Методические указания по методам контроля МУК 4.2.2886-11 Идентификация микроорганизмов и определение чувствительности их к антибиотикам с применением автоматизированной системы для биохимического анализа.

МУК 4.2.2886-11

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 Идентификация микроорганизмов и определение чувствительности их к антибиотикам с применением автоматизированной системы для биохимического анализа

Дата введения: с момента утверждения

1. РАЗРАБОТАНЫ ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (А.И.Верещагин, М.В.Зароченцев, И.В.Новокшонова, М.А.Ярославцева); ФГУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора (М.В.Храмов, В.М.Храмов); ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г.Москве" (Н.Я.Салова, Ф.М.Абасова) при участии ООО "СИ-ЛАБ", Москва (А.М.Веселовский, М.Б.Беглов).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).

3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г.Онищенко 30.06.2011.

4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

 1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы идентификации патогенных биологических агентов, обнаруженных в продовольственном сырье и пищевых продуктах, парфюмерно-косметической и другой продукции, объектах окружающей среды, клиническом (биологическом) материале, и устанавливают методы определения чувствительности выделенных микроорганизмов к антимикробным препаратам.

1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, парфюмерно-косметической и другой продукции, объектов окружающей среды, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в установленном порядке.

 2. Нормативные ссылки

1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ.

2. Федеральный закон "О качестве и безопасности пищевых продуктов" от 2 января 2000 г. N 29-ФЗ.

3. Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю), утверждены решением Комиссии таможенного союза от 28 мая 2010 г. N 299.

4. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

5. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

6. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" (с изменениями и дополнениями).

7. СанПиН 1.2.681-97 "Производство и контроль парфюмерно-косметической продукции для обеспечения ее безопасности и качества".

8. СанПиН 2.1.3.2630-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность".

9. МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам".

10. ГОСТ Р ИСО 7218-2008 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям".

11. Инструкция по мерам профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебных и профилактических учреждений. М., 1991.

 3. Общие положения

3.1. Автоматизированная система для биохимического анализа (далее - система) может быть использована при биохимической идентификации видовой принадлежности штаммов микроорганизмов, выделенных из различного материала в соответствии с действующими методическими документами и определении чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам. Биохимическая идентификация микроорганизмов с применением системы может осуществляться альтернативно биохимической идентификации, проводимой общепринятыми методами in vitro.

3.2. Работы по идентификации микроорганизмов и определению чувствительности их к противомикробным препаратам с применением системы следует осуществлять в соответствии с требованиями действующих нормативно-методических документов, регламентирующих безопасность работы с патогенными биологическими агентами.

 4. Сущность метода

4.1. Идентификация микроорганизмов с применением системы основана на регистрации и анализе результатов изменения биохимических субстратов под действием микроорганизмов (биохимическая идентификация) в сопоставлении с базой данных, включающей информацию о биохимических профилях микроорганизмов.

4.2. Принцип определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам с применением системы основан на определении ингибиции роста микроорганизмов антимикробными препаратами различных концентраций с установлением их минимальных ингибирующих концентраций (МИК), либо на выявлении множественной лекарственной устойчивости микроорганизмов.

4.3. Система позволяет осуществлять идентификацию аэробных и факультативно-анаэробных бактерий различных групп и семейств, дрожжевых, дрожжеподобных и других микроскопических грибов (прилож.1).

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и антимикотическим препаратам осуществляется с применением системы и различных типов планшет (прилож.2).

4.4. Система включает фотометр, который позволяет считывать результаты, полученные при проведении идентификации микроорганизмов и определении их чувствительности к антибиотикам на адаптированных к ней тест-планшетах. Результаты обрабатываются и интерпретируются автоматически. Информация о результатах идентификации микроорганизмов (с указанием рода, вида, биотипа, альтернативного близкородственного вида, статистических данных) отражается на экране компьютера в течение нескольких секунд. Возможно сохранение данных на диске и вывод их на печать.

4.5. Наименования микроорганизмов, идентифицируемых системой, приводятся в соответствии с 9-м изданием международного "Определителя бактерий Берджи".

 5. Отбор, подготовка проб (культур) и внесение бактериальной суспензии

5.1. При работе с применением системы используются суточные бактериальные культуры, выращенные на питательной среде в соответствии с инструкцией по применению тест-планшетов и стрипов. Если исследуемый материал находился в лиофилизированном состоянии в ампулах, то необходимо восстановить культуру на питательной среде, рекомендуемой в инструкциях по применению тест-планшетов или стрипов, после чего еще раз пересеять культуру на аналогичную питательную среду.

5.2. Для внесения исследуемого материала в тест-планшеты необходимо приготовить бактериальную суспензию определенной мутности (в зависимости от типа теста) по стандартам мутности подобных Mc-Farland или ФГБУ "НЦЭСМП" или с аналогичными характеристиками.

5.3. Внесение бактериальной суспензии в лунки планшета осуществляется 8-канальным дозатором с помощью стерильных наконечников объемом 1200 мкл.

5.4. Все работы, в т.ч. пересевы, приготовление бактериальной суспензии и внесение ее в лунки планшета, осуществляют асептично с соблюдением требований биологической безопасности и техники лабораторных работ.

 6. Аппаратура, материалы и реактивы

Система, подобная МикроТакс, SY-LAB Gerate, GmbH (или Система с аналогичными характеристиками), включющая:

1) ридер МТ-1 - 8-канальный фотометр для считывания планшет со встроенным шейкером и жидкокристаллическим дисплеем; спектральный диапазон: 400-750 нм, 7 фильтров - 405, 414, 450, 492, 540, 620 и 690 нм; способ измерения: монохроматический, бихроматический, мультихроматический, точность 2% или 0,007 А, диапазон измерений 0-3,5 ед. оптической плотности;

2) инкубатор МТ-5 (внутренняя камера которого выполнена из нержавеющей стали) с жидкокристаллическим дисплеем. Диапазон температур: от 20 до 70 °С. Отклонение от температуры при 37 °С: ±0,5 °С, время нагрева до 37 °С - 37 мин, время охлаждения с 37 до 30 °С - 79 мин;

3) автоматическая 8-канальная электронная пипетка с зарядным устройством;

4) управляющий блок на базе персонального компьютера с программным обеспечением и принтером.

Тест-планшеты, подобные МикроТакс или с аналогичными характеристиками - стандартные, 96-луночные, с внесенными компонентами:

- МикроТакс-IDS (4 теста/планшет) - для быстрой (экспресс) в течение 5-6 ч идентификации 113 наиболее клинически значимых штаммов энтеробактерий, стафилококков, стрептококков, энтерококков;

- МикроТакс-Е (4 теста/планшет) - для идентификации 79 видов энтеробактерий за 18-24 ч;

- МикроТакс-NF (3 теста/планшет) - для идентификации 72 видов неферментирующих бактерий за 18-24 ч;

- МикроТакс-RPO (2 теста/планшет) - для идентификации 167 видов бактерий родов: стафилококки, стрептококки, энтерококки, коринебактерии, листерии;

- МикроТакс-Candida (4 теста/планшет) - для идентификации 32 видов клинически значимых грибов/дрожжей за 24 ч;

- МикроТакс-STAPH (4 теста/планшет) - для идентификации клинически значимых стафилококков за 6 и 18-24 ч;

- МикроТакс-STREP 2 (4 теста/планшет) - для идентификации клинически значимых стрептококков и энтерококков за 20-24 ч;

- МикроТакс-S (

-Lactamase detection (1 тест/планшет) - подтверждающий тест для фенотипической детекции ESBL (расширенного спектра

-лактамазы) у грамотрицательных бактерий за 18-24 ч;

- МикроТакс-S MRSA & VRE (1 тест/планшет) - для детекции множественной устойчивости стафилококков (MRSA), энтерококков (VRE) и пневмококков за 18-24 ч;

- МикроТакс-S Anaerobs MIC (1 тест/планшет) - для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антимикробных агентов с высокой активностью в отношении анаэробов за 18-24 ч;

- МикроТакс-S Pneumococcus & Haemophilus (1 тест/планшет) - для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антимикробных агентов в отношении пневмококков и гемофильных бактерий за 18-24 ч;

- МикроТакс-S Campylobacter (1 тест/планшет) - для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антимикробных агентов в отношении кампилобактерий за 18-24 ч;

- МикроТакс-S Cystic Fibrosis (1 тест/планшет) - для исследования множественной лекарственной устойчивости неферментирующих бактерий, вызывающих развитие цистита за 18-24 ч;

- МикроТакс-AM КН2 (1, 2 или 4 теста/планшет) - для определения чувствительности дрожжей и криптококков к антимикотическим агентам (6 антимикотических агентов в различных концентрациях) за 22-24 ч;

- МикроТакс-AM MIC (1, 2 или 4 теста/планшет) - для определения чувствительности дрожжей и криптококков к антимикотическим агентам (9 антимикотических агентов в различных концентрациях) за 22-24 ч;

- МикроТакс-SВ/быстрый тест (1, 2 или 4 теста/планшет) - для определения бактериальной чувствительности к антибиотикам за 6 ч;

- МикроТакс-SB/ночная инкубация (1, 2 или 4 теста/планшет) - для определения бактериальной чувствительности к антибиотикам за 18-24 ч;

- МикроТакс-UR (2 теста/планшет) - для идентификации и определения чувствительности быстрорастущих аэробных бактерий к антибиотикам за 18-24 ч.

Стрипы, подобные перечисленным, или с аналогичными характеристиками:

- MIC-стрип ESBLII (1 контроль) - фенотипический подтверждающий тест для детекции ESBL (

-лактамазы), которая продуцируется энтеробактериями;

- MIC-стрип MRSA (1 контроль) - фенотипический подтверждающий тест для детекции метициллин-резистентных стафилококков;

- MIC-стрип PEN (1 контроль) - фенотипический подтверждающий тест для детекции резистентности к пенициллину у пенициллиноустойчивых изолятов стрептококков и пневмококков;

- MIC-стрип VAN (1 контроль) - фенотипический подтверждающий тест для детекции ванкомицин-резистентных грамположительных бактерий.

Реактивы и питательные среды:

- типа NF-Susmed, реактив для МикроТакс-NF или с аналогичными характеристиками;

- типа Candida-Susmed, реактив для МикроТакс-RC или с аналогичными характеристиками;

- изосенситест, реактив для МикроТакс-S;

- Н-бульон, реактив для МикроТакс-S;

- среда МикроТакс-SB;

- индольный реагент;

- TDA реагент;

- нитрат реагент А;

- нитрат реагент В;

- парафиновое масло;

- пептидазный реагент.

Стандарты мутности, подобные McFarland или ФГБУ "НЦЭСМП" или с аналогичными характеристиками.

Пластиковые расходные материалы (наконечники для пипетки, контейнер для стерилизации и хранения наконечников, 2- и 4-камерные кюветы).

Допускается применение других материалов, реактивов, питательных сред с аналогичными по назначению и свойствам характеристиками, адаптированных к системе, и разрешенных к применению в установленном порядке.

 7. Проведение испытаний

 7.1. Идентификация микроорганизмов с применением планшетов

 7.1.1. Экспресс-идентификация микроорганизмов

Для экспресс-идентификации в течение 5-6 ч 113 наиболее клинически значимых аэробных грамотрицательных оксидазоотрицательных бактерий и грампозитивных бактерий применяют планшеты соответствующего назначения (4 теста/планшет; 23 биохимические реакции; 1 контроль).

Ход исследования. Войдите в программу MCN. В колонке "Работа с данными" перейдите в раздел "Ввод и правка образцов", в котором введите номер образца. Внизу укажите тип теста "I" и введите код таксона.

Приготовьте бактериальную суспензию из 24-часовой культуры микроорганизмов, выращенной строго на кровяном агаре без добавок. Если проводить культивирование на иной среде, то это приведет к изменению биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов и, как следствие, к ложным результатам. Суспензию со значением мутности 2,0 по МакФарланду необходимо приготовить в 5 мл физиологического раствора. Перенесите полученную суспензию в 4-камерную кювету.

Внесите по 100 мкл бактериальной суспензии в следующие лунки планшета:

А1 : В12 - определение 1;

C1: D12 - определение 2;

E1: F12 - определение 3;

G1 : Н12 - определение 4.

Добавьте по 2 капли парафинового масла в следующие лунки (здесь и далее порядок расположения лунок указан согласно приведенной ниже схеме планшета):

А 4+5+6, В 4+5, С 4+5+6, D 4+5, Е 4+5+6, F 4+5, G 4+5+6, Н 4+5

Схема планшета

Накройте планшет специальной перфорированной пленкой, которая прилагается к набору. Использование перфорированной пленки гарантирует проникновение кислорода, необходимого для реакций. В то же время газовый обмен между ячейками планшета, нарушающий протекание реакций, становится невозможным.

Инкубируйте 5-6 ч при 37 °С.

По окончании инкубации снимите покрывающую планшет пленку и добавьте по 2 капли реактивов в следующие лунки:

пептидазный реагент - в лунки А 1+2+3, В 2, С 1+2+3, D 2, Е 1+2+3, F 2, G 1+2+3, Н 2;

индольный реагент - в лунки В 1, D 1, F 1, Н 1.

Подождите не менее 5 мин (но не более 30 мин) для развития окраски, после чего тщательно протрите дно лунок планшета фильтровальной бумагой и проведите считывание на ридере. Для этого войдите в программу MCN. В колонке "Работа с данными" перейдите в раздел "Считывание". Нажмите "Старт" для начала считывания. Планшеты должны быть считаны в тот же день, на следующий день считывание невозможно.

После считывания проведите вычисление результатов. Для этого в программе MCN в колонке "Работа с данными" перейдите в раздел "Вычисление". Нажмите "Старт" для начала вычисления. Система выдаст полученные в ходе исследования результаты.

 7.1.2. Идентификации энтеробактерий и других грамотрицательных оксидазоотрицательных бактерий

Для идентификации энтеробактерий и других грамотрицательных оксидазоотрицательных бактерий за 18-24 ч применяют планшеты соответствующего назначения (4 теста/планшет; 21 биохимическая реакция; 4 контроля).

Ход исследования. Войдите в программу MCN. В колонке "Работа с данными" перейдите в раздел "Ввод и правка образцов", в котором введите номер образца. Внизу укажите тип теста "Е" и введите код таксона.

Приготовьте бактериальную суспензию из 24-часовой культуры микроорганизмов, выращенной на кровяном агаре (с эритроцитами барана) или на простом питательном агаре. Если проводить культивирование на иной среде, то это приведет к изменению биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов и, как следствие, к ложным результатам. Суспензию со значением мутности 0,5 (строго не более!) по МакФарланду необходимо приготовить в 5 мл физраствора. Перенесите полученную суспензию в 4-камерную кювету.

Внесите по 100 мкл бактериальной суспензии в следующие лунки планшета:

А1 : В12 - определение 1;

C1 : D12 - определение 2;

E1 : F12 - определение 3;

G1 : Н12 - определение 4.

Добавьте по 2 капли парафинового масла в следующие лунки:

В 1+2 - определение 1;

D 1+2 - определение 2;

F 1+2 - определение 3;

H 1+2 - определение 4.

Накройте планшет Е специальной перфорированной пленкой, которая прилагается к набору. Использование перфорированной пленки гарантирует проникновение кислорода, необходимого для реакций. В то же время газовый обмен между ячейками планшета, нарушающий протекание реакций, становится невозможным.

Инкубируйте 18-24 ч при 37 °С.

По окончании инкубации снимите покрывающую планшет пленку и добавьте по 2 капли реактивов в следующие лунки:

Подождите 3-30 мин (не более!) для развития окраски, после чего тщательно протрите дно лунок планшета фильтровальной бумагой и проведите считывание на ридере. Для этого войдите в программу MCN. В колонке "Работа с данными" перейдите в раздел "Считывание". Нажмите "Старт" для начала считывания. Планшеты должны быть считаны в тот же день, на следующий день считывание невозможно.

После считывания проведите вычисление результатов. Для этого в программе MCN в колонке "Работа с данными" перейдите в раздел "Вычисление". Нажмите "Старт" для начала вычисления. Система выдаст полученные в ходе исследования результаты.

 7.1.3. Идентификация неферментирующих грамотрицательных оксидазоположительных бактерий

Для идентификации неферментирующих грамотрицательных оксидазоположительных бактерий за 18-24 ч применяют планшеты соответствующего назначения (3 теста/планшет; 27 биохимических реакций; 5 контролей).

Ход исследования. Войдите в программу MCN. В колонке "Работа с данными" перейдите в раздел "Ввод и правка образцов", в котором введите номер образца. Внизу укажите тип теста "N" и введите код таксона.

Приготовьте бактериальную суспензию из 24-часовой культуры микроорганизмов, выращенной строго на кровяном агаре (с эритроцитами барана) без добавок. Если проводить культивирование на иной среде, то это приведет к изменению биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов и, как следствие, к ложным результатам.

Суспензию со значением мутности 0,5 по МакФарланду необходимо приготовить в 5 мл физраствора. Перенесите 1,0 мл приготовленной суспензии в 6 мл предварительно приготовленной среды NF-Susmed и перемешайте. Перенесите полученную суспензию в стерильную (стерилизация паром под давлением при 121 °С) 2-камерную кювету.

Внесите по 100 мкл бактериальной суспензии в следующие лунки планшета:

А1 : Н4 - определение 1;

А5 : Н8 - определение 2;

А9 : Н12 - определение 3.

Добавьте по 2 капли парафинового масла в следующие лунки:

В1-Н1;А2, В2 - определение 1;

В5-Н5; А6, В6 - определение 2;

В9-Н9; А10, В10 - определение 3.

Накройте планшет специальной перфорированной пленкой, которая прилагается к набору. Использование перфорированной пленки гарантирует проникновение кислорода, необходимого для реакций. В то же время газовый обмен между ячейками планшета, нарушающий протекание реакций, становится невозможным.

Инкубируйте 18-24 ч строго при 28-30 °С. Если бактериальный рост недостаточен, то инкубируйте еще 24 ч.

По окончании инкубации снимите покрывающую планшет пленку и добавьте по 2 капли индола в следующие лунки:

Подождите не менее 3 мин для развития окраски (но не более 20 мин перед считыванием), после чего тщательно протрите дно лунок планшета фильтровальной бумагой и проведите считывание на ридере. Для этого войдите в программу MCN. В колонке "Работа с данными" перейдите в раздел "Считывание". Нажмите "Старт" для начала считывания. Планшеты должны быть считаны в тот же день, на следующий день считывание невозможно.

После считывания проведите вычисление результатов. Для этого в программе MCN в колонке "Работа с данными" перейдите в раздел "Вычисление". Нажмите "Старт" для начала вычисления. Система выдаст полученные в ходе исследования результаты.

 7.1.4. Идентификация грамположительных кокков и палочек

Для идентификации грамположительных кокков и палочек (бактерии родов Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Corynebacteria, Listeria и др.) за 18-24 ч применяют планшеты соответствующего назначения (2 теста/планшет; 44 биохимических реакции; 4 контроля).

Ход исследования. Войдите в программу MCN. В колонке "Работа с данными" перейдите в раздел "Ввод и правка образцов", в котором введите номер образца. Внизу укажите тип теста "Р" и введите код таксона (STA, STR, COR или ВАС).

Приготовьте бактериальную суспензию из 24-часовой культуры микроорганизмов, выращенной строго на кровяном агаре (с эритроцитами барана) без добавок. Если проводить культивирование на иной среде, то это приведет к изменению биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов и, как следствие, к ложным результатам. Медленнорастущие бактерии, такие как бактерии родов

Streptococcus, Gardnerella

и некоторые виды рода

Corinebacteria

необходимо выращивать в течение 48 ч в атмосфере 5% СO

.

Суспензию со значением мутности 2,0 по МакФарланду необходимо приготовить в 6 мл физраствора.

Внесите по 100 мкл бактериальной суспензии в следующие лунки планшета:

A1 : D12 - определение 1;

E1 : Н12 - определение 2.

Добавьте по 2 капли парафинового масла в следующие лунки:

А12-D12 - определение 1;

Е12-Н12 - определение 2.

Накройте планшет специальной перфорированной пленкой, которая прилагается к набору. Использование перфорированной пленки гарантирует проникновение кислорода, необходимого для реакций. В то же время газовый обмен между ячейками планшета, нарушающий протекание реакций, становится невозможным.

Инкубируйте 18-24 ч при 37 °С. Если бактериальный рост недостаточен, то инкубируйте еще 24 ч.

По окончании инкубации снимите покрывающую планшет пленку и добавьте по 2 капли пептидазного реагента в следующие лунки:

Подождите 3-30 мин (не более!) для развития окраски, после чего тщательно протрите дно лунок планшета фильтровальной бумагой и проведите считывание на ридере. Для этого войдите в программу MCN. В колонке "Работа с данными" перейдите в раздел "Считывание". Нажмите "Старт" для начала считывания. Планшеты должны быть считаны в тот же день, на следующий день считывание невозможно.