ГОСТ 34786-2021 Вода питьевая. Методы определения общего числа микроорганизмов, колиформных бактерий, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и энтерококков.
ГОСТ 34786-2021
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ВОДА ПИТЬЕВАЯ
Методы определения общего числа микроорганизмов, колиформных бактерий, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и энтерококков
Drinking water. Methods for determining the total number of microorganisms, coliform bacteria, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Enterococcus
ОКС 67.160.01
Дата введения 2022-01-01
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства "Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н.Сысина" (ФГБУ "ЦСП" ФМБА России)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 22 октября 2021 г. N 144-П)
За принятие проголосовали:
|
|
|
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения | AM | ЗАО "Национальный орган по стандартизации и метрологии" Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Казахстан | KZ | Госстандарт Республики Казахстан |
Киргизия | KG | Кыргызстандарт |
Россия | RU | Росстандарт |
Узбекистан | UZ | Узстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 3 ноября 2021 г. N 1422-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34786-2021 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2022 г.
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"
ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 4, 2022 год, введенная в действие с 26.03.2022
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на воду централизованного и нецентрализованного питьевого, в том числе горячего, водоснабжения, бассейнов и аквапарков (кроме бассейнов, используемых в бальнеологических целях), упакованную питьевую воду, включая природную минеральную, а также воду для использования в процессах производства алкогольной продукции, и устанавливает методы, в том числе ускоренные, для лабораторного контроля качества воды, используемой для питьевых целей, по показателям: общее число микробных клеток, общее микробное число (ОМЧ), колиформные бактерии, общие колиформные бактерии, термотолерантные колиформные бактерии, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и энтерококки.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 18963 Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа
ГОСТ 24849 Вода. Методы санитарно-бактериологического анализа для полевых условий
ГОСТ 30813 Вода и водоподготовка. Термины и определения
ГОСТ 31861* Вода. Общие требования к отбору проб
________________
* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 59024-2020.
ГОСТ 31942 (ISO 19458:2006) Вода. Отбор проб для микробиологического анализа
ГОСТ 31955.1 (ISO 9308-1:2000) Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть 1. Метод мембранной фильтрации
ГОСТ ISO 6222 Качество воды. Подсчет культивируемых микроорганизмов. Подсчет колоний при посеве в питательную агаризованную среду
ГОСТ ISO 7899-2 Качество воды. Обнаружение и подсчет кишечных энтерококков. Часть 2. Метод мембранной фильтрации
ГОСТ ISO 11133 Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды. Приготовление, производство, хранение и определение рабочих характеристик питательных сред
ГОСТ ISO 16266 Качество воды. Обнаружение и подсчет Pseudomonas aeruginosa. Метод мембранной фильтрации**
________________
** В Российской Федерации действует ГОСТ Р 54755-2011 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa".
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 30813, а также следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 ускоренные методы: Методы, в том числе с использованием тест-систем, сокращающие время анализа по сравнению с общепринятыми методиками, но не снижающие точность выполнения испытаний и достоверность полученных результатов оценки качества питьевой воды по микробиологическим показателям.
3.2 общее число микробных клеток: Число микробных клеток, определяемых при увеличении более чем в тысячу раз при микроскопическом подсчете на мембранном фильтре после фильтрации воды.
3.3 общее микробное число; ОМЧ: Общее число мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, способных образовывать видимые при увеличении в два раза колонии на питательном агаре при температуре (36±2)°С (при определении показателя "ОМЧ при 37°С") в течение (24±2) ч и при температуре (22±2)°С (при определении показателя "ОМЧ при 22°С") в течение (72±2) ч для учета сапрофитных водных микроорганизмов.
Примечание - Во исполнение требований [1] (пункт 2 таблицы 2 приложения N 2 и пункты 2 и 3 таблицы 2 приложения N 3) при определении показателя "ОМЧ при 37°С" используют температуру инкубации (37±1)°С.
(Поправка. ИУС N 4-2022).
3.4 Pseudomonas aeruginosa (P.aeruginosa, синегнойная палочка): Грамотрицательные, подвижные облигатно-аэробные, оксидазаположительные, не образующие спор палочки, распространенные в водной среде, участвующие в образовании биопленок на поверхностях конструкций систем водоснабжения.
Примечания
1 На питательных средах продуцируют характерные пигменты, используемые для последующей идентификации: пиоцианин (феназиновый пигмент, который окрашивает питательную среду в сине-зеленый цвет), пиовердин (желто-зеленый флуоресцирующий в ультрафиолетовых лучах пигмент), пиорубин - красного цвета.
2 P.aeruginosa способны длительно выживать в водной среде и устойчивы ко многим обеззараживающим агентам (по сравнению с колиформными бактериями), не требовательны в отношении питательных веществ и температуры размножения, размножаются и длительно выживают на внутренних поверхностях трубопроводов от 60 до 210 суток при температуре от 4°С до 44°С, образуют эндотоксины и другие активно действующие вещества (эластазу, коллагеназу), ввиду чего вызывают целый ряд различных заболеваний кожных покровов, верхних дыхательных путей, глаз и других слизистых, а также кишечные инфекции.
3.5 колониеобразующая единица; КОЕ: Показатель количества жизнеспособных микроорганизмов в единице объема воды.
3.6 колиформные бактерии: Лактозоположительные бактерии, являющиеся оксидазоотрицательными при испытаниях по стандартному тесту.
3.7 общие колиформные бактерии: Оксидазоотрицательные грамотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу (глюкозу) до кислоты и газа при температуре (36±2)°С в течение (24±2) ч и до 48 ч при отсутствии газа.
(Поправка. ИУС N 4-2022).
3.8 обобщенные колиформные бактерии: Оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, лактозоотрицательные и лактозоположительные, ферментирующие глюкозу до кислоты и газа при температуре (36±2)°С в течение (24±3) ч и до 48 ч при отсутствии газа.
3.9 термотолерантные колиформные бактерии; ТКБ: Бактерии, входящие в число общих колиформных бактерий, обладающие всеми их признаками и, кроме того, способные ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре (44±0,5)°С в течение (24±3) ч.
3.10 бактерии группы кишечной палочки; БГКП: Грамотрицательные палочки, представители семейства Enterobacteriaceae, не образующие спор, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при (36±2)°С в течение 24-48 ч и сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа при (36±2)°С в течение (24±3) ч и не обладающие оксидазной активностью.
3.11 энтерококки: Группа аэробных и факультативно-анаэробных грамположительных бактерий, являющихся представителями резидентной микрофлоры человека и теплокровных животных, обладающих антигеном группы D, являющихся каталазонегативными, способными расти при (44,0±0,5)°C на селективных средах, содержащих 0,04% азида натрия и 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ).
Примечание - К группе энтерококков (кишечных или фекальных энтерококков) относят Enterococcus faecalis с биоварами, Enterococcus faecium, Enterococcus durans и другие. Обнаружение их в воде, даже в отсутствие E.coli, указывает на фекальное загрязнение воды.
(Поправка. ИУС N 4-2022).
4 Средства измерений, аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды
Для проведения испытаний применяют аппаратуру, материалы, реактивы и питательные среды по ГОСТ 24849 со следующими дополнениями:
тест-системы с готовыми питательными средами на подложке петрифильмы (Petrifilm) или с аналогичными характеристиками;
Петрифильм-подобный Ридер (3М™ Petrifilm™ Plate Reader) или с аналогичными характеристиками;
фильтры мембранные с размером пор 0,15; 0,25; 0,45 мкм;
раствор карболового эритрозина;
аппарат для автоматизированного спирального посева при микробиологическом исследовании;
счетчики колоний;
карболовый эритрозин;
фуксин Циля;
фуксин Пфейффера;
фольга металлическая;
краситель Бисмарка коричневый (Bismarck Brown);
акридиновый оранжевый;
бриллиантовый зеленый;
1%-ный водный раствор метиленового синего;
0,5%-ный раствор красителя Бисмарк коричневый;
микроскоп с иммерсионным объективом 90Х или 100Х*;
бумага фильтровальная;
среда с тергитолом 7;
агар хромогенный для колиформных бактерий (Chromocult Coliform Agar);
среда Readycult Coliforms 100;
среда Readycult Enterococci 100;
среда Сланец-Бартли;
бульон лактозный с борной кислотой;
среда лактозо-пептонная c индикатором;
агар энтерококковый Chromocult;
агар энтерококковый (азидный);
агар стрептококковый КF (КF Streptococcus Agar);
основа хромогенного агара для кишечных энтерококков (m-EI Chromogenic Agar Base);
агар желчно-эскулиновый с азидом натрия;
среда Бонде;
среда "Блеск";
агар с цетримидом;
среда N 9 для выявления пигмента пиоцианина (ГРМ);
агар флюорогенный для псевдомонад;
кристаллический фиолетовый;
тест-наборы Colilert-18, Enterolert-DW, Pseudalert или аналогичные;
система Quanti-Tray 51 или аналогичные;
система Quanti-Tray 2000 или аналогичные.
Примечание - Допускается использовать оборудование, расходные материалы, реактивы, питательные среды, в том числе готовые и хромогенные среды, диагностические препараты и тест-системы по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте или с аналогичными характеристиками, разрешенными к применению для контроля питьевой воды в установленном порядке.
5 Подготовка к анализу
5.1 Посуда, применяемая для микробиологического анализа (пробирки, колбы, флаконы), должна проходить соответствующую подготовку, гарантирующую ее чистоту и стерильность. Стерилизованная посуда должна иметь маркировку с указанием даты стерилизации для последующего учета срока хранения.
Срок хранения стерильной посуды многоразового использования - не более 10 дней.
5.2 Перед стерилизацией посуда для микробиологического анализа должна быть тщательно вымыта и высушена. Посуду стерилизуют в сушильном шкафу сухим жаром одним из способов:
- при температуре (180±3)°С - в течение 1 ч с момента достижения указанной температуры;
- при температуре (160±5)°С - в течение 2,5 ч с момента достижения указанной температуры.
5.3 Материалы и лабораторную посуду, разрушающиеся при температуре от 160°С до 180°С (резина и т.п.), следует стерилизовать в паровом стерилизаторе при температуре (121±3)°С в течение 20 мин.
После окончания анализа использованную лабораторную посуду с содержимым обеззараживают автоклавированием при температуре (126±2)°С и давлении 0,15 МПа в течение 60 мин или (132±2)°С и давлении 0,2 МПа в течение 20 мин с момента достижения указанной температуры; при росте споровой микрофлоры - при температуре (132±2)°С и давлении 0,2 МПа в течение 90 мин с момента достижения указанной температуры.
5.4 Мойку лабораторной посуды после обеззараживания проводят с использованием моющих средств, не содержащих фосфаты, и тщательно промывают проточной водопроводной водой (не менее 10 раз), ополаскивают дистиллированной водой, высушивают и стерилизуют.
5.5 Для определения качества удаления синтетических моющих и моюще-дезинфицирующих средств используют индикаторную бумагу с шагом измерительного диапазона не более 0,3 ед. pH. Предварительно определяют pH воды, применяемой для ополаскивания посуды на конечном этапе. Контрольные измерения pH проводят путем прикладывания индикаторной бумаги к поверхности вымытого мокрого стекла, прошедшего обработку. Для контроля произвольно выбирают три - десять единиц посуды. Значение pH воды, полученной в результате контроля, должно соответствовать pH дистиллированной воды, примененной для ополаскивания.
5.6 Использованные пипетки многоразового применения погружают в рабочий раствор дезинфицирующего средства, разрешенного к применению, и выдерживают определенное время в соответствии с инструкцией. После обеззараживания пипетки тщательно промывают проточной водопроводной водой до полного удаления дезинфицирующего средства, после чего два-три раза промывают дистиллированной водой и высушивают. Возможны альтернативные методы обеззараживания пипеток, например автоклавированием.
5.7 После высушивания чашки Петри, пробирки, пипетки укладывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу или металлическую фольгу. Бумага, используемая для обертывания лабораторной посуды, не должна разрушаться при стерилизации.
Утилизацию посуды одноразового применения и использованных тест-систем проводят в соответствии с требованиями к обращению с медицинскими отходами.
5.8 Подготовка мембранных фильтров
5.8.1 Подготовку мембранных фильтров проводят в соответствии с рекомендациями производителя. Если производитель поставляет нестерильные фильтры, то до начала анализа фильтры помещают в емкость (из нейтрального материала) с небольшим количеством дистиллированной воды, нагревают, не допуская закипания, накладывая на поверхность воды по одному мембранному фильтру. Затем кипятят на очень слабом огне в течение 7 мин, не допуская бурного кипения, сливая после каждого кипячения воду. Процедуру замены воды повторяют три раза, после последнего кипячения воду не сливают. Простерилизованные фильтры используют непосредственно после стерилизации. Допускается их хранение после высушивания в асептических условиях. Перед употреблением проводят однократно процедуру стерилизации кипячением в дистиллированной воде.
5.8.2 Перед началом исследований мембранные фильтры проверяют визуально на отсутствие трещин, отверстий и др. дефектов.
5.9 Подготовка аппарата для фильтрования и фильтрация
5.9.1 Перед посевом воды фильтровальный аппарат обтирают ватным тампоном, смоченным 96%-ным этиловым спиртом, и стерилизуют фламбированием. После сгорания спирта и последующего охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его фильтровальной воронкой или стаканом и закрепляют одним из способов, предусмотренных конструкцией фильтрующего устройства.
5.9.2 В воронку аппарата при соблюдении правил стерильности наливают отмеренный объем воды, создают разрежение и отфильтровывают содержимое воронки.
При посеве нескольких объемов из одной пробы воды фильтрование проводят через один аппарат без повторной стерилизации фламбированием. Сначала фильтруют меньшие, а затем большие объемы воды, используя для каждого объема отдельный фильтр. Перед фильтрованием новой пробы воды аппарат стерилизуют фламбированием.
5.9.3 По окончании фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду, разлитую в чашки Петри, добиваясь отсутствия пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.
Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева. На одну чашку допускается помещать от двух до четырех фильтров (в зависимости от диаметра фильтров и чашки Петри) с условием, чтобы фильтры не соприкасались.
5.10 Приготовление питательных сред и реактивов
5.10.1 Приготовление питательных сред и реактивов проводят по ГОСТ 31955.1, ГОСТ ISO 11133, ГОСТ ISO 7899-2, а также в соответствии с инструкциями производителя.
Питательные среды, которые в соответствии с указанием производителя не требуют стерилизации автоклавированием, а также среды с коротким сроком хранения после розлива в чашки Петри, могут быть приготовлены непосредственно перед анализом. Такие среды готовят в эмалированной или стеклянной емкости, или емкости из нержавеющей стали.
При использовании промышленных сухих питательных сред их готовят в соответствии с указаниями изготовителя. В этом случае следует соблюдать способ применения и срок хранения питательных сред, указанных на упаковках.
Питательные среды, разлитые в чашки и хранящиеся в холодильнике, перед посевом должны быть прогреты до комнатной температуры.
При наличии следов влаги на поверхности агаризованных сред проводят подсушивание в термостате, приоткрывая крышку, до исчезновения конденсата.
5.10.2 Подготовленные заранее стерильные емкости, питательные среды, лабораторную посуду и реактивы следует хранить в условиях, предусмотренных для каждого средства, среды и реактива с соблюдением стерильности и предельных сроков хранения. При этом емкости и пробирки с готовыми средами должны быть закрыты силиконовыми пробками и защищены колпачками из силикона или жароустойчивой бумаги или металлической фольгой. Чашки Петри с готовыми средами должны быть помещены в специальные пакеты или завернуты в плотную бумагу, защищающую среду от высыхания и воздействия света.
При вскрытии упаковок и емкостей, удалении пробок (крышек) непосредственно перед проведением анализа, пробка (крышка) и края емкости не должны касаться посторонних поверхностей.
5.10.3 Операции по подготовке и проведению анализа выполняют чистыми и продезинфицированными руками (например, после обработки рук 70%-ным этиловым спиртом или дезинфицирующими салфетками для индивидуального пользования) или в стерильных перчатках.
5.11 Приготовление разведений пробы воды
Для приготовления разведений анализируемой воды используют стерильные растворы для разведения: солевой (физиологический раствор, пептонный раствор или пептонно-солевой раствор).
6 Отбор проб
Отбор, транспортирование и хранение проб воды для микробиологического анализа проводят по ГОСТ 31861, ГОСТ 31942.
7 Методы определения общего микробного числа
7.1 Определение общего микробного числа при посеве в агаризированную среду
Примечание - Для оценки антропогенного микробного загрязнения, вторичного загрязнения, условий хранения воды определяют ОМЧ при (36±2)°С и (22±2)°С.
7.1.2 Перед проведением анализа каждую пробу воды тщательно перемешивают.
Питательный агар расплавляют, охлаждают до температуры 45°С-50°С и помещают до использования в водяную баню при температуре (48±1)°С для поддержания температурного режима питательного агара. Расплавленный агар используют в течение одного рабочего дня. Он не подлежит хранению и повторному расплавлению.
Примечание - Если визуально вода, поступившая на исследование, не соответствует органолептическим показателям цветности и мутности или рядом с местом отбора находится источник фекального загрязнения, пробы воды разводят в соответствии с 5.11 и засевают по чашке из каждого разведения.
7.1.3 С соблюдением правил асептики отбирают соответствующие объемы проб воды и вносят в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку.
После внесения исследуемой воды в чашки Петри ее заливают слоем питательного агара (для чашки Петри диаметром 90 мм заливают 8-12 мл расплавленного агара) при фламбировании краев емкости, в которой он содержался, так чтобы слой питательного агара был тонким и составлял 2-3 мм.
Воду быстро смешивают с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола, исключая образования пузырьков воздуха и не покрытых агаром частей дна чашки, а также попадания агара на края и крышку чашки. После этого чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания питательного агара в течение 20 мин.
После застывания агара чашки переворачивают вверх дном, помещают в термостат не более чем по три-четыре чашки в стопке и инкубируют при температуре (36±2)°С в течение (24±2) ч. При определении ОМЧ при 22°С инкубацию проводят при температуре (22±2)°С в течение (72±2) ч.
Допускается представлять результат на основании подсчета колоний на одной чашке (с отметкой в протоколе анализа) в случаях, если на других чашках рост расплывчатых колоний распространился на всю поверхность чашки.
Воспроизводимость результатов метода может быть достигнута при строгом соблюдении условий проведения анализа, а также при использовании питательного агара одинакового состава.
Примечание - Допускается проведение анализа в соответствии с ГОСТ ISO 6222.
7.2 Определение общего микробного числа с использованием мембранных фильтров
7.2.2 Фильтрацию выполняют с использованием прибора для фильтрования воды в соответствии с 5.9. Допускается проводить фильтрование путем помещения стерильного мембранного фильтра на подкладку из нескольких слоев фильтровальной бумаги в стерильные чашки Петри. Отмеренный объем воды при помощи пипетки постепенно и равномерно наносят на поверхность мембранного фильтра, фильтровальная бумага впитывает воду, прошедшую через мембранный фильтр.
7.2.3 Затем мембранный фильтр стерильным пинцетом перекладывают на чашку Петри с питательным агаром. Переворачивают чашку вверх дном и инкубируют посевы при (36±2)°С в течение 24 ч. Для облегчения подсчета колоний и получения более точного результата используют реактив тетраметил-п-фенилендиамин гидрохлорид для определения оксидазной активности.
После инкубации посевов мембранные фильтры переносят на фильтровальную бумагу, смоченную оксидазным реактивом. Колонии бактерий, обладающих оксидазной активностью, окрашиваются в яркий сине-фиолетовый цвет. При этом даже самые мелкие колонии хорошо видны на фоне светлого фильтра. Эта группа представлена бактериями рода Pseudomonas, Aeromonas, Vibrio - активные участники самоочищения воды водоемов. Оксидазоотрицательные бактерии также хорошо различимы на фоне слегка посиневшего фильтра. Метод позволяет всего за 1-5 мин дать качественную и количественную характеристику различных групп сапрофитных бактерий.
7.3 Определение общего микробного числа с использованием петрифильмов - тест-систем с готовыми питательными средами на подложке
7.3.1 Для реализации метода используются тест-системы с готовыми сухими питательными средами на подложке петрифильмы (Petrifilm) или с аналогичными характеристиками (далее тест-системы), содержащие готовую питательную среду и гель, растворимый в холодной воде, который застывает при комнатной температуре. На поверхность наносят сетку, которая облегчает подсчет колоний. До момента посева пробы тест-система не активна и может храниться длительное время. Для сохранения стерильности компоненты питательной среды покрывают сверху непроницаемой пленкой.
7.3.2 Тест-системы готовят к анализу в соответствии с инструкцией производителя с соблюдением правил стерильности.
В центр тест-системы выемкой вниз помещают пластиковый распределитель и надавливают на центр распределителя для равномерного распределения пробы. Не допускается перемещать или крутить распределитель по тест-системе.
Убирают распределитель и оставляют петрифильм на 1-2 мин для затвердевания геля.
7.3.3 Затем посевы инкубируют при температуре (36±2)°С в течение 18-24 ч.
При инкубировании допускается размещать тест-системы стопкой по 20 шт.
7.3.4 Количество колоний на тест-системы подсчитывают визуально или автоматически с помощью Петрифильм-подобного Ридера или аналога.
Для подсчета отбирают тест-системы, на которых число колоний можно подсчитать визуально.
При большом количестве колоний на тест-системе может наблюдаться окрашивание всей зоны роста в красный или розовый цвет. Иногда на тест-системах с очень большим количеством колоний в центре может не оказаться видимых колоний, а по краям будет видно множество мелких колоний. В этих случаях результат не учитывается.
Некоторые бактерии могут разжижать гель, что затрудняет подсчет колоний; в этом случае необходимо подсчитывать количество колоний только на неизмененных участках тест-систем.
7.4 Автоматизированный метод посева проб воды или разведений бактериальных культур с аппарата для автоматизированного спирального посева при микробиологическом исследовании
7.4.1 Спиральный метод автоматизированного посева проб основан на распределении точно откалиброванной по объему анализируемой пробы на вращающиеся чашки Петри с агаром по логарифмически убывающей спирали Архимеда.
Способ посева, объем засеваемой пробы и количество последовательных посевов программируются вручную.
7.4.2 Для автоматизированного посева проб используют чашки Петри различного диаметра: 60, 90, 100 мм, в которые разливают питательный агар, предварительно приготовленный из сухого препарата и охлажденный до температуры 50°С. Перед посевом чашки с агаром комнатной температуры не должны содержать капли влаги на поверхности.
Объем посева: 10, 100, 1000 мкл пробы воды.
Программируемый объем распределения: от 10 до 1000 мкл.
Возможен последовательный посев одного и того же образца на 20 чашек Петри по 10 мкл.
7.4.3 От центра пластины к ее краям исследуемый образец воды распределяется специальным прикрепленным шприцем на поверхность вращающейся чашки Петри с агаром по логарифмически убывающей спирали Архимеда. Это приспособление наливает непрерывно уменьшающийся объем исследуемого образца воды так, что концентрация в центре и у края достигает соотношения 10000:1.
Распределяемый объем уменьшается по мере нанесения культуры от центра к краю чашки таким образом, чтобы существовала обратно пропорциональная зависимость между радиусом спирали и нанесенным объемом клеточной суспензии. Объем культуры точно откалиброван и известен в каждой точке чашки Петри.
Концентрацию образца определяют путем деления количества выросших после инкубации колоний на объем, распределенный в одном и том же секторе чашки.
7.4.4 Посевы инкубируют в термостате при температуре (36±2)°С в течение 24 ч.
Подсчет колоний на плотных питательных средах осуществляют вручную или с помощью автоматизированных счетчиков колоний.
7.5 Автоматизированный метод подсчета колоний на плотной питательной среде
При использовании ручного счетчика колоний подсчитывают от 0 до 2000 КОЕ на чашках Петри диаметром 60, 90, 100 мм, в том числе с технологией "темное поле".
При использовании автоматических счетчиков колоний минимальный размер подсчитываемых колоний составляет 0,05 мм.
При использовании автоматических счетчиков колоний с самым большим разрешением проводят сканирование 100% поверхности чашки при скорости подсчета колоний 1000 КОЕ/с с использованием ультравысокого разрешения.
Происходит автоматическое разделение слипшихся колоний, а также выполняется детекция и подсчет колоний семи цветов на одной чашке, что важно при посеве на хромогенные среды. Возможен подсчет колоний на мембранных фильтрах и питательных подложках.
8 Экспресс-методы определения общего числа микробных клеток при их прямом микроскопическом подсчете
8.1 Метод Разумова
8.1.1 Сущность метода заключается в концентрировании микроорганизмов из воды на мембранном фильтре, окрашивании их красителем непосредственно на фильтре, приготовлении препарата для микроскопирования и подсчитывании под микроскопом с помощью окулярного сетчатого микрометра в нескольких полях зрения на определенной площади препарата.
Метод применяют в экстренных случаях, когда необходимо срочно дать ответ о количественном содержании бактерий, например при авариях в системе водоснабжения и т.п.
8.1.2 Отмеренный объем исследуемой пробы воды фильтруют через мембранные фильтры с размером пор 0,15-0,25 мкм.
Примечание - Не рекомендуется использовать фильтры фирмы MILLIPOR (США) ввиду специфичности их волокнистой структуры, так как бактериальные клетки не оседают на поверхности фильтра, а "проваливаются" в его толщу, что делает невозможным их микроскопирование.
Фильтры с осевшими на них микроорганизмами помещают на фильтровальную бумагу в чашках Петри и высушивают на воздухе. Для ускорения процесса высушивания фильтры допускается помещать в термостат или слабо нагретый сушильный шкаф.
8.1.3 Высушенные фильтры накладывают нижней стороной на фильтровальную бумагу, предварительно смоченную раствором карболового эритрозина, помещенную в чашку Петри, и закрывают крышкой.
Для окрашивания фильтры выдерживают не менее 1 ч (в среднем время окрашивания составляет 3-5 ч). Для равномерного окрашивания клеток мембранный фильтр должен плотно прилегать к бумажному фильтру с эритрозином.
8.1.4 Затем мембранный фильтр отмывают от красителя, перекладывая его на фильтровальной бумаге, обильно смоченной дистиллированной водой, до тех пор, пока вода не перестанет окрашиваться. После последней промывки поверхность фильтра остается розовой (за счет окрашенных бактерий), а края его становятся бледно-розовыми.
Для получения доступа к полной версии без ограничений вы можете выбрать подходящий тариф или активировать демо-доступ.