ГОСТ 33041-2014 Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Почвенные микроорганизмы: тест на трансформацию углерода.
ГОСТ 33041-2014
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ ОПАСНОСТЬ ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
Почвенные микроорганизмы: тест на трансформацию углерода
Testing methods for chemicals of environmental hazard. Soil microorganisms: carbon transformation test
МКС 71.040.50
Дата введения 2015-08-01
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным унитарным предприятием "Всероссийский научно-исследовательский центр стандартизации, информации и сертификации сырья, материалов и веществ" (ФГУП "ВНИЦСМВ") на основе собственногоперевода на русский язык документа, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 20 октября 2014 г. N 71-П)
За принятие проголосовали:
|
|
|
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Азербайджан | AZ | Азстандарт |
Армения | AM | Минэкономики Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Киргизия | KG | Кыргызстандарт |
Молдова | MD | Молдова-Стандарт |
Россия | RU | Росстандарт |
Таджикистан | TJ | Таджикстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 20 ноября 2014 г. N 1696-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33041-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 августа 2015 г.
5 Настоящий стандарт идентичен международному документу OECD, Test No. 217:2000* "Почвенные микроорганизмы: тест на трансформацию углерода" ("Soil Microorganisms: Carbon Transformation Test", IDT).
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5 (подраздел 3.6)
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2019 г.
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"
Введение
В настоящем стандарте описывается лабораторный метод тестирования, разработанный для изучения возможных долговременных последствий однократного применения средств защиты растений и других химических веществ на трансформацию углерода, связанную с деятельностью почвенных микроорганизмов. Тест основывается, главным образом, на рекомендациях Европейской и Средиземноморской Организации Защиты Растений (ЕРРО) [1]. Учтены также и руководства других организаций, включая Немецкую Службу Биологического Контроля (ВВА) [2], Агентство по Охране Окружающей Среды США (US ЕРА) [3] и SETAC [4]. Совещание ОЭСР по стандартизации отбора образцов почв/осадков, состоявшееся в Белгирате, Италия, в 1995 г. [5], в частности, одобрило перечень и типы почв, пригодных для проведения настоящего теста. Рекомендации по отбору, обработке и хранению почвенных образцов в соответствии с ISO 10381-6 [6] и рекомендациях Белгиратского Совещания.
1 Область применения
В настоящем стандарте устанавливается метод определения воздействия тестируемого вещества на процессы микробиологической трансформации углерода в почве.
2 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
2.1 трансформация углерода (carbon transformation): Микробная деградация органического вещества до конечного продукта диоксида углерода.
3 Общие сведения
3.2 Почва состоит из живых и неживых компонентов, которые существуют в виде комплексных и гетерогенных смесей. Микроорганизмы играют важную роль в разрушении и трансформации органического вещества в плодородных почвах, поскольку на различные аспекты плодородия почв оказывают влияние разные виды микроорганизмов. Любое долгосрочное вмешательство в такие биохимические процессы потенциально может препятствовать круговороту питательных веществ, что в свою очередь может вызвать изменения плодородия почв. Трансформация углерода и азота происходит во всех плодородных почвах. Несмотря на то, что микробные сообщества, отвечающие за протекание данных процессов, различаются в зависимости от почвы, пути трансформации по сути остаются одинаковыми.
3.3 Тест, описанный в настоящем стандарте, предназначен для оценки воздействия потенциальных токсикантов на процесс микробной трансформации углерода в почвах в аэробных условиях. Тест чувствителен к изменениям численности и активности микробных сообществ, ответственных за трансформацию углерода в почвах, как в результате химического стресса, так и в результате голодания. В тесте используют песчаную почву с низким содержанием органического вещества.
Тестируемое вещество вносят в эту почву и инкубируют в условиях, способствующих быстрому проявлению микробного метаболизма. В этих условиях источник доступного углерода в почве быстро расходуется. Углеродное голодание вызывает как гибель части микробных клеток, так стимулирует их переход в неактивное состояние или в форму спор. Если тест проводится в течение 28 сут, совокупный отклик метаболических реакций может быть оценен по отношению к необработанной почве (контролю), как растущее сокращение запасов метаболически активной микробной биомассы [7]. Величина биомассы, при лимите углерода в условиях проведения эксперимента, определяется воздействием химиката и не может превысить уровень контроля. Следовательно, нарушения, вызванные тестируемым веществом, всегда отчетливо проявятся к концу эксперимента.
3.4 Данный тест разработан, прежде всего, для веществ с предсказуемой дозой внесения, например, средств защиты растений, для которых способ применения и дозы известны. Для агрохимикатов достаточно тестирование двух доз, соответствующих и превышающих рекомендованную норму применения. Агрохимикаты могут тестироваться в виде действующих веществ или препаративных форм.
4 Принцип теста
Значения интенсивности дыхания в образцах с внесением исследуемого вещества сравнивают с контролем и рассчитывают отклонение в процентах от контроля. Продолжительность эксперимента не менее 28 сут. Если в течение 28 сут разница между опытными и контрольными вариантами достигает или превышает 25%, исследование продолжают с 14-дневным интервалом максимум до 100 сут.
5 Достоверность теста
Оценка результатов тестирования агрохимикатов основана на относительно небольших отклонениях (среднее значение составляет ±25%) интенсивности выделения диоксида углерода или поглощения кислорода в тестируемой и контрольной пробах почвы, поэтому большие различия в результатах параллельных контрольных проб могут привести к получению ложных результатов. В связи с этим, различия результатов параллельных контрольных проб должно быть менее ±15%.
6 Описание теста
6.1 Оборудование
6.1.1 При тестировании используют контейнеры, изготовленные из химически инертного материала. Контейнеры должны быть подходящего размера для проведения процедуры инкубации почвы. Инкубация может проводиться либо для одной большой партии почвы, либо для серии индивидуальных проб почвы (см. 8.2). При тестировании следует уделять внимание минимизации потери воды и обеспечению газообмена между почвой и атмосферой (например, контейнеры могут быть покрыты перфорированной полиэтиленовой пленкой). При тестировании летучих веществ необходимо использовать герметичные и газонепроницаемые контейнеры. Контейнеры должны быть такого размера, чтобы проба почвы занимала примерно одну четвертую их объема.
6.1.2 Для определения субстрат-индуцированного дыхания, требуется применение инкубационных сосудов и аппаратуры, позволяющих измерять накопление диоксида углерода или поглощение кислорода. Примеры инкубационных систем и приборов приведены в [8], ISО 11266-1 [9], 14239 [10], [11].
6.2 Выбор и количество почв
6.2.1 При тестировании используют только одну почву. Рекомендации относительно характеристик тестируемой почвы:
- содержание песка: не менее 50% и не более 75%;
- pH: 5,5-7,5;
- содержание органического углерода: 0,5-1,5%;
- микробная биомасса должна быть измерена по [1], [2] и содержание углерода в ней должно быть не менее 1% содержания общего органического углерода в почве.
6.2.2 В большинстве случаев почва, обладающая такими характеристиками, представляет собой наихудший вариант для тестирования, поскольку адсорбция исследуемого вещества будет минимальной, а его доступность для микрофлоры - максимальной. Следовательно, тестировать другие почвы, как правило, нет необходимости. Тем не менее, при определенных обстоятельствах, например, когда тестируемое вещество будет, главным образом, использоваться для определенных типов почв, например, кислых лесных почв. При тестировании электрически заряженных химических веществ, необходимо использовать дополнительные типы почв.
7 Отбор и хранение проб почвы
7.1 Пробоотбор
7.1.1 Необходима подробная информация о месте отбора пробы почвы, включающая точное местоположение, сведения о растительном покрове, даты обработки средствами защиты растений, даты внесения органических и неорганических удобрений, даты добавления биологического материала или попадания случайного загрязнения. Для пробоотбора почвы должно быть выбрано одно место, откуда можно отбирать пробы почвы в течение длительного времени. Подходящими местами для сбора проб почвы являются постоянные пастбища, поля для культивирования годовых зерновых культур (кроме кукурузы) или поля, засеянные сидератами.
Выбранное место отбора проб не должно обрабатываться средствами защиты растений как минимум в течение одного года перед планируемым отбором проб. Кроме того, органические удобрения не должны были применяться как минимум в течение шести месяцев. Использование минеральных удобрений приемлемо только при их соответствии требованиям выращивания сельскохозяйственной культуры и если проба почвы будет отбираться как минимум по прошествии трех месяцев после внесения удобрений. Следует избегать использования почвы, обработанной удобрениями с известными биоцидными эффектами (например, цианамидом кальция).
7.1.2 Отбор проб не рекомендуется проводить во время или сразу же после длительного (более 30 сут) периода засухи или подтопления. Для распаханных почв пробы необходимо отбирать с глубины от 0 до 20 см. Для луга (пастбища) или других почв, вспашка которых не производилась в течение длительного периода (по крайней мере, один вегетационный сезон), максимальная глубина отбора проб может быть немного больше 20 см (например, до 25 см).
7.1.3 Пробы почвы необходимо перевозить в контейнерах и в температурных условиях, при которых исходные свойства почвы существенно не изменятся.
7.2 Хранение
Наиболее предпочтительно использование свежеотобранных проб почвы. При необходимости пробы почвы хранят в темноте при температуре (4±2)°С в течение не более трех месяцев. Во время хранения необходимо обеспечить аэробные условия. Если пробы почвы отбирают в районах, где почва замерзает как минимум на три месяца в год, хранение можно осуществлять в течение шести месяцев при температуре минус 18°С. Микробная биомасса в пробе почвы измеряется перед каждым тестированием, содержание углерода в биомассе должно быть не менее 1% содержания общего органического углерода (см. 6.2.1).
7.3 Обработка и подготовка почвы для теста
7.3.1 Предварительная инкубация
Если осуществлялось хранение проб почвы (см. 7.2), то рекомендуется проводить предварительную инкубацию от 2 до 28 сут. Условия предварительной инкубации по температуре и влажности должны быть близки к условиям тестирования (см. 7.3.2 и 8.3).
7.3.2 Физико-химические характеристики почвы
7.3.3 Подготовка тестируемого вещества для внесения в почву
7.3.3.1 Как правило, тестируемое вещество вносят в почву с использованием носителя. В качестве носителя может использоваться вода (для растворимых в воде веществ) или твердый инертный носитель, такой, как мелкий кварцевый песок (размер частиц 0,1-0,5 мм). Следует избегать использования жидких носителей, за исключением воды (например, органических растворителей, таких, как ацетон, хлороформ), поскольку они могут нанести вред микрофлоре. Если в качестве носителя берут песок, то его обрабатывают исследуемым веществом в виде раствора или суспензии с использованием соответствующего растворителя. В таких случаях перед перемешиванием с почвой растворитель должен быть удален путем испарения. Для достижения оптимального распределения исследуемого вещества в почве рекомендуется использовать соотношение 10 г песка на 1 кг почвы (в расчете на сухую массу). Контрольные пробы обрабатывают только эквивалентным количеством воды и (или) кварцевого песка.
7.3.3.2 При тестировании летучих химических веществ необходимо предотвращать потери исследуемого вещества вследствие испарения, а также обеспечивать однородное распределение тестируемого вещества в почве (например, вещество следует вносить в почву в нескольких местах).
7.3.4 Тестируемые концентрации
8 Проведение теста
8.1 Внесение тестируемого вещества
При тестировании агрохимикатов почва должна быть разделена на три равные весовые части. Две части смешивают с агрохимикатом в составе носителя, а оставшуюся часть - с носителем без агрохимиката (контроль). Рекомендуется минимум трехкратная повторность при закладке обработанных и контрольных вариантов теста. При тестировании не агрохимикатов почву делят на шесть равных весовых частей. Пять частей смешивают с тестируемым веществом в составе носителя, а шестая часть - с носителем без тестируемого продукта. Рекомендуется трехкратная повторность при закладке обработанных и контрольных вариантов опыта. Особое внимание следует обратить на равномерное распределение тестируемого вещества в образцах почвы. В процессе смешивания следует избегать комкования и формирования неоднородностей почвы.
8.2 Инкубация образцов почвы
Инкубация почвенных образцов может осуществляться двумя способами: единым почвенным образцом, разделенным на обработанные и необработанные участки или серии индивидуальных обработанных и контрольных образцов почвы одной массы. При исследовании летучих соединений эксперимент возможен только в серии индивидуальных образцов почвы. При инкубации почвы в виде единого образца, требуется многочисленный отбор проб из обработанной и необработанной частей почвы. Это следует учитывать при определении массы исходного образца почвы, руководствуясь частотой и числом повторностей, отобранных в процессе инкубации образцов почвы для конкретного анализа. Каждый раз перед отбором индивидуальных образцов почва должна осторожно перемешиваться.
Если почва инкубируется в виде серии индивидуальных образцов, то обработанные и необработанные варианты подразделяют на нужное число образцов, которые используют по мере необходимости. В экспериментах, предполагающих более чем двукратный анализ в процессе инкубации, требуется заранее предусмотреть число образцов, необходимых для многократного отбора проб в нужной повторности. Контрольный вариант опыта должен инкубироваться в аэробных условиях не менее, чем трехкратной повторности (см. 8.1). На протяжении всего периода инкубации необходимо использовать контейнеры с объемом газовой фазы, достаточным для того, чтобы избежать развития анаэробных процессов. При тестировании летучих веществ анализ должен проводиться методом серий индивидуальных образцов почвы.
8.3 Условия и продолжительность инкубации
9 Отбор образцов почвы
9.1 График отбора образцов почвы
9.1.1 При исследовании агрохимикатов почвенные пробы анализируют методом глюкозо-индуцированного дыхания на 0, 7, 14 и 28-й день. В случае продления сроков исследования, анализы должны проводиться с интервалом в 14 сут.
9.2 Оценка глюкозо-индуцированного дыхания
9.2.1 Интенсивность глюкозо-индуцированного дыхания в опытных и контрольных вариантах определяют в трехкратной повторности в каждый период измерения. Образцы почвы смешивают с достаточным количеством глюкозы для провоцирования максимального отклика дыхательной активности. Концентрацию глюкозы, необходимая для максимального дыхательного отклика в данной почве, определяют в ходе предварительного эксперимента с внесением серии концентраций глюкозы [13]. Однако для песчаных почв с 0,5% - 1,5% содержанием органического углерода, 2000-4000 мг глюкозы на 1 кг сухой почвы обычно оказывается достаточным. Глюкоза может быть внесена в почву в форме смеси порошка глюкозы с кварцевым песком (10 г песка/кг сухой почвы) с последующим гомогенным перемешиванием с почвой.
9.2.2 Образцы почвы, обогащенные глюкозой, инкубируют в сосудах, подходящих для отбора газовых проб с часовым или двухчасовым интервалом (см. 6.1.2) при температуре (20±2)°С. Количество выделившегося диоксида углерода или поглощенного кислорода последовательно измеряют в течение 12 ч, причем измерения следует начинать сразу после внесения глюкозы, т.е. между 1-м и 2-м часом инкубации. Оценивают общее количество выделившегося диоксида углерода или поглощенного кислорода в течение 12 ч и рассчитывают скорость дыхания.
10 Данные и отчет о проведении теста
10.1 Данные
10.1.1 При тестировании агрохимикатов количество выделившегося диоксида углерода или поглощенного кислорода для каждой повторности заносят в таблицу. Результаты должны оцениваться с использованием общепринятых статистических методов (например, критерий Фишера с уровнем значимости 5%). Глюкозо-индуцированное дыхание должно быть представлено в мг диоксида углерода/кг сухой почвы в час или мг кислорода/кг сухой почвы в час. Количество выделившегося диоксида углерода или количество поглощенного кислорода в каждом обработанном варианте сравнивают с контролем и представляют в отклонении от контроля в процентах.
10.2 Интерпретация результатов
10.3 Отчет о проведении теста
Отчет должен содержать следующую информацию.
Полную характеристику почвы, включая:
- географические координаты точки отбора почвы (широта, долгота);
- информацию об истории использования участка (растительный покров, примененные средства защиты растений, удобрения, типы загрязнения и т.д.);
- тип угодья: сельскохозяйственные земли, лес и т.д.;
- глубину отбора образца;
- гранулометрический состав (песок/пыль/глина в процентах от массы сухой почвы);
- pH водной вытяжки;
- содержание органического углерода (процент массы сухой почвы);
- содержание азота (процент массы сухой почвы);
- емкость катионного обмена (ммоль/кг);
- исходный запас микробной биомассы в процентах общего содержания органического углерода;
- ссылки на методы исследования каждого параметра;
- полную информацию, касающуюся отбора и хранения образцов почвы;
- детали предварительной инкубации почвы (при необходимости).
Тестируемое вещество:
- физическое состояние и, по возможности, физико-химические свойства;
- данные химической идентификации и, по возможности, структурную формулу, степень чистоты (например, для средств защиты растений - процент действующего вещества).
Условия теста:
- детали обогащения почвы органическим веществом;
- использованные концентрации тестируемого вещества и соответствующее обоснование выбранных концентраций;
- детали внесения тестируемого вещества в почву;
- температура инкубации;
- влажность почвы в начале эксперимента и на его протяжении;
- метод инкубации почвы (единый образец или серия индивидуальных образцов);
- число повторностей;
- даты анализа.
Результаты:
- использованный метод и оборудование для определения интенсивности дыхания;
- таблица данных количественной оценки диоксида углерода или кислорода;
- разница между повторностями в обработанных и контрольных образцах;
- обсуждение выявленных в ходе расчетов корреляций (по возможности);
- статистическую обработку данных;
- любую информацию, полезную для интерпретации результатов.
Библиография
|
|
[1] | ЕРРО (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994 |
[2] | BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990) |
[3] | EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987 |
[4] | SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels |
[5] | OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995 |
[6] | ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory |
[7] | Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in "Pesticide Effects on Soil Microflora". Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60 |
[8] | Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in "Methods of Soil Analysis - Part 2: Chemical and Microbiological Properties". Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831-871 |
[9] | ISО 11266-1 (1993). Soil Quality - Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions |
[10] | ISO 14239 (1997E). Soil Quality - Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions |
[11] | Heinemeye, r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81 |
[12] | ISO 14240-1 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method |
[13] | Malkomes, H.-P. (1986). EinfluB von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegeniiber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120 |
[14] | Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol, and Exper. Ther., 96, 99-113 |
[15] | Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York |
[16] | Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK |
|
|
|
УДК 658.382.3:006.354 | МКС 71.040.50
| IDТ |
Ключевые слова: метод, химическая продукция, опасность, окружающая среда, почва, микроорганизм, трансформация, углерод | ||