорби- новой кислоты (см. 6.5.1)

-

-

0,100 см

0,100 см

0,050 см

0,050 см

Рабочий раствор АО (см. 6.2.4) или иммобилизован- ная АО

0,010* см (один шпатель**)

-

0,010* см (один шпатель**)

-

0,010* см (один шпатель**)

-

Перемешивают. Помещают кюветы в термостат при 37 °С. В течение 6 мин интенсивно перемешивают содержимое контрольных кювет с целью насыщения инкубационной смеси воздухом (необходимое условие полного окисления аскорбиновой кислоты!). После выдержки измеряют значение начальной оптической плотности А1. Продолжают реакцию добавлением:

Рабочий раствор ФМС (см. 6.2.3)

0,100 см

0,100 см

0,100 см

0,100 см

0,100 см

0,100 см

Перемешивают. Инкубируют (в темноте!) при температуре 37 °С в течение 15 мин, после чего немедленно измеряют значение конечной оптической плотности А2.

* При использовании рабочего раствора АО (см. 6.2.4).     ** При использовании иммобилизованного препарата АО (например, шпателя с иммобилизованной АО).

8.6 Граница чувствительности метода

Граница чувствительности метода составляет 0,30 мг/дм

при

0,015 (при 578 нм) и максимальном объеме пробы

в 1,490 (или 1,600) см

.

8.7 Линейность определения

Линейность определения сохраняется в интервале от 0,5 мкг аскорбиновой кислоты в кювете (0,3 мг аскорбиновой кислоты/дм

пробы; объем пробы -

1,600 см

) до 20 мкг аскорбиновой кислоты в кювете (0,2 г аскорбиновой кислоты/дм

пробы; объем пробы

0,100 см

).

      9 Метрологические характеристики метода

В параллельном определении возможны различия между значениями оптических плотностей, которые будут составлять от 0,005 до 0,010. Это соответствует объему пробы

0,100 см

и концентрации аскорбиновой кислоты от 1,5 до 3 мг/дм

. При использовании в определении навески пробы в 1 г/100 см

(=10 г/дм

) ожидаемые различия между параллельными определениями составят 0,015-0,030 г/100 г. Метрологические характеристики метода приведены в приложении Б.

Приложение А

(справочное)

 Информация о медленно текущих реакциях

Ферментативные реакции в большинстве случаев являются реакциями нулевого порядка. Основная реакция характеризуется высокой скоростью. Для побочной - медленно текущей реакции - характерны низкие скорости. С практической точки зрения начало основной реакции связано с началом побочной реакции нулевого порядка. Характерным признаком медленно текущей реакции является постоянное количественное изменение оптической плотности с течением времени. Для получения достоверных результатов значение имеет только основная реакция. Концентрацию искомого вещества (субстрата в основной реакции) рассчитывают на основе количественной разницы между значением оптической плотности суммарной реакции (основная + медленно текущая реакции) и значением оптической плотности медленно текущей реакции.

Медленно текущая реакция начинается в отправной точке суммарной реакции (рисунок А.1). В этот момент времени в инкубационной смеси отсутствуют продукты ферментативной реакции, в том числе продукты медленно текущей реакции, которые могли бы привести к изменению оптической плотности системы. Для количественного определения общей разницы оптических плотностей значение конечной оптической плотности инкубационной смеси экстраполируют на момент начала основной реакции - внесение фермента или добавление рабочего реактива (рабочего раствора ФМС в ферментативном определении аскорбиновой кислоты). Контроль медленно текущей реакции позволяет получить только один количественный результат - значение оптической плотности в начальной точке суммарной реакции (основная + побочная реакции). Присутствие в инкубационной смеси медленно текущей реакции регистрируют с момента завершения основной реакции.

Суммарная реакция = основная + медленно текущая реакции

Рисунок А.1 - Графическое определение конечной оптической плотности инкубационной смеси, в которой присутствует медленно текущая реакция

Приложение Б

(справочное)

 Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода, полученные в трех лабораториях, приведены в таблицах Б.1 и Б.2.

Таблица Б.1

Показатель	В одной серии определений (количество измерений в серии 15)
	Лаборатория 1	Лаборатория 2	Лаборатория 3
Среднеарифметическое значение , г/дм	0,059	0,192	0,380
Среднеквадратичное отклонение повторяемости результатов определения , г/дм	0,00142	0,00346	0,00456
Коэффициент вариации, %	2,4	1,8	1,2

Таблица Б.2

Показатель	В повторных сериях определений (общее количество измерений 15)
	Лаборатория 1	Лаборатория 2	Лаборатория 3
Среднеарифметическое значение , г/дм	0,059	0,192	0,380
Среднеквадратичное отклонение повторяемости результатов определения , г/дм	0,00224	0,00422	0,0076
Коэффициент вариации, %	3,8	2,2	2,0

Библиография