ГОСТ ISO 11815-2015 Молоко. Определение общей молокосвертывающей активности говяжьего сычужного фермента.
ГОСТ ISO 11815-2015
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
МОЛОКО
Определение общей молокосвертывающей активности говяжьего сычужного фермента
Milk. Determination of total milk-clotting activity of bovine rennet
МКС 67.100.10
Дата введения 2017-01-01
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии международного стандарта, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 29 мая 2015 г. N 77-П)
За принятие проголосовали:
|
|
|
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения | AM | Минэкономики Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Казахстан | KZ | Госстандарт Республики Казахстан |
Киргизия | KG | Кыргызстандарт |
Молдова | MD | Молдова-Стандарт |
Россия | RU | Росстандарт |
Таджикистан | TJ | Таджикстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 июня 2015 г. N 625-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 11815-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.
5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 11815:2007* "Молоко. Определение общей молокосвертывающей активности говяжьего сычужного фермента" ("Milk - Determination of total milk-clotting activity of bovine rennets", IDT).
Международный стандарт разработан подкомитетом SC 5 "Молоко и молочные продукты" технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА.
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Ноябрь 2019 г.
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"
Введение
Говяжьи сычужные ферменты (телят и взрослых особей) содержат в различных количествах основные молокосвертывающие ферменты: химозин и говяжий пепсин. Каждый из этих ферментов имеет свои собственные характеристики, такие как молокосвертывающая активность и свойства, необходимые для сыроделия. Наиболее явным различием между данными ферментами является более четко выраженная зависимость молокосвертывающей активности говяжьего пепсина от величины pH. Важным является знание общей молокосвертывающей активности конкретного вида фермента, которая установлена относительно контрольного образца известного состава и известной молокосвертывающей активности, признанных на международном уровне.
Настоящий метод известен как испытание на относительную молокосвертывающую активность (акроним: REMCAT).
Количественное определение шести наиболее распространенных молокосвертывающих ферментов проводилось в соответствии с IDF 110B. Для смесей молокосвертывающих ферментов, содержащих ферменты, отличные от химозина и говяжьего пепсина, не представляется возможным проведение достоверного определения общей молокосвертывающей активности проб.
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения общей молокосвертывающей активности говяжьего сычужного фермента, который содержит только химозин и говяжий пепсин в качестве активных коагулирующих ферментов, применительно к контрольному молочному субстрату при pH=6,5.
С целью получения результатов, удовлетворяющих критериям прецизионности, при применении данного метода анализируемые пробы из неизвестного источника должны быть подвергнуты проверке на отсутствие основных молокосвертывающих ферментов неговяжьего происхождения. Для этого используется соответствующий метод (например, описанный в [1]).
Настоящий стандарт может быть применим для определения общей молокосвертывающей активности химозина, произведенного путем ферментации.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения).
ISO 648 Laboratory glassware - One-mark pipettes (Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной меткой)
ISO 1042 Laboratory glassware - One-mark volumetric flasks (Посуда лабораторная стеклянная. Мерные колбы с одной меткой)
IDF 110В:1997 Calf rennet and adult bovine rennet - Determination of chymosin and bovine pepsin contents (Chromatographic method) [Сычужный фермент теленка и сычужный фермент взрослой особи. Определение содержания химозина и говяжьего пепсина (хроматографический метод)]
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:
3.1 общая молокосвертывающая активность (total milk-clotting activity): Величина активности, установленная относительно первой партии порошкообразного международного контрольного образца сычужного фермента теленка и первой партии порошкообразного контрольного образца сычужного фермента взрослой особи (коровы или быка), соответственно.
Примечания
1 Для первой партии контрольного образца порошкообразного сычужного фермента как теленка, так и взрослой особи, активность определена на уровне 1000 Международных молокосвертывающих единиц на грамм (IMCU/г). Для последующего приготовления контрольных образцов активность будет устанавливаться относительно предыдущих контрольных образцов.
2 Общая молокосвертывающая активность порошкообразных контрольных образцов сычужных ферментов теленка и взрослой особи составляет приблизительно 1000 IMCU/г, но их точная активность приведена в акте о проведении анализа.
___________________
4 Сущность метода
5 Реактивы
Используют реактивы только признанной аналитической степени чистоты и дистиллированную или деминерализованную воду, либо воду эквивалентной чистоты.
5.1 Буферный раствор, pH=5,5
________________
Исходный раствор хлорида кальция перед использованием должен иметь температуру от 18°C до 22°C. Концентрацию раствора проверяют ежегодно путем титрования ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислотой).
Взвешивание исходного раствора хлорида кальция (5.2) проводят с целью правильного приготовления рабочего раствора, поскольку вязкий раствор с трудом отбирается пипеткой.
5.4 Молоко сухое низкотемпературного сгущения, с низким содержанием жира, подвергнутое распылительной сушке, имеющее высокое качество, а также способности реагировать на сычужные ферменты и высокое бактериологическое качество.
_________________
_________________
Точное значение общей молокосвертывающей активности указано в акте о проведении анализа. Оно должно быть равно 1000 IMCU/г.
Порошкообразный контрольный образец сычужного фермента теленка - это первичный контрольный образец. Может быть приготовлен и использован вторичный жидкий образец, если будет установлено, что обеспечивается получение аналогичных результатов.
Порошкообразный контрольный образец сычужного фермента теленка хранят в темноте при температуре минус 18°C в условиях защиты от влаги. В течение коротких периодов времени (например, при транспортировании) его допускается хранить при комнатной температуре.
_________________
Точное значение общей молокосвертывающей активности указано в акте о проведении анализа. Оно должно быть равно 1000 IMCU/г.
Порошкообразный контрольный образец сычужного фермента взрослой особи - это первичный контрольный образец. Может быть приготовлен и использован вторичный жидкий образец, если будет установлено, что обеспечивается получение аналогичных результатов.
Порошкообразный контрольный образец сычужного фермента взрослой особи хранят в темноте при температуре минус 18°C в условиях защиты от влаги. В течение коротких периодов времени (например, при транспортировании) его допускается хранить при комнатной температуре.
6 Химическая посуда, приборы и оборудование
Используют обычные химическую посуду, лабораторные приборы и оборудование и, в частности, нижеприведенные.
6.2 Пипетки с одной меткой по [2] требуемой вместимости.
В качестве альтернативы для разбавления сычужных ферментов можно использовать разбавитель (например, разбавитель Hamilton), имеющий аналогичную высокую точность. Для дозирования субстрата можно также использовать шприц или дозатор с требуемой скоростью истекания и повторяемостью 0,4%.
6.3 Колбы мерные с одной меткой по ISO 1042 требуемой вместимости.
6.4 Термометр поверенный, градуированный, с диапазоном измерения от 20°C до 45°C, с погрешностью ±0,1°C.
6.5 pH-метр, имеющий погрешность измерения ±0,01 ед. pH.
6.6 Весы аналитические с погрешностью взвешивания ±1 мг.
6.7 Секундомер с погрешностью измерения времени ±1 с.
6.8 Колбы или пробирки для проведения анализа на свертывание молока подходящей вместимости (см. 6.9.1 и 9.5.1).
6.9 Баня водяная с терморегулятором, обеспечивающая поддержание температуры (32,0±0,2)°C.
Водяная баня должна быть оснащена нижеперечисленными приспособлениями:
6.9.1 Мотор электрический с вращающимся валом, к которому можно прикреплять колбы или пробирки (6.8). Вал должен вращаться под углом примерно 30° по отношению к поверхности воды в водяной бане.
Примечание - В настоящем методе скорость вращения не является важным фактором. Приемлемая скорость вращения - от 2 до 4 оборотов в минуту.
6.9.2 Лампа электрическая, эффективно освещающая колбу или пробирку (6.8).
С целью облегчения определения момента коагуляции в колбе или пробирке, связанного со свертыванием молока, можно использовать экран с темным фоном, помещенный в водяную баню.
7 Отбор проб
В лабораторию необходимо доставить представительную пробу. Она не должна быть повреждена или изменена в процессе транспортирования или хранения.
Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуемые методы отбора проб приведены: для жидких сычужных ферментов (8.1) - в [1], раздел 9, для порошкообразных сычужных ферментов (8.2) - в [1], раздел 13.
Анализируемые пробы хранят в темноте при температуре от 0°C до 5°C.
8 Приготовление анализируемой пробы
8.1 Жидкий сычужный фермент
Анализируемую пробу перемешивают путем взбалтывания, не допуская образования пены. Перед приготовлением анализируемого раствора сычужного фермента (9.4) температуру пробы доводят до 18°C-22°C.
Жидкий сычужный фермент - вязкий. При отборе пробы пипеткой следует использовать правильную технику отбора. Для концентрированных сычужных ферментов точные разбавления получают посредством взвешивания проб на аналитических весах и расчета их объема (в кубических сантиметрах) путем деления массы на плотность используемого сычужного фермента.
8.2 Порошкообразный сычужный фермент
Анализируемую пробу тщательно перемешивают с целью получения однородного порошка. Перед приготовлением анализируемого раствора сычужного фермента (9.4) температуру пробы доводят до 18°C-22°C.
Примечания
1 Следует принять во внимание, что порошкообразные продукты могут легко расслаиваться.
2 Следует принять во внимание количество отбираемой пробы. Как правило, пробы массой от 3 до 5 г являются достаточными, однако в случаях, когда анализируют неоднородные пробы или требуется получение весьма точных результатов, для анализа используют пробы большего объема (например, 10 г).
9 Проведение анализа
Анализ проб и контрольных образцов проводят при идентичных химических и физических условиях.
Следует учесть, что различия в условиях, которые могут повлиять на процесс свертывания, такие как значение pH, буферность раствора или концентрация соли в разведенном сычужном ферменте, могут привести к получению результатов с заметными отклонениями.
9.1 Приготовление субстрата
Субстрат выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.
Субстрат хранят при комнатной температуре не более 4 ч или в холодильнике в течение 24 ч.
Значение pH приготовленного субстрата не регулируют, оно должно составлять 6,50 ед. рН.
9.2 Приготовление растворов контрольных образцов сычужных ферментов
9.2.1 Раствор контрольного образца сычужного фермента теленка
Во избежание попадания влаги до открытия пакетика с порошкообразным контрольным образцом сычужного фермента теленка (5.5) доводят его температуру до 18°C-22°C.
9.2.2 Раствор контрольного образца сычужного фермента взрослой особи
Раствор готовят в соответствии с 9.2.1, используя вместо порошкообразного контрольного образца сычужного фермента теленка (5.5) порошкообразный контрольный образец сычужного фермента взрослой особи (5.6).
9.3 Приготовление рабочих растворов контрольных образцов сычужных ферментов теленка и взрослой особи
9.3.1 Рабочий раствор контрольного образца сычужного фермента теленка
При этом коэффициент разбавления равен 333,33. Время свертывания молока под действием рабочего раствора контрольного образца сычужного фермента теленка должно быть в диапазоне от 350 с до 550 с.
Хранят рабочий раствор контрольного образца сычужного фермента теленка при комнатной температуре в течение 24 ч. Допускается хранить рабочий раствор при температуре от 0°C до 5°C в течение 2 сут.
9.3.2 Рабочий раствор контрольного образца сычужного фермента взрослой особи
Раствор готовят в соответствии с 9.3.1, используя вместо раствора контрольного образца сычужного фермента теленка (9.2.1) раствор контрольного образца сычужного фермента взрослой особи (9.2.2).
Коэффициент разбавления будет равен 333,33. Время свертывания молока под действием рабочего раствора контрольного образца сычужного фермента взрослой особи должно быть в диапазоне от 350 с до 550 с.
Приготовленный рабочий раствор контрольного образца сычужного фермента взрослой особи хранят при комнатной температуре в течение 24 ч. Допускается хранить рабочий раствор при температуре от 0°C до 5°C в течение 2 сут.
9.4 Приготовление анализируемого раствора сычужного фермента
9.5 Свертывание
При появлении первых признаков коагуляции (появление хлопьев) в пленке субстрата на стенках колбы или пробирки регистрируют время свертывания по секундомеру.
С целью соблюдения идентичных условий, анализируемые пробы говяжьих сычужных ферментов в бане помещают как можно ближе к контрольным пробам. Поскольку данный метод представляет собой сравнительный анализ, весьма важным является поддержание одинаковой температуры при осуществлении процесса свертывания для анализируемых и контрольных проб. С целью соблюдения данного условия температуру внутри водяной бани проверяют, измеряя температуру проб с молоком в различных точках бани. Если допустимые колебания температуры ±0,2°C (см. 6.9) превышены, необходимо усовершенствовать конструкцию водяной бани или систему циркуляции в ней воды.
9.5.2 Согласно 9.5.1 сразу же проводят определение продолжительности свертывания субстрата анализируемым раствором сычужного фермента (9.4), затем проводят анализ, используя рабочий раствор контрольного образца сычужного фермента взрослой особи (9.3.2).
9.5.3 Проводят два параллельных определения. Рассчитывают среднеарифметические значения времени свертывания для рабочих растворов контрольных образцов сычужного фермента теленка и взрослой особи, соответственно, а затем - для анализируемого раствора сычужного фермента.
10 Расчет и выражение результатов
10.1 Расчет
Далее проводят окончательный расчет общей молокосвертывающей активности путем интерполирования (см. 10.1.2), выраженной в Международных молокосвертывающих единицах (IMCU) на грамм или на кубический сантиметр.
10.1.1 Расчет молокосвертывающей активности относительно порошкообразного контрольного образца сычужного фермента теленка
d - конечное значение коэффициента разбавления, полученное для анализируемого раствора (9.4);
10.1.2 Окончательный расчет общей молокосвертывающей активности путем интерполирования
__________________
10.2 Выражение результатов
Результаты выражают в Международных молокосвертывающих единицах (IMCU) на грамм или на кубический сантиметр, округляя до ближайшего целого числа.
11 Прецизионность
11.1 Межлабораторные испытания
Данные межлабораторных испытаний, касающиеся прецизионности метода, опубликованы [3], [4]. Значения, полученные в ходе данных межлабораторных испытаний, могут быть не применимы к диапазонам концентраций и матрицам, отличным от приведенных.
Значения повторяемости и воспроизводимости основаны на стандартных отклонениях, которые являются оценкой истинного стандартного отклонения значений в данном методе. Если в конечном итоге получены значения, которые существенно меньше, чем в 95% случаев, соответствуют приведенным в 11.2 и 11.3, рекомендуется усовершенствовать процедуру выполнения анализа.
При анализе порошкообразных сычужных ферментов выраженные в процентах значения упомянутых выше параметров прецизионности (повторяемости и воспроизводимости) могут быть немного завышены из-за некоторых различий в растворимости и определенной степени неоднородности порошкообразных сычужных ферментов.
11.2 Повторяемость
Коэффициент вариации повторяемости CV(r), который выражает вариабельность независимых результатов, полученных одним и тем же оператором, при использовании одного и того же оборудования, при одних и тех же условиях и на одной и той же анализируемой пробе, в течение короткого интервала времени, должен не более чем в 5% случаев превышать для жидких сычужных ферментов 1,8% относительно среднеарифметического значения результатов анализа.
11.3 Воспроизводимость
Коэффициент вариации воспроизводимости CV(R), который выражает вариабельность независимых результатов, полученных операторами в разных лабораториях, при использовании разного оборудования, в разных условиях и на одной и той же анализируемой пробе, должен не более чем в 5% случаев превышать для жидких сычужных ферментов 3,5% относительно среднеарифметического значения результатов анализа.
Примечание - Значения параметров прецизионности являются действительными при участии большого количества лабораторий. Практика показала, что высококвалифицированные лаборатории способны проводить анализ, при котором уровень воспроизводимости между лабораториями составляет 2%.
12 Протокол анализа
Протокол анализа должен включать:
а) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы, в том числе сведения о ее фазовом состоянии (жидкая или порошкообразная);
b) метод отбора проб, если он известен;
c) ссылку на настоящий стандарт;
d) все подробности проведения анализа, не установленные в настоящем стандарте, или рассматриваемые как необязательные, вместе со всеми деталями описания любых факторов, которые могли повлиять на результаты;
e) полученные результаты анализа и, в случае проверки повторяемости, окончательные зарегистрированные результаты.
Приложение A
(справочное)
Межлабораторные испытания
А.1 Общие положения
Международные совместные испытания, включающие 13 лабораторий из девяти стран, проводились с использованием трех различных партий жидких говяжьих сычужных ферментов, каждая из которых была разведена для получения проб с двумя различными уровнями активности. Шесть проб, полученных таким образом, были разделены на 12 необозначенных проб-дубликатов. Результаты анализа были подвергнуты статистической обработке в соответствии с [2], и полученные результаты были опубликованы [3], [4].
А.2 Пробы жидких сычужных ферментов
Результаты, приведенные ниже, получены на основе вторичных межлабораторных испытаний, проведенных в 1990 г. Из результатов, приведенных в таблице А.1, исключены результаты лаборатории 3 для проб 9/12 и лаборатории 5 для проб 2/5 по причине несоответствия условиям воспроизводимости [4].
Таблица А.1 - Результаты межлабораторных испытаний
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Проба | Соотно- шение химозин: пепсин | Среднеариф- метическое значение, IMCU/см | CV(r), % | r | r , % | CV(R), % | R | R , % | Резко отклоняю- щиеся значения |
1/4 | 90:10 | 195,8 | 2,69 | 14,7 | 7,5 | 3,71 | 20,4 | 10,4 | Grubbs |
8/11 | 48:52 | 180,7 | 1,75 | 8,9 | 4,9 | 3,74 | 18,9 | 10,5 | Grubbs |
3/6 | 9:91 | 213,8 | 2,57 | 15,4 | 7,2 | 3,79 | 22,7 | 10,6 | Grubbs |
7/10 | 90:10 | 160,1 | 0,94 | 4,2 | 2,6 | 1,99 | 8,9 | 5,6 | Grubbs |
2/5 | 48:52 | 128,0 | 1,56 | 5,6 | 4,3 | 3,54 | 12,7 | 9,9 | Grubbs |
9/12 | 9:91 | 197,7 | 1,07 | 5,9 | 3,0 | 4,03 | 22,3 | 11,3 | Grubbs |
Средне- арифмети- ческое значение | - | - | 1,8 | - | 4,9 | 3,5 | - | 9,7 | - |
Библиография
|
|
[1] | ISO 707|IDF 50:1997 Milk and milk products - Guidance on sampling |
[2] | ISO 5725:1986 Precision of test methods; Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests |
_________________ В настоящее время опубликован в нескольких частях. | |
[3] | Глава 10: Сычужные ферменты, содержащие химозин и говяжий пепсин. Определение общей молокосвертывающей активности. Bull. IDF (285), 1993 |
[4] | Глава 11: Химозин и пепсин в говяжьих сычужных ферментах. Определение общей молокосвертывающей активности при pH 6,5. Испытание на относительную молокосвертывающую активность (REMCAT). Bull. IDF (285), 1993 |
Приложение ДА
(справочное)
Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов межгосударственным стандартам
Таблица ДА.1
|
|
|
Обозначение международного стандарта | Степень соответствия | Обозначение и наименование межгосударственного стандарта |
ISO 648 | - | * |
ISO 1042 | - | * |
IDF 110B:1997 | - | * |
* Соответствующий межгосударственный стандарт отсутствует. До его принятия рекомендуется использовать перевод на русский язык данного международного стандарта.
| ||
|
|
|
УДК 637.1:006.354 |
| МКС 67.100.10 |
Ключевые слова: молоко, свертывание молока, молокосвертывающая активность, говяжий сычужный фермент, коагуляция, молочный субстрат, контрольный образец, химозин, говяжий пепсин | ||