Методические указания по методам контроля МУК 4.2.2494-09 Организация молекулярно-генетических исследований биологического материала из природных очагов геморрагической лихорадки с почечным синдромом.
МУК 4.2.2494-09
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОРГАНИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ИЗ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ
Дата введения 2009-06-01
1. РАЗРАБОТАНЫ ФГУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора (А.Е.Платонов, С.Б.Гаранина, В.И.Журавлев, Г.А.Шипулин), ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН (Е.А.Ткаченко, Т.К.Дзагурова), ФГУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Воронежской области (Д.В.Транквилевский), Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Ю.В.Демина, Н.Д.Пакскина).
2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 марта 2009 г. N 1).
3. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 01.04.2009 и введены в действие 1 июня 2009 г.
4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
1. Область применения
1.1. Методические указания предназначены для использования специалистами органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами лечебно-профилактических организаций, научно-исследовательских институтов и других заинтересованных организаций.
1.2. В настоящих методических указаниях определены основные правила сбора полевого и клинического материала, предназначенного для анализа на хантавирусы методом ПЦР. Описаны порядок упаковки, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологических образцов, зараженных или подозрительных на зараженность хантавирусами. Предложены унифицированные методические подходы для проведения молекулярно-генетических исследований по генотипированию хантавирусов.
2. Нормативные ссылки
2.1. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".
2.2. СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности".
2.3. МУ 3.1.1029-01 "Отлов, учет и прогноз численности мелких млекопитающих и птиц в природных очагах инфекций".
2.4. МУ 1.3.1794-03* "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности".
2.5. СП 3.1.099-96 "Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом".
3. Общие положения
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - вирусный нетрансмиссивный зооноз, широко распространенный в Евразии, а в России занимающий первое место по заболеваемости среди природноочаговых инфекций. Возбудители ГЛПС - вирусы Пуумала, Хантаан, Сеул, Добрава и Амур - относятся к роду Hantavirus (семейство Bunyaviridae), который включает в настоящее время более 30 различных хантавирусных серотипов или генотипов. Большинство из них являются патогенными для человека. Хантавирусы эволюционно тесно связаны с определенными видами грызунов из семейств Arvicolinae и Murinae (полевки, мыши, крысы). Вирусы передаются преимущественно респираторным путем, а источником заражения людей служат теплокровные носители, выделяющие вирус с экскретами во внешнюю среду.
На территории России эпидемически активные очаги ГЛПС расположены в основном в умеренных широтах европейской части и на Дальнем Востоке. Более 95% случаев заражения ГЛПС происходят в европейских очагах, приуроченных к лесным ландшафтам. Здесь циркулирует хантавирус Пуумала, основным резервуаром которого в природе является европейская рыжая полевка (Myodes glareolus). Наиболее активная очаговая территория расположена в оптимуме ареала рыжей полевки - в широколиственных и хвойно-широколиственных лесах Приуралья и Среднего Поволжья. Почти 90% всех зарегистрированных случаев заражения ГЛПС в Российской Федерации приходится на Приволжский федеральный округ. В дальневосточных регионах России ГЛПС вызывается хантавирусами Хантаан, Амур и Сеул, природным резервуаром которых являются полевая мышь (Apodemus agrarius), восточно-азиатская мышь (Apodemus peninsulae) и серая крыса (Rattus norvegicus) соответственно.
Полученные в последнее десятилетие данные существенно меняют сложившиеся представления об этиологической природе заболеваемости ГЛПС на европейской части России, где ранее все случаи заражения ГЛПС связывали с вирусом Пуумала.
В ходе комплексных клинико-эпидемиологических, эпизоотологических и лабораторных исследований были выявлены природные очаги, где циркулируют ранее не известные, высоко патогенные для человека вирусы-возбудители ГЛПС, относящиеся к двум иммунологически и генетически отличающимся подтипам вируса Добрава. Один из них обнаружен в популяции кавказской лесной мыши (Apodemus ponticus) в субтропической зоне Краснодарского края (Большой Сочи), другой - у полевых мышей (Apodemus agrarius) в центральных областях европейской части России. Установлено, что штаммы из этих регионов имеют существенные биологические отличия, характеризуются значительной генетической разнородностью и различным уровнем вирулентности.
В последние годы были обнаружены новые природные очаги вируса Добрава на территории Самарской, Астраханской и Омской областей. Однако окончательный вывод об ареале подвидов вируса Добрава и нозоареале ГЛПС-ДОБ на территории России можно будет сделать лишь после проведения более широких исследований.
Многообразие клинических проявлений, а также существование стертых и атипичных клинических форм при ГЛПС нередко затрудняет дифференциальную диагностику болезни, в связи с чем для верификации диагноза необходимы лабораторные исследования. Для специфической диагностики ГЛПС в России широко применяются 2 вида диагностикумов: для проведения непрямого МФА (для серодиагностики ГЛПС у больных) и ИФА для выявления хантавирусного антигена.
В свете задач по совершенствованию специфической диагностики ГЛПС, повышения качества и эффективности проводимых исследований, своевременного реагирования в случае возникновения эпидемических проявлений хантавирусных инфекций на территории Российской Федерации, актуальным является более широкое применение молекулярно-генетических методов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является практически единственным методом, позволяющим осуществлять прямую детекцию хантавирусов в полевом и клиническом материале. Преимущества молекулярно-генетических методов приобретают особое значение при изучении хантавирусов, поскольку эти вирусы плохо размножаются в клеточных культурах, не обладают цитопатическим действием и не имеют удачной лабораторной модели инфекции. В некоторых случаях геном хантавирусов был охарактеризован задолго до того, как были выделены хантавирусные штаммы, либо, когда выделение вируса вовсе не представлялось возможным.
4. Сбор, хранение и транспортирование материалов, предназначенных для исследования молекулярно-генетическими методами
4.1. Мониторинг за возбудителями ГЛПС, исследование биологического материала иммунологическими методами проводят на базе федеральных государственных учреждений здравоохранения "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации. Проведение ПЦР - осуществляется в специализированных лабораториях, имеющих необходимый набор помещений, укомплектованных сертифицированным ПЦР-оборудованием в строгом соответствии с требованиями МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности". Исследования проводят врачи, прошедшие обучение на курсах повышения квалификации и получившие сертификат специалиста по генодиагностике инфекционных заболеваний. Порядок ПЦР-исследований материала, подозрительного на зараженность хантавирусами, проводимых на базе специализированных лабораторий, определен ниже (пп.4.2-4.4, 6.1-6.5).
4.2. Сбор клинического материала осуществляет медицинский персонал лечебно-профилактического учреждения, обученный правилам работы с ООИ. Наиболее информативным клиническим материалом для исследования методом ПЦР является кровь (плазма крови) от больных ГЛПС, полученная не позднее 8 сут от начала заболевания. Взятие крови у больных пациентов проводится в герметично закрывающуюся пробирку с 6%-м раствором ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) в соотношении 1:20 или пробирку с 3,8%-м раствором цитрата натрия в соотношении 1:9. Использование гепарина в качестве антикоагулянта не допускается. Для получения плазмы закрытые пробирки с кровью несколько раз переворачивают для смешивания с консервантом и затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 3-5 мин. Чтобы не допускать повторного замораживания проб, аликвоты плазмы предварительно разливают по 200-300 мкл в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл. Для выделения РНК используют 100 мкл плазмы крови, остаток материала замораживают и сохраняют при температуре минус 20 °С до конца исследования.
4.3. Сбор полевого материала для исследования на хантавирусы, а также отлов мышевидных грызунов и учет их численности проводится в соответствии с нормативными методическими документами.
Пункты учета и отлова выбираются в соответствии с возможностью изучения относительной численности и видового состава мелких млекопитающих в совокупности с наибольшим числом доступных стаций (открытых и закрытых лугополевых, лесокустарниковых, околоводных). В выбранных стациях в вечерние часы зоологами выставляются линии из больших или малых ловушек. В утренние часы следующего дня производится выемка мелких млекопитающих из ловушек, учет и упаковывание в тканевые мешочки или прочные одноразовые полиэтиленовые пакеты (каждая особь в отдельную упаковку).
Далее в лаборатории ООИ проводят вскрытие зверьков в следующем порядке. При вскрытии животных под контролем опытного зоолога проводится определение возрастного и полового состава добытых особей, их репродуктивной активности, уточнение видовой принадлежности. Для проведения лабораторных исследований на хантавирусы от каждого зверька в стерильные одноразовые пробирки (типа "Эппендорф") отдельно отбирают: легкое, сердце, печень, полоску фильтровальной бумаги, пропитанную кровью из грудной полости или сердца. Пробирки нумеруются согласно протоколу вскрытия и замораживаются в сосуде Дьюара (в жидком азоте) или в сумке - холодильнике с сухим льдом.
С целью предотвращения контаминации место разреза перед вскрытием зверька тщательно протирают одноразовым ватно-марлевым тампоном, обильно смоченным 96%-м спиртом. Во время вскрытия зверьков используют два набора стерильных пинцетов и ножниц. Одним набором делают разрез кожи и подкожной клетчатки, вторым - брюшной и грудной стенок, отбор частей легкого, печени и сердца. После вскрытия каждого зверька оба набора инструментов тщательно протирают ватно-марлевым тампоном, пропитанным антисептиком, и стерилизуют в пламени спиртовки.
При исследовании полевого материала методом ПЦР готовят суспензии органов, для чего кусочки ткани размером 1-2 см растирают стерильно пестиком в фарфоровой ступке, постепенно добавляя 1-2 мл 0,15 М раствора натрия хлорида. Для каждого образца используется стерильный инструментарий и отдельный набор из пестика и ступки. Для выделения РНК используют 150 мкл суспензии, остаток материала замораживают и сохраняют при температуре минус 20 °С до конца исследования.
4.4. Упаковка, условия хранения и транспортирования материалов для проведения лабораторной диагностики ГЛПС должны соответствовать требованиям нормативных методических документов.
Все материалы, доставляемые для исследования в лабораторию, должны быть герметично упакованы в плотно закрывающиеся пластмассовые пробирки или флаконы с завинчивающимися крышками, помещенными в полиэтиленовый пакет с ватой (или другим гигроскопичным материалом). В полиэтиленовый пакет вкладывают бланк направления с указанием: наименования направляющего учреждения, ф., и., о. больного, его возраста и местожительства, предварительного диагноза, вида материала, даты и времени взятия материала. Все пробирки, флаконы и прочие емкости должны быть маркированы в соответствии с направляемым списком. Герметично закрытые полиэтиленовые пакеты помещают в термоконтейнер (термос) с охлаждающими элементами или пакетами со льдом.
4.5. После забора клинического материала в больничном стационаре образцы крови с консервантом доставляются в ПЦР-лабораторию в охлажденном состоянии не позднее 12 ч с момента взятия, образцы плазмы - не позднее 2 сут (при температуре не выше 2-4 °С). При транспортировании и хранении материалов следует избегать повторного размораживания проб. При необходимости образцы полевого и клинического материалов (суспензии органов и плазму крови) можно хранить в течение 3-6 мес при температуре не выше минус 20 °С.
5. Рекомендуемые наборы реактивов, оборудования и расходных материалов для проведения анализа методом ПЦР
5.1. На этапах подготовки проб для исследования и анализа результатов ПЦР необходимо использовать только сертифицированные наборы реактивов (прилож.3). Использование несертифицированных тест-систем и наборов реактивов, возможно только для научных целей.
5.2. При проведении ПЦР-исследований рекомендуется использовать оборудование и расходные материалы, перечень которых приводится в МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности".
6. Схема проведения ПЦР-исследований полевого и клинического материала на наличие хантавирусов
Для исследований полевого и клинического материала методом ПЦР применяется традиционная схема анализа, включающая экстракцию РНК, обратную транскрипцию, постановку ПЦР и учет результатов. Требования и рекомендации по использованию необходимых наборов реактивов, оборудования и расходных материалов для проведения ПЦР-исследований приведены выше (пп.5.1, 5.2).
6.2. Описание методики выделения РНК из суспензий внутренних органов мелких млекопитающих. Для экстракции РНК из легочных суспензий используют двухэтапную экстракцию РНК. На первом этапе: в пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающимися или плотно закрывающимися крышками вносят по 400 мкл лизирующего раствора (в состав которого входят: гуанидинтиоцианат - 25%; цитрат натрия - 0,12 мМ (рН=7,0); саркозил натрия - 0,26%; кислый фенол - 44% и меркаптоэтанол - 0,35%). В пробирки с лизирующим буфером добавляют по 150 мкл образца, используя наконечник с аэрозольным барьером. Плотно закрывают крышки и перемешивают на вортексе. Далее к лизированным образцам добавляют 30 мкл ацетата натрия - 0,1 М (рН=4,0), перемешивают на вортексе и центрифугируют 5 с при 10 тыс. об/мин. В эти же пробирки добавляют 300 мкл буфера (кислый фенол), перемешивают на вортексе и центрифугируют 5 с при 10 тыс. об/мин. Далее вносят в пробирки по 100 мкл хлороформа, встряхивают на вортексе в течение 1 мин и помещают в холодильник при 2-8 °С на 10 мин. Затем центрифугируют пробирки в течение 10 мин при 12-14 тыс. об/мин.
Для проведения второго этапа экстракции осторожно вынимают пробирки из центрифуги и, не задевая промежуточной фазы, переносят 450 мкл водной фазы в пробирку, содержащую 450 мкл лизирующего буфера и 30 мкл сорбента, и последовательно повторяют все процедуры экстракции РНК, описанные выше в п.6.1 (методика выделения РНК из плазмы крови).
6.3. Описание методики проведения обратной транскрипции для получения кДНК. Обратную транскрипцию проводят со случайными праймерами. Готовится общая реакционная смесь из расчета количества анализируемых образцов. Для этого в пробирку с 0,02 М дитиотрейтолом (ДТТ) добавляют 125 мкл реакционной смеси, содержащей: дезоксинуклеозидтрифосфаты - дНТФ в концентрации 0,002 М; трис-(оксиметил)-аминометан-гидрохлорид (трис-НСl) - 0,1 М; калия хлорид - 0,15 М; магния хлорид - 0,006 М; случайные праймеры - 3 ОЕ/мл. К полученному раствору добавляют 6 мкл ревертазы (MMLV) в концентрации 200 Ед/мкл и все реагенты аккуратно перемешивают на вортексе 1-2 с. Реакция проводится в реакционном буфере в объеме 60 мкл (с учетом 30 мкл пробы). Для этого в каждую пробирку вносят по 30 мкл готовой реакционной смеси и добавляют 30 мкл РНК-пробы, затем все осторожно перемешивают и помещают в термостат при 37 °С на 30 мин. В результате реакции обратной транскрипции получают кДНК, которую используют для последующей постановки ПЦР.
6.4. Описание методики проведения ПЦР. Реакция проводится в растворе следующего состава: смесь дНТФ в концентрации 1 мМ; фермент ДНК-полимераза "ДиаТак" - 0,1 ед/мкл, трис-НСl - 0,17 М; аммония сульфат - 42 мМ; магния сульфат - 7,5 мМ; бычий сывороточный альбумин - 0,25 г/л; Tween-20 - 0,025%; глицерин - 20%; ксиленцианол - 0,02% и смесь из двух праймеров HantS/F-HantS/R или HantM/F-HantM/R (прилож.4), каждый в концентрации 3 пмоль/мкл.
Реакция проводится в реакционном буфере в объеме 25 мкл (с учетом 10 мкл кДНК) при использовании режима "горячего старта". При этом реакционная смесь (нижняя), содержащая праймеры и дезоксинуклеозидтрифосфаты, должна быть отделена слоем воска от верхней реакционной смеси, содержащей ПЦР-буфер и фермент. Расплавление воска и перемешивание смесей происходит только после запуска программы, что улучшает качество анализа в целом.
ПЦР проводят на амплификаторах с применением активного режима термоциклирования. Оптимальные температурно-временные параметры на приборе (типа "Терцик") следующие: денатурация 95 °С в течение 5 мин, затем 95 °С - 10 с, 62 °С - 10 с, 72 °С - 10 с - 2 цикла; 95 °С - 10 с, 60 °С - 10 с, 72 °С - 10 с - 2 цикла; 95 °С - 10 с, 58 °С - 15 с, 72 °С - 15 с - 38 циклов, заключительная элонгация 72 °С - 3 мин.
6.6. Подтверждающее тестирование образцов на ГЛПС и генотипирование хантавирусов осуществляется в Референс-центре на базе ГУ ИПиВЭ им. М.П.Чумакова РАМН (прилож.1). Для этого необходимо собрать материал от грызунов и больных людей, как указано в пп.4.2-4.3. Собранный материал должен быть предварительно протестирован с помощью одной из сертифицированных тест-систем, перечисленных в прилож.2. Протестированный материал, упакованный согласно п.4.4, направляется в Референс-центр по указанному адресу (прилож.1).
7. Генотипирование хантавирусов и интерпретация полученных результатов
Известно, что метод секвенирования считается "золотым стандартом" для типирования вирусов. Учитывая высокое разнообразие и не достаточную изученность спектра хантавирусов, циркулирующих на территории России, является целесообразным проведение секвенирования кДНК хантавирусов.
Использование для амплификации и секвенирования хантавирусов рекомендуемых универсальных праймеров имеет ряд преимуществ:
Информация, полученная в результате генотипирования хантавирусов, является эпидемиологически значимой, может представлять особую важность при определении эпидемического потенциала природных очагов ГЛПС и оценки уровня опасности "новых" штаммов для человека.
Унификация методических подходов для проведения молекулярно-генетических исследований предоставляет возможность создания единой информационной базы данных, позволяющей анализировать, интерпретировать и сопоставлять новую информацию с ранее полученными результатами.
Список сокращений
ГЛПС - геморрагическая лихорадка с почечным синдромом
ДОБ - вирус Добрава
ПУУ - вирус Пуумала
ИФА - иммуноферментный анализ
МФА - метод иммунофлуоресценции
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
кДНК - комплементарная ДНК
ООИ - особо опасные инфекции
н.п. - нуклеотидная последовательность
п.н. - пара нуклеотидов
Приложение 1
Координаты Референс-центра, осуществляющего дополнительное подтверждающее тестирование и генотипирование вирусов комплекса ГЛПС
1 Референс-центр по мониторингу за полиомиелитом, ГЛПС, клещевым вирусным энцефалитом на базе ГУ ИПиВЭ им. М.П.Чумакова РАМН.
142782, Московская обл., Ленинский р-н, пос. Институт полиомиелита. Тел.: (495) 439-90-94. Факс: (495) 439-93-21. E-mail: centrglps@gmail.ru, evgeniytkach@mtu-net.ru
Приложение 2
Перечень сертифицированных диагностических тест-систем, используемых для подтверждения диагноза ГЛПС у больных людей и проведения скрининговых исследований на наличие хантавирусного антигена у носителей хантавирусной инфекции
Приложение 3
Перечень наборов реактивов, рекомендуемых для проведения молекулярно-генетических исследований биологического материала на ГЛПС
Для проведения молекулярно-генетических исследований биологического материала на ГЛПС возможно использование любых сертифицированных наборов реактивов, предназначенных для выделения РНК, постановки ПЦР, обратной транскрипции и электрофореза.
Пример комплектации сертифицированных наборов реагентов (производства ФГУН "ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора"), необходимых для проведения ПЦР-исследований на хантавирусы:
Приложение 4
Наборы олигонуклеотидных праймеров, рекомендуемые в молекулярно-генетических исследованиях по определению генотипов хантавирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации
Наименование | Нуклеотидная последовательность 5’-3’ | Позиция генома | Штамм, сегмент |
Универсальные праймеры для детекции вирусов комплекса ГЛПС | |||
Hant M/F | ATC(T/A)ATAGAIGGTGCATGGIGTTCTG | 2971-2996 | Dobrava, SK/Aa AY961616, М-сегмент |
Hant M/R | CCACATTIAGGTGCICCATCATC | 3297-3275 |
|
Hant S/F | TT(C/T)AA(G/A)GATGACA(C/G)CTCATTTGAGGAT | 475-501 | Puumala, CG17/Baskiria-2001 AF442613, S-сегмент |
Hant S/R | C(T/A)GGTGC(A/C)CA(A/G)GCAAA(T/G)ACCCA | 949-928 |
|