ГОСТ Р 51198-98 Мясо и мясные продукты. Метод определения L-(+)-глутаминовой кислоты.

ГОСТ Р 51198-98

(ИСО 4134-78)

Группа Н19

 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ

 Метод определения

-(+)-глутаминовой кислоты

Meat and meat products. Method for determination of  

-(+)-glytamic acid content

ОКС 67.120.10

ОКСТУ 9209

Дата введения 2000-01-01

 Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Московской государственной академией пищевых производств

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 28 августа 1998 г. N 336

3 Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 4134-78 "Мясо и мясные продукты. Определение содержания

-(+)-глутаминовой кислоты" с дополнительными требованиями, отражающими потребности экономики страны (2, 4, 6.6, 6.8, 6.12, 6.13, 7.1 и 9.1)

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Январь 2010 г.

      1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на мясо и мясные продукты и устанавливает метод определения

-(+)-глутаминовой кислоты.

      2 Нормативные ссылки

ГОСТ 9793-74 Продукты мясные. Методы определения влаги

ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1-91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб

      3 Определение

Массовая доля

-(+)-глутаминовой кислоты - массовая доля

-(+)-глутаминовой кислоты, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в процентах.

      4 Сущность метода

-(+)-глутаминовую кислоту экстрагируют из пробы продукта, взятой на испытание, ледяным раствором хлорной кислоты. Смесь центрифугируют, фильтруют и доводят активную кислотность фильтрата до требуемого значения. Проводят ферментативное преобразование

-(+)-глутамата в

-кетоглутарат в ходе реакции с никотинамидадениндинуклеотидом (НАД) в присутствии глутаматдегидрогеназы (ГДГ):

-(+)-глутамат + НАД

+ Н

О

-кетоглутарат + НАДН + NН

-кетоглутарат + НАДН + NН

+ Н

.

Затем окисляют эквивалентное количество восстановленной формы НАДН хлоридом йодонитротетразолия (ИНТ) в присутствии липоаминдегидрогеназы (ЛАДГ):

НАДН + ИНТ-хлорид + Н

HAД

+ формазан.

Измеряют массовую долю образовавшегося формазана на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

      5 Реактивы

Все реактивы должны быть аналитического качества (не ниже х.ч.). Все растворы, кроме растворов неорганических соединений (5.1 и 5.2), должны храниться в закрытой посуде из темного стекла, тщательно вымытой и пропаренной или стерилизованной.

Вода, используемая для приготовления растворов ферментов, должна быть деминерализованной или бидистиллированной, полученной в стеклянном дистилляторе.

Вода, используемая для приготовления растворов химических реагентов и подготовки проб, должна быть дистиллированной или деминерализованной.

Примечание - Однократно дистиллированная вода может содержать ионы металлов, которые снижают активность ферментов, а деминерализованная вода может содержать микроорганизмы, увеличивающие неспецифическую фоновую ферментативную активность и искажающие результаты анализа.

Препарат НАД должен содержать не менее 90% основного вещества.

-(+)-глутаминовая кислота должна содержать не менее 98% основного вещества.

Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые наборы реактивов при условии соответствия качества реактивов требованиям настоящего стандарта.

5.1 Раствор хлорной кислоты

(HClO

)=1,0 моль/дм

8,6 см

раствора хлорной кислоты массовой доли 70% и плотности 1,67 г/см

помещают в мерную колбу вместимостью 100 см

и доводят объем раствора до метки водой.

Примечание - При использовании хлорной кислоты меньшей массовой доли проводят перерасчет объема кислоты, используемой для осаждения белков.

5.2 Раствор гидроксида калия

(KOH)=2 моль/дм

Растворяют 56,1 г гидроксида калия (KOH) в воде, доводят объем раствора до 500 см

.

5.3 Буферный раствор активной кислотности 8,6 рН

5.3.1 Растворяют 1,86 г гидрохлорида триэтаноламина в воде, доводят активную кислотность раствора до 8,6 рН раствором гидроксида калия (5.2), используя для измерений рН-метр. Затем добавляют 0,68 г октилфенолдекаэтиленгликолевого эфира (например, Тритон

=100) и доводят объем раствора до 100 см

водой.

5.3.2 Растворяют 0,86 г двузамещенного фосфорнокислого калия (K

НРO

) и 0,007 г однозамещенного фосфорнокислого калия (KН

РO

) в воде и доводят объем раствора до 100 см

.

5.3.3 Смешивают 20 см

раствора по 5.3.1 и 5 см

раствора по 5.3.2.

Раствор хранят при температуре 4 °С.

5.4 Раствор НАД

Навеску НАД массой 0,025 г растворяют в 5,0 см

воды в небольшой колбе со шлифом, колбу закрывают пробкой.

Раствор устойчив не менее 1 мес при температуре 4 °С.

5.5 Раствор йодонитротетразолия [2-(р-йодофенил)-3-(р-нитрофенил)-5-фенилтетразолия] хлорида (ИНТ-хлорида)

Растворяют 0,030 г ИНТ-хлорида в 50 см

воды, колбу закрывают пробкой.

Раствор устойчив не менее 2 мес при температуре 4 °С в темноте.

5.6 Раствор ЛАДГ

Растворяют 0,003 г лиофильно высушенной липоаминдегидрогеназы в 1 см

воды.

Раствор устойчив не менее трех недель при температуре 4 °С.

5.7 Раствор ГДГ

Используют раствор глютаматдегидрогеназы концентрации 10 мг/см

, свободный от сульфата аммония, этилендиаминтетрауксусной кислоты и глутаминазы, поставляемый в готовом виде (например в расфасовке по 1,0 см

), удельной активностью не менее 900 Е/см

.

Раствор устойчив не менее 12 мес при температуре 4 °С.

5.8 Стандартный раствор

-(+)-глутаминовой кислоты

Растворяют 0,050 г

-(+)-глутаминовой кислоты в 25 см

воды. Активную кислотность раствора устанавливают 7,0 рН раствором гидроксида калия (5.2), после чего доводят объем раствора до 50 см

.

Раствор хранят при температуре 4 °С и непосредственно перед использованием разводят водой в соотношении объемов 1:49.

      6 Средства контроля и вспомогательные устройства

Обычная лабораторная аппаратура, а также указанная в 6.1-6.11.

6.1 Мясорубка механическая лабораторная, снабженная перфорированной пластинкой с отверстиями диаметром не более 4 мм.

6.2 Миксер лабораторный.

6.3 Центрифуга лабораторная с пробирками вместимостью 50 или 100 см

.

6.4 Иономер или рН-метр диапазоном измерений от 1 до 14 рН и допускаемой погрешностью ±0,05 рН.

6.5 Фильтры бумажные гофрированные диаметром 15 см.

6.6 Колбы мерные вместимостью 100 и 250 см

и допускаемой относительной погрешностью

±0,2%.

6.7 Дозаторы пипеточные объемами доз 25, 50 и 100 см

и относительной погрешностью дозирования

±1%.

6.8 Пипетки градуированные вместимостью 0,05; 0,2; 0,5 и 2,5 см

и допускаемой относительной погрешностью

±1%.

6.9 Шпатели пластиковые или палочки стеклянные для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.

6.10 Спектрофотометр (фотометр) со следующими техническими характеристиками: спектральный интервал - не более 10 нм; интервал измерений оптической плотности - от 0,000 до 2,000; погрешность установки длины волны - ±3 нм; среднее квадратическое отклонение случайной составляющей погрешности измерений - не более 0,15%.

6.11 Кюветы фотометрические толщиной поглощающего слоя 10 мм.

6.12 Термометр жидкостный стеклянный с интервалом измерений от 0 до 100 °С, допускаемой погрешностью измерений ±2 °С.

6.13 Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью ±0,001 г.

      7 Порядок подготовки к проведению измерений

7.1 Отбор проб - по ГОСТ Р 51447.

7.2 Пробу массой не менее 200 г, полученную из репрезентативной выборки, хранят в условиях, предотвращающих порчу и изменение состава.

      8 Порядок проведения измерений

8.1 Подготовка пробы к проведению измерений

Образец пробы гомогенизируют, дважды пропуская через мясорубку (6.1) и тщательно перемешивая.

Образец хранят не более 24 ч в заполненном доверху и герметически закрытом контейнере таким образом, чтобы предотвратить порчу или изменение состава.

8.2 Навеска для проведения анализа

Взвешивают приблизительно 50 г исследуемого образца с точностью до 10 мг и помещают навеску образца в лабораторный миксер (6.2).

8.3 Приготовление экстракта

8.3.1 К навеске образца в лабораторном миксере добавляют 100 см

охлажденного льдом раствора хлорной кислоты (5.1) и гомогенизируют.

8.3.2 Часть гомогенизата помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при угловой скорости 3000 мин

, затем, осторожно отодвинув слой жира, отфильтровывают супернатант через гофрированный бумажный фильтр (6.5) в коническую колбу вместимостью 200 см

. Первые 10 см

фильтрата выбрасывают.

8.3.3 50 см

подготовленного раствора, который может быть слегка мутным, переносят в стаканчик вместимостью 100 см

и доводят активную кислотность раствора до 10 рН раствором гидроксида калия (5.2).

8.3.4 Количественно переносят содержимое стаканчика в мерную колбу вместимостью 100 см

и доводят объем раствора до метки водой.

8.3.5 Раствор охлаждают в ледяной бане 20 мин и фильтруют через гофрированный бумажный фильтр (6.5), отбросив первые 10 см

фильтрата.

8.3.6 25 см

фильтрата переносят в мерную колбу вместимостью 250 см

и доводят объем фильтрата до метки водой.

Примечание - Объем фильтрата выбирают так, чтобы концентрация

-(+)-глутаминовой кислоты была приблизительно 0,030 г/дм

.

8.4 Определение

8.4.1 Температуру растворов по 5.3 и 8.3.6 доводят до 20-25 °С. Для проведения ферментативной реакции берут две фотометрические кюветы (6.11), в каждую из которых пипеточным дозатором (6.5) добавляют:

- 2,50 см

буферного раствора (5.3);

- 0,20 см

раствора НАД (5.4);

- 0,20 см

раствора ИНТ (5.5) и

- 0,05 см

раствора линоаминдегидрогеназа (5.6).

Затем в одну кювету вносят 0,50 см

экстракта (8.3.6), получая исследуемый раствор, а во вторую - 0,50 см

воды, получая контрольный раствор.

Растворы в кюветах перемешивают пластиковыми шпателями или стеклянными палочками (6.9) и измеряют оптические плотности относительно воздуха при длине волны 492 нм:

- оптическая плотность исследуемого раствора,

- оптическая плотность контрольного раствора.

Температура растворов должна быть от 20 до 25 °

С.

8.4.2 В каждую кювету вносят по 0,05 см

раствора ГДГ (5.7) и тщательно смешивают с содержимым, используя шпатель или стеклянную палочку (6.9).

Растворы выдерживают 15 мин. Затем измеряют оптические плотности при длине волны 492 нм, повторяя измерения через каждые 2 мин до достижения постоянных значений.

Строят графики зависимости оптических плотностей растворов от времени и экстраполируют их на момент внесения фермента ГДГ (приложение А).

Получают экстраполированные значения оптических плотностей исследуемого (

) и контрольного (

) растворов.

8.4.3 Определяют микромолярный коэффициент оптической плотности формазана, повторяя операции по 8.4.1 и 8.4.2, но заменяя 0,5 см

экстракта в первой фотометрической кювете на 0,5 см

стандартного раствора

-(+)-глутаминовой кислоты (5.8).

Получают следующие значения оптических плотностей:

-

- стандартного раствора

-(+)-глутаминовой кислоты;

-

- контрольного раствора;

-

- стандартного раствора

-(+)-глутаминовой кислоты;

-

- контрольного раство

ра.

8.5 Выполняют два параллельных определения в двух пробах из одного и того же образца (8.1).

      9 Правила обработки результатов измерений

9.1 Метод расчета

Массовую долю

-(+)-глутаминовой кислоты в пробе

, %, вычисляют по формуле     

где

;

       

- молярная масса

-(+)-глутаминовой кислоты;

- массовая доля влаги в пробе, определенная по ГОСТ 9793;

- масса навески (8.2), г;

       

- объем фильтрата, взятый на определение (8.3.6), см

;

       

- микромолярный коэффициент оптической плотности формазана при длине волны 492 нм, см

/мкмоль, рассчитанный по формуле

,

где

.

За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений при условии выполнения 9.2.

Результат определяют с точностью 0,01%.

9.2 Сходимость

Относительное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать 10% среднеарифметического значения.

      10 Оформление результатов измерений

В отчете об испытании должны быть указаны:

- используемый метод;

- полученные результаты;

- любые условия проведения испытаний, не установленные данным стандартом и касающиеся подробностей, которые могут повлиять на конечный результат.

В отчете должны быть все данные, необходимые для полной идентификации пробы.

ПРИЛОЖЕНИЕ А

(справочное)

 Пример построения графика зависимости оптической плотности раствора от времени