ГОСТ Р ИСО 16140-2008 Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов.
ГОСТ Р ИСО 16140-2008
Группа Н19
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МИКРОБИОЛОГИЯ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ
Протокол валидации альтернативных методов
Microbiology of food and animal feeding stuffs. Protocol for the validation of alternative methods
ОКС 07.100.30
ОКСТУ 9109
Дата введения 2010-01-01
Предисловие
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности имени В.М.Горбатова" Российской Академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМП им. В.М.Горбатова Россельхозакадемии) на основе собственного аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 декабря 2008 г. N 589-ст
4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 16140:2003 "Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов" (ISO 16140:2003 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Protocol for the validation of alternative methods").
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты Российской Федерации, сведения о которых приведены в дополнительном приложении V
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет
Введение
Необходимость быстрой оценки микробиологического качества сырья и готовых продуктов, а также микробиологического статуса производственных процессов в пищевой промышленности привела к разработке и усовершенствованию альтернативных методов микробиологического анализа, которые быстрее и/или проще в осуществлении, чем соответствующий стандартный метод, и некоторые из них можно автоматизировать.
Среди альтернативных методов есть такие, которые могут давать результаты, эквивалентные результатам стандартного метода, а результаты других могут заметно отличаться.
Поставщики и разработчики альтернативных методов, производители пищевых продуктов и напитков, службы здравоохранения и другие органы нуждаются в надежном общем протоколе валидации подобных альтернативных методов. Полученные данные могут также стать основой для сертификации метода независимой организацией.
Из-за большого числа методов, использованных лабораторией-организатором в сравнительном исследовании, представленном в настоящем стандарте, процедура не всегда подходит для "внутреннего" метода валидации альтернативного метода, применяемого отдельной лабораторией.
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает основной принцип и технический протокол валидации альтернативных методов в сфере микробиологического анализа пищевых продуктов, кормов для животных, образцов окружающей среды и ветеринарных образцов (см. 5.1.1.2.1) для:
- валидации альтернативных методов, которые можно использовать, в частности, в рамках официального контроля;
- международного признания результатов, полученных альтернативным методом.
Настоящий стандарт также устанавливает основные принципы сертификации альтернативных методов, основанные на протоколе валидации, определенном в 4.1.
В тех случаях, когда альтернативный метод применяется на постоянной основе для внутрилабораторного использования и не требуется соответствие (более высоким) сторонним критериям контроля качества, может оказаться достаточной менее строгая сравнительная валидация альтернативного метода.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
_______________
ISO 3534-1:1993 Statistics - Vocabulary and symbols - Part 1: General statistical terms and terms used in probability
ИСО 5725 (все части) Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений
ISO 5725 (all parts) Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results
_______________
ISO 9001:2000 Quality management systems - Requirements
ИСО 11095-1996 Статистические методы. Линейная калибровка с использованием образцов сравнения
ISO 11095:1996 Linear calibration using reference materials
_______________
ISO/TS 11133-1:2000 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory
_______________
ISO/IEC 17025:2001 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 альтернативный метод (alternative): Метод анализа, обеспечивающий для продуктов данной категории обнаружение или оценку такого же аналита (3.4), какой измеряют с помощью соответствующего стандартного метода (3.2).
Примечание 1 - Метод может быть патентованным или некоммерческим и необязательно должен включать всю процедуру анализа от приготовления образцов до отчета об испытании.
Примечание 2 - Альтернативный метод должен обладать качествами, соответствующими нуждам пользователя, например:
- быстродействие проведения анализа и/или получения результата;
- простота выполнения и/или автоматизации;
- аналитические качества (прецизионность, точность, предел обнаружения и т.д.);
- миниатюризация;
- снижение затрат.
Примечание 3 - Термин "альтернативный" применяется для общего обозначения "процедуры испытания и реакционной системы". Этот термин включает в себя все компоненты - материальные и иные, необходимые для реализации метода.
3.2 стандартный метод (reference): Принятый на международном уровне и широко применяемый метод.
Примечание - В настоящем стандарте под стандартным методом подразумеваются международные и европейские стандарты, а в случае их отсутствия - подходящие национальные стандарты эквивалентного статуса.
3.3 валидация альтернативного метода (validation of an alternative method): Процедура подтверждения соответствия того, что результаты, полученные альтернативным методом, сравнимы с результатами, полученными стандартным методом.
Примечание - Термин "сравнимы" определяется в настоящем стандарте техническим протоколом, адаптированным для метода каждого типа (см. разделы 5 и 6).
3.4 аналит (analyte): Компонент, измеряемый данным методом анализа. Это может быть микроорганизм.
3.5 качественный метод (qualitative method): Метод анализа, результатом которого является установление наличия или отсутствия аналита (3.4), обнаруживаемого прямо или косвенно в определенном количестве образца.
3.6 количественный метод (quantitative method): Метод анализа, результатом которого является количество аналита (3.4), измеренное прямо (подсчет по массе или объему) или косвенно (поглощение цвета, импеданс и т.д.) в определенном количестве образца.
3.7 сравнительное исследование методов (methods comparison study): Исследование, проводимое лабораторией-организатором, целью которого является сравнение альтернативного метода со стандартным методом.
3.8 межлабораторное исследование (inter-laboratory study): Исследование рабочих характеристик метода с использованием одних и тех же образцов в нескольких лабораториях под контролем лаборатории-организатора.
3.9 лаборатория-организатор (organising laboratory): Лаборатория с квалифицированными сотрудниками, имеющими опыт проведения сравнительного исследования и организации межлабораторного исследования.
Примечание - Для анализа результатов необходимо участие квалифицированного специалиста по статистическим исследованиям.
4 Общие принципы валидации и сертификации альтернативных методов
4.1 Протокол валидации
Протокол валидации включает в себя два этапа:
- сравнительное исследование (3.7) альтернативного (3.1) и стандартного (3.2) методов в лаборатории-организаторе;
- межлабораторное исследование (3.8) каждого из двух методов.
Если это возможно, оба этапа проводят параллельно.
Технические правила проведения сравнительного исследования методов и межлабораторного исследования представлены в разделах 5 и 6 соответственно, в зависимости от того, является ли альтернативный метод качественным или количественным.
Если альтернативный метод прошел валидацию и соответствует требованиям другой организации, то для процедуры признания таких результатов предусмотрены специальные правила, приведенные в приложении А.
4.2 Принципы сертификации
4.2.1 При последующей сертификации альтернативного метода применяют (в дополнение к 4.1) два следующих принципа:
Подробные сведения о проведении сертификации (управление сравнительным исследованием методов и межлабораторным исследованием, перечень организаций, участвующих в процессе, включая экспертную лабораторию, называемую в настоящем стандарте "лабораторией-организатором", и приглашенных экспертов, сертифицирующий орган и т.д.) предоставляются сертифицирующим органом.
4.2.2 Изготовитель должен использовать систему качества, охватывающую весь ряд продукции, подлежащей сертификации, и основанную на соответствующем стандарте, относящемся к системам качества (ИСО 9001).
При выдаче сертификата сертифицирующая организация должна учитывать наличие сертификата системы качества, выданного сертифицирующим органом, аккредитованным в сфере систем качества.
4.2.3 После выдачи сертификата должна проводиться регулярная проверка качества сертифицированного метода. Должен регулярно проводиться аудит для установления соответствия:
- требованиям обеспечения качества (см. 4.2.1);
- требованиям контроля производства продукции (см. 4.2.1).
В дополнение к общим требованиям системы качества изготовитель регулярно предъявляет сертифицирующей организации обновленную документацию, учитывающую все изменения, внесенные в продукт или в процесс производства, которые могут отразиться на инструкциях по использованию метода и/или на рабочих характеристиках метода. После этого сертифицирующая организация решает, влияют ли внесенные изменения на результаты сертификации.
5 Качественные методы. Технический протокол валидации
5.1 Сравнительное исследование методов
5.1.1 Относительная точность, относительная специфичность и относительная чувствительность
5.1.1.1 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
_______________
Примечание - Термин "относительная точность", используемый в настоящем стандарте, является дополнительным к терминам "точность" и "правильность", как они определены в ИСО 5725-1 и в ИСО 3534-1. В этих стандартах указывается, что точность - это "степень близости результата испытания и принятого опорного значения", и что правильность - это "степень близости среднего значения большого числа результатов испытания и принятого опорного значения". В настоящем стандарте в качестве принятого опорного значения выбрано значение, получаемое стандартным методом. Таким образом, термин "относительный" указывает на то, что стандартный метод автоматически не дает принятое опорное значение.
5.1.1.1.2 положительное отклонение (PD) (positive deviation): Альтернативный метод "ложноположителен", когда он показывает положительное отклонение (т.е. получен положительный результат), в то время как стандартный метод дает отрицательный результат.
Положительное отклонение становится ложноположительным результатом, когда можно доказать, что истинный результат отрицателен.
Положительное отклонение считается "истинно положительным", когда можно доказать, что истинный результат положителен.
5.1.1.1.3 отрицательное отклонение (ND) (negative deviation): Альтернативный метод показывает отрицательное отклонение (т.е. получен отрицательный результат), в то время как стандартный метод дает положительный результат.
Отрицательное отклонение считается "ложноотрицательным", когда можно доказать, что истинный результат положителен.
5.1.1.1.4 относительная чувствительность (SE) (relative sensitivity): Способность альтернативного метода обнаруживать аналит, когда его обнаруживает стандартный метод (см. 5.1.1.3.1).
5.1.1.1.5 относительная специфичность (SP) (relative specificity): Способность альтернативного метода не обнаруживать микроорганизм тогда же, когда его не обнаруживает стандартный метод (см. 5.1.1.3.1).
5.1.1.2 Протокол измерений
5.1.1.2.1 Образцы пищевых продуктов
Для оценки чрезвычайно важно отобрать образцы пищевых продуктов, естественно контаминированные аналитом, подлежащим обнаружению при валидации.
Если метод нужно оценить для всех пищевых продуктов, то нужно изучить пять категорий пищевых продуктов. По просьбе изготовителя это число категорий можно снизить до одной, двух, трех или четырех, если валидация альтернативного метода ограничена такими указанными категориями. Рекомендованные категории перечислены в приложении В.
Подходящие образцы окружающей среды также могут быть включены в качестве одной из категорий. Ветеринарные образцы можно считать еще одной категорией (см. приложение В).
Желательно, чтобы образцы пищевых продуктов происходили из как можно более широкой зоны распространения для уменьшения искажения, связанного со спецификой местной пищи, и для расширения диапазона валидации.
При анализе естественно контаминированных образцов диапазон и распределение контаминации образцов должны представлять все уровни, обычно присутствующие в этих продуктах, с упором на меньшее значение.
Если невозможно получить достаточное количество естественно контаминированных пищевых продуктов каждой категории, то допустимо использование искусственно контаминированных образцов. Метод и уровни искусственной контаминации должны обеспечивать подобие характеристик полученных образцов характеристикам естественно контаминированных образцов (см. методы инокуляции и ограничения в приложении С).
5.1.1.2.2 Число образцов
Суммарное число испытательных подобразцов для анализа равно 60 для каждой пищевой категории, выбранной из списка, приведенного в приложении В. Внутри каждой категории выбирают представительные типы пищевых продуктов и анализируют 20 испытательных подобразцов пищевого продукта каждого типа предлагаемым методом и стандартным методом для получения минимум 60 результатов для каждой категории каждым методом. Для естественно контаминированных типов пищевых продуктов готовят образец, как описано в приложении D. Для искусственно контаминированных типов пищевых продуктов подстраивают уровни инокуляции таким образом, чтобы достичь частичного положительного выделения микроорганизмов в анализируемых испытательных подобразцах хотя бы одним из методов. Частичное выделение микроорганизмов достигается, когда в некотором числе, но не во всех испытательных подобразцах обнаруживается положительный результат одним или обоими методами, альтернативным или стандартным.
Желательно получить примерно 50% положительных результатов и 50% отрицательных. Это рекомендация, а не абсолютно требуемое процентное соотношение, при условии, что некоторое число испытательных подобразцов "положительно", а часть - "отрицательны" для одного и того же типа пищевого продукта.
5.1.1.2.3 Приготовление испытательных образцов
Стандартный и альтернативный методы должны быть проведены, насколько это возможно, на одном и том же образце.
Так, если первая стадия обоих методов одинакова (например тот же самый предварительно обогащенный бульон), то проводят репликацию на второй стадии (приложение D, случай 1).
В случае, когда первоначальная культуральная среда, методология или растворы различаются, готовят парные испытательные подобразцы для анализа. Имеются два основных метода для таких процедур приготовления.
В первом случае смешивают двойную навеску образца с равной по массе или объему навеской стерильной воды или другого подходящего разбавителя и тщательно гомогенизируют. Затем разделяют ее на два подобразца, обращая особое внимание на увеличение концентрации первичного обогащения примерно на 10% для компенсации эффекта разбавления разбавленного гомогенизированного образца (приложение D, случай 2).
Во втором случае непосредственно засевают образец пищевого продукта начальным посевным материалом в количестве, достаточном для получения частичного выделения микроорганизмов из анализируемых испытательных подобразцов хотя бы одним методом после того, как микроорганизмы пришли в состояние равновесия в образце пищевого продукта. Потом приготовляют испытательные подобразцы массой 25 г и процедуру продолжают так, как описано в приложении D. Такая процедура предпочтительна для жидких продуктов, но может быть применима и для пищевого продукта любого типа при условии, что пищевой продукт тщательно гомогенизирован.
5.1.1.3 Вычисления и интерпретация результатов
5.1.1.3.1 Обработка данных
Парные данные стандартного и альтернативного методов заносят в таблицу и вычисляют следующие параметры для каждой категории пищевого продукта (60 образцов), как указано в таблице 1.
Таблица 1 - Парные результаты стандартного и альтернативного методов
|
|
|
Результаты | Стандартный метод положителен (  ) | Стандартный метод отрицателен (  ) |
Альтернативный метод положителен (  ) | +/+ положительное согласование (  ) | -/+ положительное отклонение (  ) |
Альтернативный метод отрицателен (  ) | +/- отрицательное отклонение (  ) (  ) | -/- отрицательное согласование (  ) |
Вычисления должны проводиться на ряде отрицательных результатов, полученных стандартным методом, число которых для результатов из таблицы 1 не может превышать удвоенное число положительных результатов. При необходимости, можно выбирать отрицательные результаты, непосредственно следующие за положительным результатом в порядке анализа образцов.
Используются три следующих критерия:
Относительная точность:
Относительная специфичность:
Относительная чувствительность:
5.1.1.3.2 Доверительные интервалы
Вычисление доверительных интервалов, связанных с числом испытанных образцов, приведено в приложении Е.
5.1.1.3.3 Несовпадающие результаты
5.1.1.3.4 Сводка вычислений
Все вычисления должны быть представлены в форме таблицы 2.
Таблица 2 - Вычисление относительной точности, относительной чувствительности и относительной специфичности
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Матрицы | | | | | Сумма | Относительная точность  (%) | | Относи- тельная чувстви- тельность  (%) | | Относи- тельная специ- фичность  (%) |
|
|
|
|
| |  | |  | |  |
Пищевая категория 1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Пищевая категория 2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Пищевая категория 3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Пищевая категория 4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Пищевая категория 5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ВСЕГО |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
5.1.1.3.5 Интерпретация результатов
Нужно сформировать таблицу, включающую необработанные результаты (то есть все положительные и отрицательные результаты из таблицы 1).
На основании числа положительных отклонений и числа отрицательных отклонений, оценивают возможность альтернативного метода получать большее или меньшее число истинно положительных результатов, чем стандартным методом.
В отчете об исследовании результаты, полученные с естественно контаминированными и искусственно контаминированными образцами, должны быть представлены раздельно.
Процедура искусственной контаминации испытательных образцов должна быть описана в отчете об исследовании.
Данные, опубликованные в других источниках и соответствующие условиям, указанным в приложении А, можно использовать для оценки относительной точности.
5.1.2 Относительный уровень обнаружения
5.1.2.1 Определение
В рамках настоящего стандарта под относительным уровнем обнаружения понимают наименьшее число культивируемых микроорганизмов (3.4), которое может быть обнаружено в образце в 50% случаев альтернативным и стандартным методами.
5.1.2.2 Протокол измерений
Испытание проводят следующим образом:
- используют один пищевой продукт из каждой пищевой категории, выбранной по 5.1.1.2.1, с учетом области применения валидации (см. приложение В);
- используют пять разных целевых микроорганизмов (или меньше, с учетом области применения валидации), каждый из которых предназначен для одной пищевой категории, если это возможно (определение целевых микроорганизмов приведено в приложении G);
- предпочтительно проводят испытания для пяти уровней (но минимум для трех уровней) по одному целевому микроорганизму на каждый пищевой продукт, включая отрицательный контрольный образец и т.д. Первым уровнем должен служить отрицательный контрольный образец. Вторым уровнем должен быть теоретический уровень обнаружения. Третий уровень - немного выше теоретического порога обнаружения, и все последующие уровни должны быть выше предыдущего. Можно использовать последовательные верхние уровни с концентрациями, разнящимися множителем, приблизительно равным 3;
- воспроизводят каждую комбинацию (пищевой продукт, уровень контаминации) шесть раз для испытания и альтернативным, и стандартным методами. Проводят разделение на уровне, где методы отличаются, как показано в приложении D. Таким образом, если этап 1 обоих методов одинаков (например, тот же предварительно обогащенный бульон), проводят разделение на этапе 2 (см. приложение D, случай 1). Если первый этап неодинаков, то есть культуральная среда, методология или степень разведения различаются, то смешивают удвоенную массу образца с равным по массе или объему количеством стерильной воды или другого подходящего разбавителя, а потом разделяют на два подобразца;
- используют полную процедуру альтернативного и стандартного методов, включая подготовку образца. Засев каждого пищевого образца можно проводить до или после добавления культуральной среды.
Если нужно, то для обеспечения лучшей прецизионности на самом нижнем уровне посевного материала увеличивают массу пищевого образца или число реплик образцов. Например, можно использовать 75 г пищевого образца, контаминированного тремя клетками, вместо 25 г образца, контаминированного одной клеткой.
Чем больше число использованных уровней засева, тем точнее определение порога обнаружения.
5.1.2.3 Вычисления
Таблица 3 - Вычисление относительного уровня обнаружения
|
|
|
|
Метод | Результаты | ||
| Отрицательные (-) | Положительные (+) | Всего |
Стандартный |  |  |  6 |
Альтернативный |  |  | 6 |
Всего |  |  |  |
Для таблиц малого размера 2x2 использовать точные критерии Фишера.
5.1.2.4 Сравнения
Чтобы не проводить сравнение обоих методов на каждом уровне и для каждого продукта и штамма, можно использовать одно и то же испытание при сравнении двух продуктов/штаммов на одном и том же уровне.
В отчете указать все существенные различия между методами, продуктам/штаммами и/или уровнями.
5.1.2.5 Интерпретация результатов
Интерпретацию проводит лаборатория-организатор, на которую возложена ответственность за изучение методов сравнения.
Относительный уровень обнаружения лежит между двумя уровнями контаминирования, дающими, соответственно, уровень обнаружения менее и более 50%. Поэтому относительный уровень обнаружения представляют диапазоном.
5.1.3 Инклюзивность и эксклюзивность
5.1.3.1 Определение
Инклюзивность - это способность обнаружения с помощью альтернативного метода целевого аналита в широком диапазоне штаммов.
Эксклюзивность - это отсутствие интерференции от уместного для альтернативного метода диапазона нецелевых штаммов.
5.1.3.2 Протокол измерений
5.1.3.2.1 Выбор испытательных штаммов
5.1.3.2.1.1 Общие требования
Для устранения локальных отклонений используют диапазон микроорганизмов или штаммов.
Критерии для выбора испытательных штаммов приведены в приложении G.
Для каждого штамма должны быть приведены биохимические, серологические, а если уместно, то и генетические характеристики, подробные в степени, достаточной для установления их идентичности, и предпочтительно, чтобы штамм был изолирован от продукта. Кроме того, материал продукта, из которого он был выделен первоначально, должен быть известен и документирован.
5.1.3.2.1.2 Целевые микроорганизмы
Выбирают не менее 50 чистых культур микроорганизмов, подходящих для альтернативного метода и используемого пищевого продукта (см. G.3), за исключением случая Salmonella (сальмонеллы).
В случае методов для Salmonella выбирают не менее 30 чистых культур или микроорганизмов.
5.1.3.2.1.3 Нецелевые микроорганизмы
Выбирают не менее 30 чистых культур микроорганизмов из числа тех штаммов, что заведомо приводят к интерференции с целевыми микроорганизмами, и из числа штаммов, естественно содержащихся в каждом материале испытуемого продукта, включенного в валидацию (см. G.4).
5.1.3.2.2 Инокуляция
5.1.3.2.2.1 Общие требования
Каждое испытание проводится однократно. Засев питательной среды проводят с помощью разбавления чистой культуры каждого испытательного штамма. Образец продукта не добавляют.
5.1.3.2.2.2 Целевые микроорганизмы
Уровень засеваемой культуры должен быть в 10-100 раз больше минимального относительного уровня обнаружения для альтернативного метода. При этом нужно использовать полный протокол альтернативного метода, включая, если это необходимо, предварительное обогащение. В случае получения ложноотрицательных или сомнительных результатов, штаммы нужно испытать повторно с привлечением стандартного метода.
5.1.3.2.2.3 Нецелевые микроорганизмы
Уровень засеваемой культуры должен быть близок к наибольшему уровню контаминации, который ожидают обнаружить во всех категориях используемых продуктов.
Необходимо установить наличие эксклюзивности. Если конечная питательная среда культуральной среды представляет собой избирательную жидкую питательную среду (бульон), то такую среду заменяют на подходящую неизбирательную жидкую питательную среду. Если альтернативный метод дает положительные или сомнительные результаты с нецелевыми микроорганизмами, то испытание повторяют с использованием полного протокола. Измерения стандартным методом проводят только один раз.
5.1.3.3 Представление результатов
Результаты представляют в виде таблицы 4.
Таблица 4 - Представление результатов по избирательности
|
|
|
|
|
Микроорганизмы | Результаты | |||
| Стандартный метод | Альтернативный метод | ||
| Ожидаемый результат | Действительный результат | Ожидаемый результат | Действительный результат |
Целевые штаммы |
|
|
|
|
1 |
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
1 |
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
и т.д. |
|
|
|
|
5.1.3.4 Интерпретация результатов
Интерпретацию проводит лаборатория, на которую возложена ответственность за сравнительное изучение методов, причем в расчет должны приниматься как количественные, так и качественные аспекты (т.е. болезнетворность, распространенность, культуральные аспекты испытательных штаммов, например, подвижность, чувствительность к неблагоприятным факторам и т.д.).
Другие опубликованные данные по альтернативному методу, удовлетворяющие требованиям настоящего стандарта, также могут быть использованы лабораторией, отвечающей за сравнительное изучение методов, для получения дополнительной информации о вышеупомянутых критериях (см. приложение А, содержащее критерии признания сторонних результатов).
5.2 Межлабораторное исследование
Целью межлабораторного исследования является установление изменчивости результатов, полученных разными лабораториями при использовании идентичных образцов, и сравнение этих результатов с результатами, полученными при сравнительном исследовании методов.
5.2.1 Протокол измерений
5.2.1.1 Межлабораторное исследование должно включать в себя минимум 10 сотрудничающих лабораторий, результаты которых не содержат выбросов.
Указания и требования по организации, координации и проведению межлабораторных исследований приведены в приложении Н.
Необходимо, чтобы специалист по анализу результатов из каждой сотрудничающей лаборатории проявил достаточную компетентность в применении альтернативного и стандартного методов до участия в самом исследовании.
5.2.1.2 Протокол включает следующие требования:
- для приготовления испытательных образцов используют одну подходящую пищевую матрицу (приложение В);
- протокол искусственной контаминации пищевого образца должен соответствовать выбранному пищевому субстрату. Каждый образец должен быть засеян индивидуально. Каждая "слепая" копия (реплика) должна быть приготовлена так, чтобы гарантировать гомогенность образцов при индивидуальном засеве каждой копии. Для установления гомогенности необходимо проанализировать соответствующее число образцов (см. приложение Н);
- каждая сотрудничающая лаборатория должна проанализировать, по меньшей мере, 8 "слепых" копий на каждом уровне контаминации стандартным и альтернативным методами;
- для анализа готовят суспензию из каждого образца;
- анализ образцов должен быть проведен в каждой лаборатории в установленный день;
- исследуемые образцы культивируют в соответствии с приложением J. Так, если первый этап культивирования одинаков и для стандартного, и для альтернативного методов, то эту культуру используют для засева на каждом из последующих этапов (приложение J, случай 1). Если первичные культуры для каждого метода различны, то соответствующие реплики используют для индивидуального выполнения каждого метода (приложение J, случай 2);
- в любом случае, комбинация "число уровней контаминации / число реплик / число выбранных лабораторий" должна быть подобрана так, чтобы для вычислений имелось не менее 480 результатов (по 240 для каждого метода).
5.2.1.3 Лаборатория-организатор на основании всех полученных данных (см. Н.З приложения Н) должна определить, какие результаты являются годными, а какие результаты являются выбросами, для должного учета при вычислении данных о точности. См. приложение K, в котором приведены рекомендации, определяющие микробиологические условия для отбраковки данных.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Результаты лабораторий-участников не следует исключать, если нет четкого объяснения имеющихся грубых ошибок.
5.2.2 Вычисления
5.2.2.1 Для каждого уровня положительные результаты для каждого метода вносят в таблицы 5 и 6.
Таблица 5 - Положительные результаты для стандартного метода
|
|
|
|
Лаборатории | Уровень контаминации | ||
| | | |
Лаборатория 1 | /8 | /8 | /8 |
Лаборатория 2 | /8 | /8 | /8 |
Лаборатория 3 | /8 | /8 | /8 |
и т.д. | /8 | /8 | /8 |
Всего |  |  |  |
 Ложноположительные по стандартному методу.  Истинно положительные на уровне 1 по стандартному методу.  Истинно положительные на уровне 2 по стандартному методу. | |||
Таблица 6 - Положительные результаты для альтернативного метода
|
|
|
|
Лаборатории | Уровень контаминации | ||
| | | |
Лаборатория 1 | /8 | /8 | /8 |
Лаборатория 2 | /8 | /8 | /8 |
Лаборатория 3 | /8 | /8 | /8 |
и т.д. | /8 | /8 | /8 |
Всего | | | |
Ложноположительные по стандартному методу. Истинно положительные на уровне 1 по альтернативному методу. Истинно положительные на уровне 2 по альтернативному методу. | |||
5.2.2.4 Для каждого уровня контаминации и совокупности результатов сравнивают альтернативный метод со стандартным методом для вычисления относительной точности и для изучения несовпадающих результатов.
Каждую пару результатов, полученных на образце, измеренном альтернативным и стандартным методами, представляют в таблице 7.
Таблица 7 - Парные результаты альтернативного и стандартного методов, полученные в межлабораторном исследовании
|
|
|
|
Альтернативный метод | Стандартный метод | Всего | |
+ | + | - |
|
+ | | | - |
- | | | - |
Всего | | | |
5.2.2.5 Вычисляют доверительные интервалы для каждого соотношения (см. 5.1.1.3.2).
5.2.3 Интерпретация
Эти критерии на самом деле не характеризуют внутрилабораторные и межлабораторные изменчивости метода (понятия повторяемости и воспроизводимости). В приложении L приведены дополнительные критерии (согласованность результатов в одной лаборатории, соответствие результатов в разных лабораториях и коэффициент расхождения между согласованностью и соответствием), которые можно использовать при изучении такой изменчивости (критерии повторяемости и воспроизводимости определены для количественных методов, и их как таковые нельзя использовать применительно к качественным методам).
6 Количественные методы. Технический протокол валидации
6.1 Общие требования
Число колоний микроорганизмов в данном образце является наиболее распространенным результатом стандартных количественных методов. Записывают всю информацию - массу образца, серию разбавления, объем посевного материала и число колоний при каждом разбавлении. В микробиологии эти дискретные данные часто сокращают, например, проводят подсчет колоний только в чашках, содержащих менее 300 колоний, потом для получения конечного результата используют коэффициент расширения, обратно пропорциональный коэффициенту разбавления. Из-за наличия других факторов, влияющих на процесс роста микроорганизмов, а также в целях получения симметричного распределения или квазинормального распределения, данные подсчета часто преобразуют в логарифмический вид или в значения квадратного корня. Целесообразность такого преобразования можно проверить, используя гистограммы с набором экспериментальных точек (30 или более), полученных при одинаковых условиях.
Подразделы 6.2 и 6.3, в основном, относятся к валидации количественных методов сбора непрерывных данных (или данных в интервале значений), при этом отдельно включены замечания по подсчету числа микроорганизмов.
6.2 Сравнительное исследование методов
6.2.1 Линейность и относительная точность
6.2.1.1 Термины и определения
6.2.1.1.1 линейность (linearity): Способность метода при использовании с заданной матрицей давать результаты, пропорциональные количеству аналита в образце, т.е. увеличению аналита соответствует линейное или пропорциональное увеличение результатов.
Примечание 1 - Характеристику результата или сигнальную функцию получают путем измерения зависимости сигнала или результата метода от концентрации аналита (доз) в различных образцах стандартных материалов (RM) с известными характеристиками. В микробиологии, где стабильный стандартный материал практически отсутствует, эти "известные характеристики" можно получить путем многократных повторных измерений с использованием стандартного метода.
После подгонки, сглаживания или обработки другим алгоритмом данных разработчик альтернативного метода должен создать монотонную модель во всей области применения метода для преобразования результатов измерений в значения, наиболее близкие к стандартным результатам. Подгоночная модель является первой (или исходной) градуировочной характеристикой и включает все градуировочные коэффициенты в области концентраций; она часто нелинейна. Но эти аспекты не включены в процедуру валидации.
_______________
Не следует проводить экстраполяцию выше и ниже испытательных концентраций, кроме случаев, когда нужно изучить поведение вблизи "нулевой" концентрации.
Примечание 2 - При обработке результатов подсчетов микроорганизмов с помощью метода регрессии линейность не всегда правильно достигается для результатов подсчета, соответствующих низким уровням или широким диапазонам. Такие результаты подсчетов имеют квазипуассоновские распределения со среднеквадратическим отклонением воспроизводимости, пропорциональным корню квадратному из среднего подсчитанного числа микроорганизмов. При этом возникают те же трудности оценки, которые упомянуты в примечании к подпункту 6.2.2.1.
6.2.1.1.2 точность (accuracy): Близость результатов испытания к принятому опорному значению величины (ИСО 3534-1).
Примечание - Термин "точность", когда он относится к серии результатов испытаний, включает в себя сочетание случайных составляющих и общей систематической погрешности (смещения).
6.2.1.1.3 смещение (систематическая погрешность) (bias): Разность между математически ожидаемым результатом испытания и принятым опорным значением (ИСО 3534-1).
Примечание - Смещение есть полная систематическая погрешность, в отличие от случайной погрешности. Могут быть одна или несколько составляющих систематической погрешности, дающих вклад в смещение. Большему систематическому отклонению от принятого опорного значения соответствует большее значение систематической погрешности.
6.2.1.1.4 относительная точность (AC) (relative accuracy): Степень соответствия между результатом, полученным стандартным методом, и результатом, полученным альтернативным методом, при исследовании идентичных образцов (см. 5.1.1.1.1).
6.2.1.2 Протокол измерений
6.2.1.2.1 План
Для проверки градуировочной характеристики требуется большое число различных образцов (при возможности, стандартные материалы - см. приложение С) и исследование нескольких уровней (доз или концентраций), в зависимости от диапазона концентраций для практического использования.
_______________
Приоритет отдается естественно контаминированным образцам. Термин "уровень" используется в значении концентрации аналита, предполагаемой априори. В принципе, оптимальный план для регрессионного анализа получают путем выбора подходящего и уместного диапазона концентраций аналита, исключения исследования образцов с аналогичными подсчетами микроорганизмов или исключения повторяющихся данных с одинаковыми результатами. Для жидкостей диапазон может быть получен путем разведений, но необходимо обеспечить гомогенность как жидких, так и твердых образцов.
Образцы на одном уровне должны быть независимо продублированы путем подготовки подобразцов. На каждом уровне анализируют одинаковое число подобразцов - по меньшей мере, два, а в идеальном случае - от пяти до 10. Когда и в стандартном, и в альтернативном методах используют одни и те же десятикратные разведения подобразцов, испытания дублируют на уровне чашек Петри (см. случай 1 приложения М). Когда десятикратные разбавления нужно проводить только в стандартном методе, проводят исследование дублирующих образцов (см. случай 2 приложения М).
Чашки Петри, в двух дупликациях, засеваются каждым десятикратным разбавлением.
Следовательно, для проверки градуировочной характеристики альтернативным методом проводят минимум 10 измерений (в идеальном случае, от 25 до 50 измерений) с использованием естественно контаминированных образцов.
При отсутствии стандартных образцов материалов невозможно корректно оценить точность альтернативного метода, и определяют только относительную точность путем измерения тех же подобразцов стандартным методом.
6.2.1.2.2 Категории пищевых продуктов
Исследуют 5 категорий пищевых продуктов. Это число можно уменьшить до 1, 2 или 3 категорий, если альтернативный метод подлежит валидации только для таких заявленных категорий (например, молочные продукты). Рекомендованные категории перечислены в приложении В.
Соответствующие образцы должны быть естественно контаминированы исследуемым аналитом.
В случае возможности использования образцов окружающей среды, их нужно считать отдельной категорией (см. приложение В).
Желательно, чтобы образцы пищевых продуктов происходили из как можно более широкой зоны распространения для того, чтобы уменьшить смещения, обусловленные особенностями местного пищевого ассортимента, и расширить диапазон валидации.
Диапазон контаминации должен быть распространен на весь диапазон количественного испытания.
Если невозможно получить достаточное число естественно контаминированных образцов пищевых продуктов с нужными уровнями, то допустима искусственная контаминация некоторых образцов. Такие образцы должны составлять меньшинство в общем числе испытуемых образцов. Процедура искусственной контаминации должна обеспечивать получение образцов с характеристиками аналита, подобным характеристикам для естественно контаминированных образцов (см. приложение С, 2-й и 3-й случаи).
Таким образом, для каждой из пяти пищевых категорий и стандартным, и альтернативным методами измеряют минимум пять уровней целевого аналита, причем каждый образец реплицируется одинаковое число раз (от 2 до 10), что составляет всего от 10 до 50 измерений для каждых метода и пищевой категории. Если полученные результаты дают основания полагать, что матрица негомогенна или по составу ее компонентов, или из-за вариаций в концентрации целевого аналита по матрице, то необходимо провести исследование дополнительных образцов.
После раздельной оценки по каждой пищевой категории глобальная оценка градуировочной характеристики для всех категорий пищевых продуктов является полезным инструментом для идентификации возможных расхождений между областью применения, точностью и разбросом повторяемости во всем диапазоне аналита.
6.2.1.3 Вычисления
6.2.1.3.1 Общие требования
_______________
Для получения доступа к полной версии без ограничений вы можете выбрать подходящий тариф или активировать демо-доступ.