ГОСТ Р ИСО 21571-2014 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот.
ГОСТ Р ИСО 21571-2014
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Продукты пищевые
МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ И ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ НИХ ПРОДУКТОВ
Экстракция нуклеиновых кислот
Foodstuffs. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Nucleic acid extraction
ОКС 67.050
ОКСТУ 9109
9209
9709
Дата введения 2015-07-01
Предисловие
1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным учреждением науки "Институт физиологии растений им.К.А.Тимирязева" Российской академии наук (ИФР РАН) на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 447 "Биологическая безопасность пищевых продуктов, кормов и товаров народного потребления и методы ее контроля"
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 ноября 2014 г. N 1656-ст.
4 Настоящий стандарт является идентичным международному стандарту ИСО 21571:2005* "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот" (ISO 21571:2005 "Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Nucleic acid extraction"), включая техническую поправку: Amd.1:2013.
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты Российской Федерации и межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0-2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
Введение
Исследование генетически модифицированных организмов (далее - ГМО) и производных продуктов осуществляется посредством следующих стадий, выполняемых последовательно или одновременно. После отбора проб нуклеиновые кислоты выделяются из анализируемой пробы. Выделенные нуклеиновые кислоты далее могут быть очищены от возможных примесей в самом процессе выделения или после него. Следующими этапами являются: оценка количества выделенных нуклеиновых кислот (при необходимости), разведение нуклеиновых кислот (при необходимости) и выполнение аналитических процедур, например полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР). Указанные этапы подробно изложены в настоящем стандарте и следующих международных стандартах*:
- ИСО 21568 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Отбор проб";
- ИСО 21569 "Продукты пищевые. Методы анализа на обнаружение генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Качественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте";
- ИСО 21570 "Продукты пищевые. Методы анализа на обнаружение генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте".
Дополнительная информация об общих требованиях и определениях, относящихся к упомянутым выше этапам, приведена в ИСО 24276 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения".
В 2013 г. в ИСО 21571:2005 была внесена техническая поправка N 1 (Amd.1:2013) в части уточнения условий экстракции ДНК и добавления нового подраздела А.5.2 (приложение А), касающегося применения гуанидин-хлороформного метода для соевого лецитина. В настоящем стандарте техническая поправка N 1 выделена на полях одиночной вертикальной чертой.
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает общие требования и специфические методы выделения, очистки и количественной оценки дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее - ДНК). Эти методы изложены в приложениях А и В.
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, но может быть также применен к другим продуктам, например семенам и кормам.
Настоящий стандарт следует применять совместно с ИСО 21569, ИСО 21570 в части аналитических методов на основе нуклеиновых кислот, в частности качественных аналитических методов, установленных в ИСО 21569, и количественных аналитических методов, установленных в ИСО 21570.
2 Нормативные ссылки
Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта.
ИСО 24276:2006 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения (ISO 24276:2006, Foodstuffs. Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. General requirements and definitions)
ИСО 21568:2003 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Отбор образцов (ISO 21658:2003, Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Sampling)
3 Принципы
3.1 Общие положения
Основная цель применения методов экстракции нуклеиновых кислот - обеспечение выделения нуклеиновых кислот, пригодных для последующего анализа (см. ИСО 24276).
Примечание - "Качество" ДНК зависит от средней длины экстрагированных молекул ДНК, химической чистоты и структурной целостности одной нити и двойной спирали ДНК (например, внутри- и межцепочечные связи оснований ДНК, выпадение оснований в цепочке ДНК, перекрестные сшивки с высокомолекулярными спиртами, гемином и т.д.). Кроме того, такие структурные изменения часто являются специфичными для определенной последовательности ДНК и поэтому не распределены по геному случайным образом (см. [1]-[4]).
Пользователям настоящего стандарта необходимо иметь в виду, что некоторые методы (например, методы на основе диоксида кремния) могут быть запатентованы.
3.2 Экстракция ДНК
Основной принцип выделения присутствующей в пробе ДНК заключается в одновременной или последующей очистке ДНК от ингибиторов полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Методы выделения и очистки ДНК изложены в приложении А. Выбор метода основывается на опыте пользователя с учетом области применения и примеров продуктов, которые указаны в каждом методе.
Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующем продукте, подлежащем исследованию.
3.3 Количественная оценка содержания ДНК
Количественная оценка экстрагированной ДНК может потребоваться для последующего ПЦР-анализа.
Такая оценка может выполняться либо физическими (например, измерением поглощения при специфической длине волны), физико-химическими (например, применением интеркалирующих или связующих агентов, обладающих флюоресцентными свойствами), ферментативными (например, биолюминесцентным обнаружением) методами, либо путем количественной ПЦР. Последний метод применяется для продуктов сложного состава, проб с низким содержанием ДНК или проб, в которых ДНК подверглась деградации.
Существует несколько методов, применяемых для определения количества ДНК, присутствующей в растворе. Эти методы изложены в приложении В.
Выбор наиболее подходящего метода осуществляется пользователем в зависимости от количества и качества ДНК, подлежащей количественному определению, а также от продукта, из которой была экстрагирована ДНК.
Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующем продукте.
4 Общие требования к лаборатории
Вследствие воздействия пыли и распыляемых аэрозолей может происходить случайная контаминация ДНК, поэтому организация рабочих мест в лаборатории основывается на строгом соблюдении:
- последовательности всех установленных методологических этапов, используемых для получения промежуточных и конечных результатов;
- принципа "прямого потока" при обращении с пробами.
Использование последнего принципа гарантирует, что ДНК, подлежащая анализу, и полученная в результате ПЦР амплифицированная ДНК, остаются физически разделенными.
Дополнительные требования к лабораториям приведены в ИСО 24276.
5 Методика
5.1 Приготовление проб для анализа
5.1.1 Общие положения
Специфические параметры анализируемого продукта (например, влажность) и его обработка могут влиять на количество и качество ДНК, выделяемой из анализируемого продукта. В связи с этим рабочие характеристики применяемого метода экстрагирования ДНК зависят от конкретного анализируемого продукта.
Необходимо принять соответствующие меры, чтобы гарантировать, что проба для анализа является представительной, отобранной из лабораторной пробы.
Проба для анализа должна быть достаточной(го) массы (объема) и содержать достаточное количество молекул ДНК для обеспечения представительности лабораторной пробы.
Исходя из практических и технических соображений не рекомендуется, чтобы масса пробы для анализа превышала 2 г.
Любые ограничения, связанные с массой (объемом) пробы для анализа, не позволяющие рассматривать ее как представительную, должны быть учтены при интерпретации аналитических результатов и указаны в протоколе испытаний.
Методы экстракции ДНК, приведенные в приложении А, устанавливают массу пробы для анализа от 200 до 500 мг, что обычно является приемлемым для продукции с высоким содержанием ДНК (молотое зерно, мука). Однако некоторые продукты содержат очень малое количество ДНК или деградировавшую ДНК, в связи с этим указанная масса пробы не позволит выделить достаточное для анализа количество ДНК. В таких случаях масса (объем) пробы может быть увеличена.
Выделение ДНК должно выполняться не менее чем из двух параллельных проб одной и той же продукции.
Хранение стандартных образцов, лабораторных проб и анализируемых проб должно соответствовать требованиям ИСО 24276 и быть организовано таким образом, чтобы анализируемые биохимические параметры были сохранены (подробнее см. ИСО/МЭК 17025).
5.1.2 Пробы
|
Все операции по приготовлению лабораторных проб (например, измельчение, гомогенизация, деление, высушивание) должны выполняться в соответствии с лабораторными правилами, описанными в ИСО 24276:2006 (пункт 5.3.2). При выполнении всех необходимых операций должны быть приняты меры предосторожности для защиты лабораторной пробы от загрязнения или изменения ее состава.
Лабораторные пробы должны быть достаточно гомогенными перед измельчением или размолом и перед отбором анализируемой пробы. |
В случае жидких проб сосуд с пробой необходимо встряхивать для обеспечения гомогенизации продукта. В случае негомогенных продуктов типа неочищенных масел необходимо убедиться, что осадок и все нерастворимые составляющие полностью удалены со стенок сосуда.
|
В случае твердых проб, которые не могут быть суспендированы без затруднений, лабораторная проба должна быть размолота для уменьшения размера частиц и/или облегчения экстрагируемости ДНК. В таких случаях особое внимание необходимо обратить на размер частиц. Проба для анализа, подвергаемая экстракции, должна содержать минимальное количество частиц. Необходимо, чтобы оборудование, предназначенное для дробления и измельчения проб, было легко моющимся по всей рабочей поверхности и обеспечивало требуемое количество и распределение по размерам частиц (гранулометрический состав) анализируемой пробы. |
Если какие-либо компоненты лабораторной пробы были удалены до проведения экстракции ДНК, то это должно быть указано в протоколе испытаний с описанием проведенных операций.
Для твердых или пастообразных готовых пищевых продуктов с высоким содержанием липидов достаточно трудно достичь требуемого размера частиц за один этап измельчения. В таких случаях допускается перед измельчением применять дополнительные процедуры, такие как удаление липидов гексаном после промежуточного измельчения, замораживание или сублимационная сушка.
Для улучшения измельчения пастообразных или вязких продуктов в некоторых случаях можно использовать одну из следующих обработок:
- нагрев до максимальной температуры 40°С;
- растворение в соответствующей жидкости, например в воде;
- замораживание при температуре минус 20°С или ниже.
|
После такой обработки необходимо гомогенизировать всю лабораторную пробу. Затем необходимо отобрать две параллельные анализируемые пробы с учетом возможного проведения в дальнейшем процедур разбавления или концентрирования. |
Во время проведения процедур размола и измельчения необходимо соблюдать меры, гарантирующие нагрев лабораторной пробы на минимальном уровне и не допускающие ее сильного нагревания, так как нагрев может отрицательно воздействовать на качество выделяемой ДНК.
По возможности необходимо избегать способов размола/измельчения, при которых возникает высокий риск перекрестного загрязнения (например, комбинированное использование жидкого азота и ступки, а также использование одной и той же ступки для разных образцов). Одним из основных требований является необходимость изолирования любого методологического этапа, при проведении которого происходит образование пыли, от всех других аналитических этапов и процедур.
В случае присутствия в лабораторной пробе солей, специй, сахарной пудры и/или других веществ, которые потенциально могут оказывать влияние на выделение ДНК или последующий аналитический метод, должны быть предприняты дополнительные соответствующие процедуры очистки в соответствии с используемым методом (см. приложение А).
Например, в случае образцов сложного состава целевой материал для исследования (например, панировочный слой рыбных палочек) может быть отделен от остальной части продукта для выделения ДНК.
5.2 Экстракция и очистка ДНК
5.2.1 Общие положения
При разработке методов выделения ДНК необходимо учитывать следующие требования.
Качество и выход экстрагированной нуклеиновой кислоты при использовании того или иного метода для того или иного продукта должны быть как повторяемыми, так и воспроизводимыми при условии содержания достаточного количества нуклеиновой кислоты в анализируемой пробе, из которой она была выделена.
Для получения ДНК хорошего качества рекомендуется при необходимости удалить следующие компоненты:
- рибонуклеиновые кислоты (далее - РНК) и/или белки путем соответствующей обработки, например ферментативной обработки рибонуклеазой и протеиназой соответственно;
- липидные фракции путем ферментативной обработки или использования растворителей (например гексана);
- солей (например из буфера для выделения и лизиса, добавляемых в раствор на стадии осаждения), способных оказывать влияние на последующий анализ.
В частности, в случае твердых или высушенных проб объем буфера для выделения и лизиса должен быть таким, чтобы гарантировать растворение в нем ДНК.
Примечание - Очистка ДНК может выполняться различными способами, например путем фракционного осаждения с использованием таких растворителей, как фенол, хлороформ, этанол, изопропанол, и/или с использованием адсорбции на твердые матрицы (ионообменную смолу, силикагель или жидкое стекло, диатомовую землю, мембраны и т.д.). Можно объединить несколько принципов очистки ДНК. При необходимости выделение и очистка могут совмещаться путем выполнения на одном и том же этапе.
В случае использования соосадителей ДНК, например гликогена, полиэтиленгликоля (ПЭГ), транспортной РНК (т-РНК), для увеличения выхода ДНК в ходе стадий осаждения они не должны обладать нуклеазной активностью (содержать детектируемый уровень нуклеаз), содержать ингибиторы и/или конкуренты ПЦР или последовательности нуклеиновых кислот, гомологичные анализируемым последовательностям. При выделении ДНК из генетически модифицированных растений в качестве соосадителя может быть использована ДНК-носитель, например ДНК из спермы лосося или сельди.
При использовании сублимационных сушилок для высушивания осадка ДНК, полученного после стадии осаждения, необходимо учитывать риск перекрестного загрязнения.
Необходимо повторно растворяют ДНК в воде или буферном растворе для предотвращения деградации ДНК.
При применении нового метода выделения ДНК или одного из методов, описанных в приложении А, для новых продуктов потенциальные качество и целостность выделенной ДНК с использованием выбранного метода должны быть проверены следующим образом: путем добавления в лизирующий буфер известного количества меченой ДНК вместе с пробой, из которой необходимо выделить ДНК. Если оценка нового метода производится на основании использования меченой ДНК, количество (масса) которой известно, или подсчета количества копий определенной последовательности ДНК, необходимо оценить возможную перекрестную реактивность такой ДНК с ДНК, содержащейся в исследуемой пробе.
Примечание - Использование меченой ДНК является наилучшим приближением к реальной ситуации, когда предполагается образование комплекса ДНК данного продукта с другими компонентами (например белками). Такой метод также может использоваться для оценки присутствия растворимых ингибиторов ПЦР в выделенной ДНК (см. ИСО 24276, ИСО 21569 и ИСО 21570).
Однако меченая ДНК может привести к ложному представлению о степени извлечения ДНК, так как она может гораздо легче выделяться из продукта, чем целевая ДНК.
5.2.2 Процедуры контроля
Процедуры контроля, подлежащие использованию при проведении анализа, описаны в таблице 1 ИСО 24276. Они должны включать, как минимум, отрицательный и положительный контроли экстрагирования, а также могут включать контроль окружающей среды.
5.2.3 Контроль чистоты ДНК. Внутренний контроль ПЦР
При отработке нового метода экстрагирования присутствие ингибиторов ПЦР в экстрагированной ДНК может быть оценено с помощью внесения чужеродной ДНК (внутренний стандарт, см. ИСО 24276, ИСО 21569 и ИСО 21570). Количество добавленной ДНК не должно превышать максимальный уровень, допустимый для применяемой системы ПЦР, и должно содержать установленное число копий последовательности целевой ДНК. Это число необходимо определять отдельно для каждой последовательности целевой ДНК и указывать как кратное нижнему пределу обнаружения. В идеальном случае концентрация целевой ДНК в ПЦР при положительном контроле должна соответствовать чувствительности, требуемой для анализа. При использовании в качестве положительного контроля ПЦР высококонцентрированной клонированной целевой последовательности ДНК необходимо соблюдать осторожность из-за высокой опасности перекрестного загрязнения. По возможности нуклеиновые кислоты положительного контроля должны максимально соответствовать параметрам нуклеиновых кислот исследуемого материала.
5.3 Количественная оценка экстрагированной ДНК
5.3.1 Общие положения
|
Качество, целостность и количество экстрагированной нуклеиновой кислоты оказывают влияние на рабочие характеристики аналитического метода и, следовательно, на полученные аналитические результаты. Предел обнаружения конкретного метода может, таким образом, зависеть от количества использованных нуклеиновых кислот. Необходимо определить общее количество ДНК, которое используется в ПЦР, равно как и общее количество ДНК целевого таксона, так как ДНК нецелевого таксона может повлиять на эффективность ПЦР. |
Количественная оценка ДНК помогает:
- при определении эффективности различных методов выделения ДНК для определенного вида объектов (повторяемость);
- измерении концентрации нуклеиновых кислот перед анализом.
5.3.2 Область применения
Каждый метод количественной оценки должен применяться в пределах его динамического диапазона с учетом уровня точности измерения.
5.3.3 Количественные стандарты
Точность методов количественной оценки зависит от стандартов нуклеиновых кислот, используемых для калибровки метода.
При использовании метода, чувствительного к размеру и/или качеству фрагментов нуклеиновой кислоты, должны применяться стандарты нуклеиновой кислоты, которые соответствуют ожидаемым размеру и/или качеству нуклеиновой кислоты, экстрагированной из пробы.
Используемый контрольный материал (национальный или международный стандартный образец) должен обеспечивать проявление заявленных характеристик по непрерывной цепи при сравнении со стандартами национального или международного эталона (см. Руководство ИСО 30).
При применении метода с использованием интеркалирующих (встраивающихся в ДНК) агентов необходимо применять стандарт ДНК с высокой молекулярной массой, если количественной оценке подлежит ДНК с высокой молекулярной массой. Соответственно необходимо использовать стандарт ДНК с низкой молекулярной массой при количественной оценке ДНК с низкой молекулярной массой. Нуклеиновая кислота с высокой молекулярной массой, как правило, содержит некоторое количество фрагментов с более низкой молекулярной массой. Это означает, что многие методы количественной оценки ДНК имеют определенную степень неточности, которую необходимо учитывать при оценке результатов.
Примечание - Кроме того, в зависимости от исследуемого материала и применяемого метода выделения некоторая часть ДНК может быть извлечена в виде одноцепочечной ДНК (которая имеет гораздо более низкую способность к интеркаляции), что приводит к занижению общего содержания ДНК. С другой стороны, одноцепочечная ДНК также хорошо обнаруживается путем физических измерений.
Для построения калибровочного графика требуется не менее трех точек, предпочтительно в нескольких повторностях. Количество стандартной ДНК, использованной для каждой точки калибровочного графика, зависит от чувствительности метода и динамического диапазона измерений.
5.4 Стабильность выделенной ДНК
Выделенная из пробы ДНК должна храниться в условиях, которые обеспечивают ее стабильность для проведения последующих анализов.
Следует избегать многократного замораживания и оттаивания растворов ДНК.
6 Оценка результатов
Применяемый метод экстракции ДНК должен обеспечивать получение нуклеиновой кислоты, качество и количество которой соответствуют требованиям последующих анализов.
|
Качество выделенных нуклеиновых кислот должно быть удостоверено соответствующим аналитическим методом с регистрацией и оценкой параметров, аналогичных используемым при предстоящем анализе (например, если анализ, который будет выполнен, это ПЦР, качество выделенной ДНК должно быть оценено с использованием соответствующего ПЦР-контроля). |
Дополнительные параметры для оценки совместимости метода указаны в ИСО 21569, ИСО 21570 и ИСО 24276.
7 Протокол испытаний
В случае представления протокола испытаний в соответствии с ИСО 24276 в него должна быть включена следующая дополнительная информация о деятельности лаборатории:
- описание происхождения проб для анализа и предварительной обработки пробы перед экстракцией нуклеиновой кислоты;
- масса проб для анализа, используемых для экстракции нуклеиновой кислоты;
- используемый метод экстракции нуклеиновой кислоты;
- любые нетипичные ситуации, наблюдаемые во время проведения испытаний;
- любая операция, не указанная в методе или рассматриваемая как необязательная, которая может оказать влияние на результаты;
- оценка результатов;
- персонал.
Обработка и хранение исходных данных изложены в ИСО/МЭК 17025.
Приложение А
(обязательное)
Методы экстракции ДНК
А.1 Получение применимой для ПЦР ДНК методами экстракции ДНК на основе фенола/хлороформа
А.1.1 Основной метод на основе фенола/хлороформа
А.1.1.1 Общие положения
Настоящий метод является общепринятым (см. [5]) и применяется для экстракции ДНК из большой группы продуктов (см. А.1.1.8).
Фенол обычно подходит для деструкции нуклеаз и денатурации белка.
При исследовании листьев или зеленой массы растений (например, листьев цикория, высушенной люцерны) вместе с ДНК могут совместно осаждаться многие ингибиторы ПЦР. По этой причине могут возникнуть трудности, связанные с воспроизводимостью получения ДНК, амплифицируемой в ПЦР.
С учетом агрессивных и опасных свойств фенола в качестве альтернативы целесообразно применять методы экстрагирования ДНК, основанные на ЦТАБ и/или поливинилпирролидоне (ПВП) и/или на адсорбции диоксидом кремния.
А.1.1.2 Статус валидации
Этот метод широко применяется во всех областях биологии, агрономии и медицины на протяжении 40 лет, однако он никогда не подвергался оценке путем межлабораторных исследований для обнаружения ГМО в пищевых продуктах.
А.1.1.3 Принцип метода
Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия и высокой концентрации этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и последующее удаление загрязняющих примесей (например, липофильных молекул, полисахаридов и белков) и нуклеаз из водной фазы, содержащей ДНК, с помощью фенола и хлороформа. Заключительное осаждение этиловым спиртом концентрирует ДНК и удаляет соли и остаточный хлороформ. Критическим этапом метода является стадия лизиса [5].
А.1.1.4 Меры предосторожности
Работы с органическими реактивами необходимо выполнять в вытяжном шкафу.
А.1.1.5 Реактивы
Следует хранить и использовать при температуре минус 20°С.
А.1.1.5.4 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.
А.1.1.5.10 Калия гидроксид, KOH.
А.1.1.5.11 Калия хлорид, KCI.
А.1.1.5.13 Протеиназа К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.
А.1.1.5.14 Рибонуклеаза-А, выделенная из бычьей поджелудочной железы, очищенная от ДНК, приблизительно 50000 ед./мг лиофилизата.
А.1.1.5.15 Уравновешенный фенол, >7,8 ед. рН
Используется фенол, уравновешенный буфером для экстрагирования/лизиса (А.1.1.5.18), без SDS, или приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.
А.1.1.5.16 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт
Смешивают 24 объемные части хлороформа (А.1.1.5.7) и одну объемную часть изоамилового спирта (А.1.1.5.5).
А.1.1.5.17 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт
Смешивают одну объемную часть уравновешенного фенола (А.1.1.5.15) и одну объемную часть смеси хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.1.5.16).
А.1.1.5.18 Буфер для экстрагирования/лизиса
Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или KOH.
Автоклавирование раствора не допускается. Следует хранить при температуре минус 20°С, избегать многократного замораживания и оттаивания.
Следует хранить при температуре минус 20°С, избегать многократного замораживания и оттаивания.
Следует хранить при температуре минус 20°С.
Доводят значение рН до 5,2 ед. рН ледяной уксусной кислотой. Автоклавирование раствора не допускается. При необходимости пропускают через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
А.1.1.6 Оборудование
Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.
А.1.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение не менее 10000 g. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.
А.1.1.6.2 Водяная баня или инкубатор с рабочим диапазоном температур от 60°С до 70°С
А.1.1.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).
А.1.1.6.4 Сублимационная сушилка (при необходимости).
|
А.1.1.6.5 Встряхиватель, например Vortex  . |
_______________
А.1.1.6.6 Реакционные сосуды, способные выдержать заморозку в жидком азоте.
А.1.1.7 Методика
А.1.1.7.1 Общие положения
Сразу после приготовления анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК. При изменении размера анализируемой пробы необходимо соответственно скорректировать массы и объемы реактивов и буферных растворов.
А.1.1.7.2 Методика выделения
Добавляют к верхнему слою один объем смеси хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.1.5.16), затем осторожно и тщательно перемешивают. Центрифугируют при ускорении 5000 g в течение 10 мин и переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку. Повторяют до тех пор, пока граница раздела фаз не станет четкой. Смешивают образовавшийся верхний слой с 0,1 объема раствора ацетата калия (А.1.1.5.23) и 2,5 объема 96%-ного этилового спирта (А.1.1.5.1), затем тщательно перемешивают, переворачивая пробирки. Выдерживают в течение по меньшей мере 5 мин в жидком азоте или 1 ч при температуре минус 80°С, или всю ночь при температуре минус 20°С. Центрифугируют при ускорении 10000g (или до 13000g) при температуре 4°С в течение по меньшей мере 15 мин, затем осторожно сливают образовавшийся верхний слой.
Тщательно промывают осадок ДНК в пробирке после центрифугирования двумя объемами 70%-ного раствора этилового спирта (А.1.1.5.22). Центрифугируют при ускорении от 10000g до 13000g при температуре 4°С в течение 15 мин, затем осторожно сливают образовавшийся верхний слой. Эта стадия является особенно важной для удаления осаждающихся солей, которые могут оказать влияние на последующий анализ (например, ПЦР).
А.1.1.8 Перечень примеров
_______________
А.1.2 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для заквасочных культур колбас, подвергаемых ферментации
А.1.2.1 Общие положения
Этот метод предназначен для экстракции суммарной ДНК, включая бактериальную геномную ДНК, из колбас. Применимость метода для получения ДНК высокого качества, пригодной для специфического обнаружения рекомбинантной ДНК с использованием ПЦР, была продемонстрирована на колбасах, подвергнутых ферментации [6], а также на колбасах, подвергнутых ферментации и термической обработке, так называемых "летних колбасах" [7]. Кроме того, было показано, что настоящий метод экстракции пригоден для выделения суммарной ДНК из сливок специально для обнаружения Staphylococcus aureus в этом пищевом продукте [8]. (Перечень продуктов, для которых применим этот метод, приведен в А.1.2.8).
А.1.2.2 Статус валидации
Этот метод был проверен при межлабораторном исследовании проб массой 0,4 г (см. А.1.2.9).
А.1.2.3 Принцип метода
Метод заключается в выделении бактериальных клеток из пищевого продукта путем гомогенизации проб колбас с последующим центрифугированием. Полученный осадок содержит не только бактериальные клетки, но также и частицы мяса. Для проведения специфического лизиса бактериальных клеток их оболочки расщепляют, добавляя лизоцим. Для улучшения расщепления клеточных оболочек молочнокислых бактерий может быть добавлен мутанолизин. Полный лизис клеток происходит при добавлении детергента SDS (додецилсульфата натрия) и протеиназы-К, а затем несколько раз проводится экстрагирование водной фазы фенолом и/или хлороформом. Стадия экстрагирования фенолом/хлороформом является важной для устранения любой нуклеазной активности и ингибиторов ПЦР, включая те, которые возникли из пищевого продукта (например гематина). Последним этапом является осаждение ДНК этиловым спиртом.
А.1.2.4 Меры безопасности
Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.
А.1.2.5 Реактивы
Следует хранить и использовать при температуре минус 20°С.
А.1.2.5.4 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.
А.1.2.5.5 Натрия гидроксид, NaOH.
А.1.2.5.12 Лизоцим
А.1.2.5.14 Протеиназа-К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.
А.1.2.5.16 Уравновешенный фенол
Используют фенол, уравновешенный буферным раствором Трис/HCI (>7,8 ед. рН) или приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.
А.1.2.5.17 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт
Смешивают 24 объемные части хлороформа (А.1.2.5.8) и одну объемную часть изоамилового спирта (А.1.2.5.6).
А.1.2.5.18 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт
Смешивают 25 объемных частей уравновешенного фенола (А.1.2.5.16) с 24 объемными частями хлороформа (А.1.2.5.8) и одной объемной частью изоамилового спирта (А.1.2.5.6).
Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20°С, избегая многократного замораживания и оттаивания.
Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20°С, избегая многократного замораживания и оттаивания.
Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH.
А.1.2.5.23 Буфер для экстрагирования/лизиса, содержащий одну объемную часть буфера А (А.1.2.5.22) и одну объемную часть раствора сахарозы (А.1.2.5.21).
Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20°С, избегая многократного замораживания и оттаивания.
Следует хранить при температуре и использовать при температуре минус 20°С.
Доводят значение рН до 5,2 единиц ледяной уксусной кислотой.
Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH.
А.1.2.6 Оборудование
А.1.2.6.1 Инструменты для измельчения пробы (например, скальпель).
А.1.2.6.2 Центрифуга, поддерживающая ускорение, как минимум, 12000g. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.
А.1.2.6.3 Водяная баня или инкубатор.
А. 1.2.6.4 Вакуумная сушилка (при необходимости).
А.1.2.6.5 Смеситель, например, Vortex.
А.1.2.7 Методика
А.1.2.7.1 Общие положения
Сразу после приготовления анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК. При изменении размера навески пробы требуется соответственно масштабировать массу реактивов и объемы буферов.
А.1.2.7.2 Приготовление пробы
А.1.2.7.3 Методика выделения ДНК
Добавляют один объем смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.2.5.18) и перемешивают.
Центрифугируют смесь в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000g. Переносят верхнюю водную фазу в новую пробирку.
Добавляют один объем смеси хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.2.5.17) и перемешивают.
Центрифугируют смесь в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000g. Переносят верхнюю фазу в новую пробирку.
Добавляют 0,1 объема раствора ацетата натрия (А.1.2.5.27) и один объем изопропанола (А.1.2.5.1). Осторожно перемешивают несколько раз путем переворачивания пробирки.
Выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении приблизительно 12000g. Надосадочную жидкость удаляют.
Надосадочную жидкость отбрасывают.
А.1.2.8 Перечень примеров
См. таблицу А.1.
Таблица А.1 - Перечень продуктов, к которым был успешно применен данный метод
|
|
|
Успешно проанализированный продукт | Микроорганизм | Ссылка |
Колбаса, подвергнутая ферментации | Lactobacillus curvatus | [6] |
"Летняя колбаса" (обработанная термически) | Lactobacillus curvatus | [7] |
Сливки | Staphylococcus aureus | [8] |
A.1.2.9 Эффективность применения метода
Данные по эффективности применения, приведенные в таблице А.2, были получены в результате совместного исследования, выполненного рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевых продуктов, полученных с использованием способов генной инженерии" Комиссии Федерального управления по охране здоровья Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах [6].
При проведении этого исследования два образца дали ложноположительные результаты, вызванные, возможно, недостатками упаковки. Для данного исследования мутанолизин не использовался.
Таблица А.2 - Данные эффективности применения метода
|
|
|
|
Количество участвующих лабораторий | Количество образцов колбасы на лабораторию | Общее количество образцов | Количество корректно идентифицированных образцов |
15 | 10 | 150 | 148 |
А.1.3 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для заквасочных культур йогурта
А.1.3.1 Общие положения
Настоящий метод описывает процедуру экстрагирования основной массы ДНК из заквасочных культур, используемых для ферментации йогурта из молочных продуктов. Эта методика успешно применяется для обычных йогуртов, включая йогурты, содержащие различные ингредиенты, такие как фрукты, добавки и стабилизаторы, а также для продуктов с различным содержанием жира (см. А.1.3.8 и [9]-[11]). Из йогуртов, подвергнутых термической обработке [12], также экстрагируется ДНК, пригодная для ПЦР.
А.1.3.2 Статус валидации
Этот метод был проверен при межлабораторном исследовании (см. А.1.3.9).
А.1.3.3 Принцип метода
Этот метод основывается на способе выделения ДНК с помощью фенола/хлороформа, который адаптирован к специальному пищевому продукту. Грамположительные заквасочные культуры йогуртов концентрируются после расщепления коагулированного казеина при щелочном рН. Выделенные клетки повторно суспендируют в буферном водном растворе и обрабатывают лизоцимом (и мутанолизином) для расщепления клеточных оболочек. Лизис клеток происходит при добавлении ионного детергента, такого как додецилсульфат натрия (SDS). Белки удаляют путем обработки протеиназой-К, а затем экстрагируют смесью фенол - хлороформ и хлороформом в несколько стадий. Последней стадией является осаждение ДНК этиловым спиртом.
А.1.3.4 Меры безопасности
Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.
А.1.3.5 Реактивы
Следует хранить и использовать при температуре минус 20°С.
А.1.3.5.4 Хлорид натрия, NaCI.
А.1.3.5.6 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.
А.1.3.5.7 Гидроксид натрия, NaOH.
А.1.3.5.16 Протеиназа-К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.
Растворяют в стерильной воде. Автоклавирование не допускается. Перед использованием готовят свежий раствор.
А.1.3.5.21 Уравновешенный фенол
Используется фенол со значением 8,0 ед. рН и уравновешенный буфером Трис/HCI (>7,8 ед. рН) или, например, приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.
А.1.3.5.22 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт
Смешивают 24 объемные части хлороформа (А.1.3.5.10) и одну объемную часть изоамилового спирта (А.1.3.5.8).
А.1.3.5.23 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт
Смешивают 25 объемных частей насыщенного фенола (А.1.3.5.21) с 24 объемными частями хлороформа (А.1.3.5.10) и одной объемной частью изоамилового спирта (А.1.3.5.8).
Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20°С, избегать многократного замораживания и оттаивания.
Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20°С, избегать многократного замораживания и оттаивания
Доводят значение до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH.
А.1.3.5.28 Буфер для экстрагирования/лизиса, содержащий 1 объемную часть буферного раствора А (А.1.3.5.27) и одну объемную часть раствора сахарозы (А.1.3.5.26).
Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20°С, избегать многократного замораживания и оттаивания.
Следует хранить и использовать при температуре минус 20°С.
Доводят значение рН до 5,2 ед. рН ледяной уксусной кислотой.
Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH.
А.1.3.6 Оборудование
Применяется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.
А.1.3.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение не менее 12000g. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.
А.1.3.6.2 Водяная баня или инкубатор.
А.1.3.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).
А.1.3.6.4 Смеситель, например, Vortex®.
А.1.3.7 Методика
А.1.3.7.1 Общие положения
Сразу после приготовления навески анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК.
При изменении размера пробы требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы буферов.
А.1.3.7.2 Методика экстракции ДНК
Надосадочную жидкость отбрасывают.
А.1.3.8 Перечень примеров
См. таблицу А.3.
Таблица А.3 - Перечень продуктов, к которым был успешно применен описанный метод
|
|
|
|
Успешно проанализированный продукт | Содержание, добавки и т.д. | Микроорганизм | Ссылка |
Обычный йогурт | 0,3% жира, 3,5% жира | Streptococcus thermophilus | [9], [11] |
Фруктовые йогурты | 1,5% жира, модифицированный крахмал, лесной орех, желатин
1,5% жира, 3,8% белка, аспартам, ацесульфам, ананас
3,5% жира, ароматизатор, желатин, персик, кокосовый орех
10% жира, модифицированный крахмал, лимон, ароматизатор, миндаль, пектин, каротин, рибофлавин | Streptococcus thermophilus | [9] |
Обычный йогурт, подвергнутый термообработке | 3,5% жира | Streptococcus thermophilus | [12] |
А.1.3.9 Эффективность применения метода
Данные по эффективности применения методики, приведенные в таблице А.4, были получены в результате совместного исследования, выполненного рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевых продуктов, полученных с использованием способов генной инженерии" Комиссии Федерального управления по охране здоровья Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах [11].
При проведении этого исследования две лаборатории не выполнили проверку гибридизацией. Для данного исследования мутанолизин не использовался.
Таблица А.4 - Данные по эффективности применения метода
|
|
|
|
Количество участвующих лабораторий | Количество образцов йогурта на лабораторию | Общее количество образцов | Количество корректно идентифицированных образцов |
20 | 10 | 200 | 200 (99 контрольных образцов и 101 образец с ГМО) |
А.1.4 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для дрожжей и/или гифомицетов, собранных с пищевых продуктов
А.1.4.1 Общие положения
Данный метод описывает одноступенчатое выделение и очистку ДНК, пригодной для ПЦР, из дрожжей, гифомицетов [13] или выделенных микробных популяций. Метод применим для выделения ДНК из генетически модифицированных микроорганизмов в продуктах очень сложного состава [14], [15]. Метод может использоваться для выделения общей ДНК из продукта [14], [15] или из микробной фракции, которая непосредственно выделена из продукта либо собрана из заквасочных культур (колонии на жидких или агаровых средах).
Примечание - Предварительное выделение микробной фракции из образца для анализа дает наиболее достоверные результаты при выделении ДНК.
Общую ДНК из продукта выделяют с помощью альтернативных методов, приведенных в приложении А. Однако эти методы не гарантируют, что достаточное количество ДНК будет выделено из всех микроорганизмов (особенно из грибов, устойчивых к лизису, или грамотрицательных бактерий). Данный метод может использоваться для выделения общей ДНК из таких продуктов, как йогурт, молоко или сыр. Однако достоверное хорошее выделение ДНК обеспечивается только для тонкоизмельченных или размолотых твердых продуктов. В силу этого перед применением метода его эффективность необходимо всегда проверять на ДНК основного исследуемого продукта.
Для получения доступа к полной версии без ограничений вы можете выбрать подходящий тариф или активировать демо-доступ.