Методические указания по методам контроля МУК 4.2.3250-14 Микробиологическое измерение концентрации Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 в воздухе рабочей зоны.

МУК 4.2.3250-14

Методические указания

 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 Микробиологическое измерение концентрации

ВН-1811 ВКПМ В-9029 в воздухе рабочей зоны

1. Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им.Н.И.Пирогова" Минздрава России (д.б.н. Н.И.Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. N 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю.Поповой 30 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

 Введение

Сборник методических указаний "Измерение концентраций штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны" (выпуск 2) разработан с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций микроорганизмов их предельно допустимым концентрациям (ПДК), что является обязательным при осуществлении санитарно-эпидемиологического контроля.

Включенные в данный список методические указания по контролю биотехнологических штаммов в воздухе рабочей зоны разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ 8.563-96 ГСИ. "Методики выполнения измерений".

Методики выполнены с использованием современных и адекватных микробиологических методов исследования и позволяют контролировать концентрации биотехнологических штаммов на уровне и ниже их ПДК в воздухе рабочей зоны, установленных в гигиенических нормативах.

Методические указания по измерению концентраций штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны предназначены для лабораторий центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, санитарно-микробиологических лабораторий промышленных предприятий, а также для научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований, для осуществления контроля за содержанием штаммов в воздухе рабочей зоны.

 1. Назначение и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации

Azotobacter chroococcum

ВН-1811 ВКПМ В-9029 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м

воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

 2. Биологическая характеристика штамма

ВН-1811 ВКПМ В-9029 и его гигиенический норматив в воздухе рабочей зоны

Штамм Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 выделен из почв Подмосковья, не является генетически модифицированным штаммом. Штамм продуцирует гетероауксин, антибиотики. Предполагается использовать в растениеводстве.

На среде Федорова штамм образует крупные, круглые, выпуклые, непрозрачные, гладкие колонии с ровными краями. Через 18-20 ч при t 28-30°C можно видеть мелкие полиморфные клетки. Через 48 ч роста наблюдаются мелкие палочки, которые могут располагаться парами.

Желатин разжижает, крахмал быстро гидролизует. Восстанавливает лакмусовое молоко. Нитраты восстанавливает до нитритов, каталазоположительный, образует сероводород, вызывает гемолиз.

Штамм Azotobacter chroococcum ВН-1811 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКП МВ-9029.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50000 кл/м

.

 3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м

воздуха при доверительной вероятности 0,95.

 4. Методы измерений

Прямой метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений бактерий на среду Федорова и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

 5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнений измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

5.1. Средства измерений

Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5-790 мм рт.ст. и пределом допустимой погрешности ±2,5 мм рт.ст.		ТУ 2504-1799-75*
Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ±0,2 мг		ГОСТ Р 53228-08
Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2		ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см		ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см		ГОСТ 1770-74
Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0-55°C		ТУ 25-2021.003--88
Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160±5)°C		ТУ 9452-010-00141798-02
Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (28±2) и (37±2)°C		ТУ 9452-002-00141798-97
Автоклав электрический		ГОСТ 9586-75
Стерилизаторы паровые медицинские		ГОСТ Р ЕН 13060-11, ГОСТ Р 51935-2002
Дистиллятор		ТУ 4952-007-33142130-2000
Облучатель бактерицидный настенный		ТУ 9444-015-03965956-08
Холодильник бытовой		ГОСТ 26678-85
Микроскоп биологический с иммерсионной системой
Лупа с увеличением 10		ГОСТ 25706-83
Пробирки типов П1, П2		ГОСТ 25336-82
Спиртовки лабораторные стеклянные		ГОСТ 23932-90
Чашки биологические (Петри)		ГОСТ 23932-90
Воронки конусные диаметром 40-45 мм		ГОСТ 25336-82
Груша резиновая		ТУ 9398-005-0576-9082-03
Петля бактериологическая
Марля медицинская		ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая		ГОСТ 25556-81*
Бумага фильтровальная лабораторная		ГОСТ 12026-76

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

 6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

6.2. СП 1.3.2518-09. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

 7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

 8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха (20±5)°С;

- атмосферное давление (760±20) мм рт.ст.;

- влажность воздуха не более 80%.

 9. Приготовление питательных сред

Для приготовления агаризованной среды Федорова смешивают указанные компоненты: калий однозамещенный фосфорно-кислый - 0,5 г; магний серно-кислый - 0,3 г; натрия хлорид - 0,3 г; железо серно-кислое - 0,005 г; марганец серно-кислый - 0,005 г; аммоний молибденово-кислый - 0,005 г; борная кислота - 0,005 г; кальций углекислый - 3,5 г; меласса - 30,0 г; агар-агар - 17,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1000 см

дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

Смесь нагревают до растворения агара, стерилизуют автоклавированием при 121

°

С в течение 15 мин и охлаждают до 60

°.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250-500 см

и автоклавируют при 121

°

С в течение 15 мин.

Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8°С в течение 14 дней, не более.

 10. Проведение измерения

10.1. Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением 1 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и ГОСТ 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96°-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (среда Федорова) расплавляют, остужают до 50-60°C и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п.7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37°C не менее, чем на 18 ч. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2-8)°C не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (28±2)°C. Через 1-2 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред (МУК 4.2.2316-08). Для этого эталонный музейный штамм Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 высевается на 2-3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2-3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

 11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток производят по формуле:

, кл/м

,

где

К

- концентрация

Azotobacter chroococcum

ВН-1811 ВКПМ В-9029 в воздухе, кл/м

;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м

воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т - время аспирации, мин.

 12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.

Протокол N

количественного микробиологического анализа Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 в воздухе рабочей зоны

1. Дата проведения анализа

2. Рабочее место (профессия работающего)

3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора

пробы)

3.* Вид пробоотборника

4. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб

5. Питательная среда, время инкубации

6. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды

7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний)

8. Результаты идентификации микроорганизмов Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029

(морфологические признаки)

9. Результаты расчёта концентрации штамма

10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК

11. Отбор пробы произведён (Ф.И.О., должность, дата, подпись)

12. Идентификация штамма и расчёт концентрации произведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись)