Методические рекомендации МР 01.021-07 Методика экспрессного определения интегральной химической токсичности питьевых, поверхностных, грунтовых, сточных и очищенных сточных вод с помощью бактериального теста "Эколюм".

МР 01.021-07

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

 Методика экспрессного определения интегральной химической токсичности

питьевых, поверхностных, грунтовых, сточных и очищенных сточных вод

 с помощью бактериального теста "Эколюм"

1. Методические рекомендации разработаны: ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (Михайлова P.M., Ревазова Ю.А., Севостьянова Е.М.), Московским государственным университетом им. М.В.Ломоносова (Данилов B.C.), ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора (Брагина И.В, Ластенко Н.С., Федосеева Т.А).

2. С выходом настоящих методических рекомендаций утрачивают силу методические рекомендации "Методика экспрессного определения интегральной токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального теста "Эколюм" от 8 июня 2000 г. МР N 11-1/133-09.

УТВЕРЖДЕНЫ Главным врачом ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Председателем Лабораторного Совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А.И.Верещагиным 15 июня 2007 г.

 1. Назначение и область применения

Настоящий документ устанавливает методику определения интегральной химической токсичности питьевых, поверхностных пресных, грунтовых, сточных и очищенных сточных вод, атмосферных осадков в лабораторных и полевых условиях. Тест-система представлена биосенсорами серии "Эколюм" и измерительным прибором серии "Биотокс-10". Биосенсор реагирует на токсичные соединения разнообразной химической природы и смеси веществ.

Документ предназначен для учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации и специальных служб федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор.

Опасность загрязнения воды определяется уровнем ее возможного отрицательного влияния на контактирующие среды, пищевые продукты и прямо или опосредовано на человека.

Результаты обследования качества воды учитывают при определении и прогнозе степени ее опасности для здоровья и условий проживания населения в населенных пунктах, технических решений по реабилитации и охране водосборных территорий, оценке эффективности санитарно-противоэпидемических мероприятий и текущего санитарно-эпидемиологического надзора контроля над объектами, воздействующими на окружающую среду населенного пункта.

Результаты обследования качества воды учитывают при определении и прогнозе степени ее опасности для здоровья и условий проживания населения в населенных пунктах, технических решений по реабилитации и охране водосборных территорий, оценке эффективности санитарно-противоэпидемических мероприятий и текущего санитарно-эпидемиологического надзора контроля над объектами, воздействующими на окружающую среду населенного пункта.

 2. Нормативные ссылки

1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 года N 52 ФЗ в редакции Федерального закона от 22 августа 2004 года N 122 ФЗ.

2. СанПиН 2.1.5.980-2000. Санитарные правила и нормы. Гигиенические требования к охране поверхностных вод. Водоотведение населенных мест, санитарная охрана водных объектов.

3. СанПиН 2.1.4.1116-2002. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы. Питьевая вода и водоснабжение населенных мест. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества.

4. ГОСТ 17.1.1.01-77 "Охрана природы. Гидросфера. Использование и охрана вод. Основные термины и определения".

ГОСТ 17.1.5.05-85 "Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору поверхностных и морских вод, льда и атмосферных осадков".

5. ГОСТ 27065-86 "Качество вод. Термины и определения".

6. ГОСТ Р 8.563-96 ГСИ "Методики выполнения измерений".

 3. Термины и определения

Экотоксикологический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением нормативов качества окружающей среды и предупреждения попадания токсических веществ в водные объекты.

Химическое загрязнение воды - изменение химического состава воды, возникшее под прямым или косвенным воздействием производственной деятельности и вызывающее снижение ее качества, и возможную опасность для здоровья населения.

Токсичность - степень проявления ядовитого действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность - один из важных факторов, определяющих качество воды, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности воды при ее использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе воды.

Критерий токсичности (индекс токсичности) - достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности воды. Среди тест-параметров наиболее часто используются выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и метаболической активности организмов.

Тест-реакция - эти изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.

Биотестирование - проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов. Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.

Токсические эффекты, регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемой воде, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.

Биолюминесценция - интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.

 4. Принцип методики

В качестве тест-объекта используются препараты лиофилизированных люминесцентных бактерий или ферментные препараты бактериальной люциферазы. Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции биосенсора при воздействии химических веществ, присутствующих в анализируемой пробе воды, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.

При изучении токсикологических свойств водных образцов люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на животных, культуры клеток человека и другие известные биотесты.

Критерием токсического действия является измерение с помощью прибора "Биотокс-10" интенсивности биолюминесценции тест-объекта под воздействием химических соединений, содержащихся в анализируемой пробе воды по сравнению с раствором, не содержащим токсических веществ. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

 5. Количественная оценка параметров тест-реакции

Токсическое действие исследуемой пробы на тест-объект определяется по уменьшению интенсивности биолюминесценции за 30-минутный (в экспрессном варианте - 5 минут) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины - индекса токсичности "

" и функциональными токсикологическими параметрами ЕС20 и ЕС50.

Индекс токсичности "

", равный отношению

, где

и

соответственно интенсивность биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с биосенсором.

Токсикологические параметры пробы ЕС20 и ЕС50, определяемые также посредством измерения

и

, позволяют быстро и экономно выяснить вопрос, при каких объемах исходного слабо токсического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях сильно токсический образец станет нетоксичным (величины менее ЕС20). ЕС50 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация), вызывающий тушение свечение биосенсора на 50% по сравнению с контролем. В этом случае образец высоко токсичен (индекс токсичности равен 50). ЕС20 есть эффективный объем образца, (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация), который приводит к 20%-ному тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен (индекс токсичности равен 20). Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют о том, что образец не токсичен. Вычисление величин ЕС проводят с использованием гамма-функции. Гамма-функция (

) представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой

, где

и

соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте. Функция

очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец высоко токсичен. График

-функции в логарифмических координатах как функция изменения объема пробы (или концентрации отдельного вещества) есть теоретически прямая линия молекулярности реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими эти токсиканты в тест-объекте. Люминометр "Биотокс-10" позволяет представлять величины

для каждой пробы, а также автоматически вычисляет величины ЕС20 и ЕС50.

Методика предусматривает три пороговых уровня индекса токсичности:

- допустимая степень токсичности образца: индекс токсичности

меньше 20; объем пробы или концентрация вещества в пробе, меньше величины ЕС20;

- образец токсичен: индекс

равен или больше 20 и меньше 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе), меньше величины ЕС50 и больше или равен ЕС20;

- высокая токсичность образца: индекс токсичности

равен или более 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе), равен или больше величины ЕС50.

 6. Оборудование, материалы, реактивы

1. Лиофилизированная культура микроорганизмов "Эколюм" или ферментные препараты бактериальной люциферазы, ТУ 2639-236-00209792-01.

2. Прибор серии "Биотокс-10", сертификат об утверждении типа средств измерений RU.C.31,003.A N 21703, с набором кювет для измерения биолюминесценции объемом 1,5 мл;

3. Весы лабораторные общего назначения, ГОСТ 24104;

4. рН-метр, ГОСТ 25.7416.0171* или аналоги;

5. Термометр лабораторный 0-55 °С, цена деления шкалы - 0,5 °С, ГОСТ 215;

6. Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474;

7. Холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание (-18±1 °С) и хранение проб (2-4 °С);

8. Часы сигнальные, ТУ 25-07-57;

9. Подставка (из пластика, дерева) с углублением для пенициллиновых пузырьков или измерительных кювет, на которой можно разместить не менее 12 кювет;

10. Бумажные фильтры обеззоленные типа ФОБ (красная, белая ленты), ТУ 6-09-1678;

11. Пипетки автоматические дозаторы любого типа объемом 0,02-0,5 мл ±1,0%;

12. Цилиндры вместимостью 25, 50 мл второго класса точности, ГОСТ 1770;

13. Стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 10, 50 мл, ГОСТ 25336;

14. Пипетки объемом 0,5 и 1,0 мл, ГОСТ 29227;

15. Пробоотборник любого типа, объемом не менее 5 мл;

16. Флаконы и банки, стеклянные с навинчивающейся крышкой или с притертой пробкой для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 10, 50, 100 мл;

17. Воронки лабораторные, ГОСТ 25336;

18. Стаканчики для взвешивания (бюксы) диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148;

19. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709;

20. Натрия гидроокись, ГОСТ 4328;

21. Кислота соляная, ГОСТ 3118;

22. Кислота серная, ГОСТ 4204;

23. Спирт этиловый, х.ч., ТУ 6-091710;

24. Цинк сернокислый 7-водный, ГОСТ 4174;

25. Бумага индикаторная универсальная для измерения рН.

 7. Характеристика тест-объекта "Эколюм" и прибора "Биотокс-10"

Биосенсор "Эколюм" представляет собой лиофилизированные люминесцентные бактерии или бесклеточные препараты, содержащие бактериальную люциферазу. Производится в соответствии с требованиями ТУ 2639-236-00209792-01. Биосенсор находится в стеклянных флаконах в среде инертных газов. При температуре 2-4 °С и ниже имеет гарантированный срок хранения не менее 1 года.

Специализированный люминометр "Биотокс-10" является измерительным прибором, предназначенным для проведения экологического мониторинга объектов окружающей среды, с использованием биолюминесцентных биосенсоров серии "Эколюм". Сочетание биохимического датчика с современной электронной аппаратурой позволяет обнаруживать с высокой достоверностью чрезвычайно малые количества токсических соединений и их смесей. В приборе используется простая и надежная технология отбора и предъявления проб, которая безопасна при проведении экологической экспертизы, как в лабораторных, так и полевых условиях.

Портативный прибор "Биотокс-10" может осуществлять следующие функции в автоматическом режиме: определение интенсивности биолюминесценции тест-объекта, индекса токсичности пробы, и усредненной величины индекса токсичности; вычисление стандартного отклонения показателя токсичности. Прибор проводит определение величин ЕС20 и ЕС50 - пороговых значений допустимой степени и высокой степени токсичности образца; исследование динамики процесса взаимодействия токсикантов с тест-объектом, компьютерную обработку данных измерения.