Методические указания по методам контроля МУК 4.2.3019-12 Организация и проведение лабораторных исследований на иерсиниозы на территориальном, региональном и федеральном уровнях.

МУК 4.2.3019-12

 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 Организация и проведение лабораторных исследований на иерсиниозы на территориальном, региональном и федеральном уровнях

 Методические указания

Дата введения: с момента утверждения

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е.Б.Ежлова, Ю.В.Демина, Н.В.Шеенков); Федеральным бюджетным учреждением науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера" Роспотребнадзора (Г.Я.Ценева, Е.А.Воскресенская, Г.И.Кокорина, Е.А.Богумильчик); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Роспотребнадзора (М.В.Чеснокова, С.В.Балахонов, В.Т.Климов, К.А.Тирских, М.Б.Черепанова); Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения "Центр гигиены и эпидемиологии в Новосибирской области" (Т.В.Каримова, О.В.Якунина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 18 июня 2012 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

 1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУ) определяют организацию и порядок проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней.

1.2. МУ предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы медицинскими и другими организациями, независимо от организационно-правовой формы и формы собственности.

 2. Нормативные и методические документы

В настоящих методических указаниях использованы ссылки и положения следующих нормативных и методических документов:

2.1. Федеральный закон от 03.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2.2. Постановление Правительства Российской Федерации от 16.04.2012 N 317 "О лицензировании деятельности в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных (за исключением случая, если указанная деятельность осуществляется в медицинских целях) и генно-инженерно-модифицированных организмов III-IV степени потенциальной опасности, осуществляемой в замкнутых системах".

2.3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 24.02.2009 N 11 "О представлении внеочередных донесений о чрезвычайных ситуациях в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера".

2.4. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 7.07.2009 N 415н "Об утверждении квалификационных требований к специалистам с высшим и послевузовским медицинским и фармацевтическим образованием в сфере здравоохранения".

2.5. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 17.03.2008 N 88 "О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней".

2.6. СанПиН 2.1.7.2790-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами".

2.7. СП 1.3.1318-03* "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами".

2.8. СП 1.3.2322-08 "Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

2.9. СП 1.3.2518-09 "Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения N 1 к СП 1.3.2322-08".

2.10. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности".

2.11. МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".

2.12. МУ 3.1.2438-09 "Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза".

2.13. МУК 4.2.2746-10 "Порядок применения молекулярно-генетических методов при обследовании очагов острых инфекций с групповой заболеваемостью".

2.14. СП 3.1.7.2615-10 "Профилактика иерсиниозов".

 3. Перечень сокращений

БХ - бульон Хоттингера

ЗФР - забуференный физиологический раствор

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛПО - лечебно-профилактические организации

МО - медицинские организации

ОРА - ориентировочная реакция агглютинации

ПУС - полиуглеводная среда

ПК - пептонно-калиевая среда

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

СанПиН - санитарные правила и нормы

СБТС - среда с бромтимоловым синим

СП - санитарно-эпидемиологические правила

УСС - универсальный скошенный столбик

 4. Общие положения

Yersinia pseudotuberculosis (возбудитель псевдотуберкулеза) и Yersinia enterocolitica (возбудитель кишечного иерсиниоза) - энтеропатогенные иерсинии, относимые к возбудителям зооантропонозных инфекций. Заражение Y.pseudotuberculosis происходит через инфицированные продукты питания (преимущественно овощи), Y.enterocolitica - чаще при употреблении в пищу молочных и мясных продуктов.

Иерсиниозы широко распространены в мире. В ряде стран Европы кишечный иерсиниоз занимает третье место по заболеваемости среди кишечных инфекций, после кампилобактериоза и сальмонеллеза. Заболеваемость псевдотуберкулезом в Российской Федерации регистрируется практически повсеместно, преимущественно в виде вспышек, кишечным иерсиниозом - в виде спорадических случаев.

Характеристика иерсиний

Род Yersinia включает группу грамотрицательных, не образующих спор, палочковидных (кокки или овоиды) факультативно-анаэробных микроорганизмов, относящихся к семейству Enterobacteriaceae. Среди 17 видов, входящих в род Yersinia, три отнесены к патогенным для человека и животных - возбудитель чумы Y.pestis, возбудитель псевдотуберкулеза Y.pseudotuberculosis и 11 представителей вида Y.enterocolitica патогенных биотипов 1В и 2-5.

Y.enterocolitica биотипа 1А относят к непатогенным, однако они могут быть возбудителями оппортунистических инфекций. Также непатогенными являются 13 видов иерсиний: Y.aldovae, Y.bercovieri, Y.frederiksenii, Y.intermedia, Y.kristensenii, Y.mollaretii, Y.rohdei, Y.ruckeri, Y.aleksiciаe, Y.similis, Y.massiliensis, Y.nurmii, Y.pekkanenii, Y.entomophaga.

Основные биохимические свойства Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica и некоторых других представителей Enterobacteriaceae, которые используются в практической работе при первичном изучении выделенных культур, представлены в табл.1 и 2.

Таблица 1

Основные дифференциальные признаки Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolitica и других представителей семейства Enterobacteriaceae

Таблица 2

Основные биохимические свойства бактерий рода Yersinia (26±2) °С

По О-антигену известен 21 серотип Y.pseudotuberculosis. Среди Y.enterocolitica различают 6 биотипов и 30 серотипов, из них 9 наиболее часто ассоциируются с заболеваниями человека: 0:3; 0:4; 0:5,27; 0:9; 0:8; 0:13; 0:18; 0:20; 0:21 (табл.3).

Таблица 3

Био- и серотипы Y.enterocolitica и их связь с патогенностью

Антигенное родство (по О-антигену) Y.pseudotuberculosis и большинства серотипов Y.enterocolitica выражено слабо. Значительное сходство по антигенной структуре выявлено у Y.pseudotuberculosis серотипа 0:1 и Y.enterocolitica "американских" серотипов 0:8; 0:18 и 0:21.

Температурный фактор является одним из важнейших определяющих изменчивость микробов и устойчивость их во внешней среде. Оптимальная температура для жизнедеятельности иерсиний - 28-30 °С, однако они могут, хотя и гораздо медленнее, размножаться при температуре 4-1 °С.

Достаточно долго иерсинии выживают на различных продуктах питания и даже могут на них размножаться (например, на овощах, особенно приготовленных в виде салатов). В молоке сохраняются до 18 суток, в сливочном масле - до 145 суток, на хлебе, кондитерских изделиях - от 16 до 24 суток. Иерсинии чувствительны к высокой температуре: при 100 °С погибают в течение нескольких секунд, однако при температуре 50-60 °С способны выживать до 20-30 мин, переносят большие (до 10%) концентрации раствора натрия хлорида, особенно при низких температурах. На микробы губительно действует прямая солнечная радиация, чувствительны иерсинии и к высыханию. Во влажной среде и невысокой температуре (14-18 °С) выживают длительно. Кислотность среды (при уровнях рН 3,6-4,0) также губительна для иерсиний. В дезинфицирующих растворах в стандартных разведениях микробы Yersinia погибают в течение 5-10 мин. Раствор перманганата калия в концентрации 0,5-0,3% вызывает гибель бактерий через 3 мин.

Патогенные Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica обладают широким набором факторов патогенности, детерминируемых хромосомными и плазмидными генами.

Способность Y.pseudotuberculosis к адгезии и инвазии в клетки эпителия кишечника зависит от экспрессии хромосомного inv-гена, кодирующего синтез белка наружной мембраны инвазина с молекулярной массой 108 кДа. Диссеминация микроба в организме хозяина связана с функционированием группы хромосомных генов, ответственных за ассимиляцию ионов железа ("остров высокой патогенности", HPI). Штаммы Y.pseudotuberculosis, содержащие HPI, редко выделяются в России (3,9%), в основном они циркулируют в Европе, Австралии, Северной Америке.

Важным фактором патогенности Y.pseudotuberculosis является синтез суперантигена (YPM), ответственного за поликлональную активацию Т-лимфоцитов и гиперпродукцию провоспалительных цитокинов. Клинически это выражается развитием синдрома токсического шока. У 98% штаммов этого вида, выделенных от больных в России, Японии, Корее, обнаруживается суперантиген, вызывающий системное поражение органов и тканей.

Патогенные Y.enterocolitica также имеют факторы патогенности, обеспечивающие им адгезивные и инвазивные свойства (ген ail).

Гены HPI не выявляются у непатогенных Y.enterocolitica биотипа 1А и у низкопатогенных штаммов биотипов 2-5, но они определяются у всех высокопатогенных штаммов биотипа 1В. Энтеротоксигенность Y.enterocolitica биотипов 1В и 2-5 связана с экспрессией хромосомного гена ystA. У непатогенных представителей биотипа 1А обнаружен ген ystB.

Плазмидой вирулентности иерсиний pYV 42-48 MDa обладают все штаммы Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica IB, 2-5 биотипов. Основная функция плазмиды pYV - нейтрализация факторов иммунитета макроорганизма.

Плазмида с молекулярной массой 82 MDa (pVM) обнаружена только у Y.pseudotuberculosis 1 серотипа. Штаммы, имеющие плазмиду pVM, вызывают более тяжелое течение псевдотуберкулеза.

 5. Порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы для лабораторий территориального уровня

 5.1. Рекомендованный порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы в материале от людей в лабораториях лечебно-профилактических организаций*

5.1.1. Требования к лабораториям, осуществляющим исследования на иерсиниозы

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов

Лаборатории, которые осуществляют исследования на иерсиниозы, должны иметь разрешительные документы на этот вид деятельности согласно действующему законодательству.

Проведение исследований на всех этапах: взятие проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, порядок исследования, выдача результатов должны соответствовать требованиям действующих нормативных и методических документов.

Обеззараживание отходов должно осуществляться в соответствии с действующими нормативными и методическими документами по обращению с медицинскими отходами.

Требования к специалистам и вспомогательному персоналу, участвующим в выполнении исследований на иерсиниозы

Исследования на иерсиниозы могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским образованием, имеющие допуск к работе с ПБА III-IV групп патогенности на основании приказа руководителя учреждения, окончившие курсы по специальности "Бактериология", знающие правила работы с ПБА III-IV группы патогенности. Специалисты должны проходить профессиональную переподготовку не реже одного раза в пять лет. Лица, имеющие высшее (среднее) медицинское образование, должны иметь сертификат специалиста ("Бактериология"/"Лабораторное дело").

Инженерно-технический персонал, дезинфекторы и санитарки проходят специальную подготовку по месту работы в соответствии с должностными обязанностями.

Необходимый уровень подготовки специалистов лабораторий представлен в прилож.1.

Требования к знаниям и умениям специалистов лабораторий приведены в прилож.2.

Требования к обеспечению безопасности работы персонала

Каждая бактериологическая лаборатория должна иметь пакет нормативно-методической документации и инструкций, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.

Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным или зараженным возбудителями инфекционных болезней III-IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими нормативными документами.

Порядок организации внутреннего и внешнего контроля качества лабораторных исследований

Контроль качества исследований на иерсиниозы в лабораториях включает:

- контроль качества питательных сред, диагностических препаратов и тест-систем, дезинфицирующих средств и химических реактивов;

- своевременную поверку средств измерений, аттестацию испытательного оборудования;

- контроль качества стерилизации лабораторной посуды;

- контроль работы паровых и суховоздушных стерилизаторов;

- контроль температурного режима работы холодильников и термостатов;

- контроль работы бактерицидных ламп;

- проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;

- проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, дезинфекции, контроля смывов с поверхностей и оборудования.

Результаты контроля фиксируют в специальных журналах, формулярах или других учётных документах.

Внешний контроль качества лабораторных исследований включает:

- участие в межлабораторных сличительных испытаниях (МСИ);

- участие в Федеральной системе внешней оценки качества (ФСВОК);

- приобретение шифрованных образцов для идентификации иерсиний.

Правила ведения документации

Ведение лабораторной документации, включая состояние регистрационных и рабочих журналов, осуществляют ежедневно в соответствии с требованиями действующих нормативных и методических документов.

Требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения исследований на иерсиниозы

Для проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях должны быть в наличии:

- питательные среды, зарегистрированные в установленном порядке (прилож.3 к МУ);

- диагностические препараты, тест-системы, зарегистрированные в установленном порядке (прилож.4 к МУ);

- химические реактивы (прилож.5 к МУ);

- приборы и оборудование (прилож.6 к МУ).

5.1.2. Номенклатура и объем исследований

В лабораториях МО проводят:

- диагностические исследования материала от госпитализированных в стационар и амбулаторных больных с целью дифференциальной диагностики и установления этиологии заболевания при спорадической и вспышечной заболеваемости;

- исследования патолого-анатомического материала.

В лабораториях МО проводят исследования материала в следующем объеме:

1) посев на среды накопления, "холодовое обогащение" с периодическими высевами на дифференциально-диагностические среды, отсев характерных по морфологическим свойствам колоний иерсиний на ПУС;

2) идентификация и дифференциация выделенных культур до вида по морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам, в том числе с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации ("Vitek-2", "Mini API", "Микроб-2", "Микроб-Автомат" и др.) при наличии оборудования и тест-систем;

3) выявление антител в парных сыворотках (РА, РНГА, ИФА);

4) экспрессные методы исследования (ПЦР) - при наличии оборудования.

5.1.3. Порядок лабораторных исследований на иерсиниозы

5.1.3.1. Правила отбора и транспортирования проб клинического материала

При проведении бактериологического анализа на иерсиниозы исследуется клинический материал: испражнения, моча, кровь, мазки из зева, операционный или секционный материал: аппендицикулярные отростки, мезентериальные лимфоузлы и патологически измененные органы и ткани, сгустки крови, желчь, содержимое кишечника.

Материал от больного (подозрительного на заболевание) отбирает медицинский персонал МО немедленно при выявлении больного (подозрительного на заболевание) до начала лечения антибиотиками.

При совместном использовании бактериологического и ПЦР методов отбор материала осуществляется в одноразовую посуду.

Правила отбора материала от больных (подозрительных на заболевание):

- испражнения* берут на протяжении всего периода заболевания в количестве 0,5-1,0 г стерильной ложечкой из судна и помещают в стерильный широкогорлый флакон с 5,0-10,0 мл среды накопления;

_______________

* Высеваемость иерсиний наиболее высока в первые 3-5 дней болезни и до назначения антибиотиков, результаты бактериологического исследования улучшаются, если взятие материала производится 3-кратно в течение первой недели болезни (госпитализации).

- мочу исследуют в первые 7 дней болезни, берут 20-30 мл средней порции утренней мочи в стерильную посуду. Осадок после центрифугирования помешают в 5,0 мл среды накопления;

- смыв из зева берут в первые 3 дня болезни натощак с задней стенки глотки и корня языка тампоном, смоченном в физиологическом растворе, и помешают в 5,0 мл среды накопления;

- кровь исследуют в течение болезни на высоте лихорадки, весь лихорадочный период и в период рецидива болезни. Кровь забирают натощак в количестве 5-10 мл из локтевой вены с соблюдением правил асептики, выдерживают при комнатной температуре в наклонном положении (под углом 30-45°) до образования сгустка (30-40 мин), после чего сгусток отделяют от стенки, сыворотку переносят в пробирку для серологических реакций, а сгусток помещают в 5,0 мл среды накопления.

Правила отбора операционного или секционного материала:

- Аппендикулярный отросток. Стерильно ножницами измельчают 1,0-2,0 г пробы и помещают в 5,0-10,0 мл среды накопления.

- Мезентериальные лимфоузлы, другие органы и ткани. Стерильно ножницами измельчают 1,0-2,0 г пробы и помещают в 5,0-10,0 мл среды накопления.

- Желчь. В 5,0 мл среды накопления помещают 0,5-1,0 мл.

- Содержимое кишечника. В 5,0 мл среды накопления помещают 0,5-1,0 мл.

- Сгусток крови. Стерильно измельчают 0,5-1,0 мл пробы и помещают в 5,0 мл среды накопления.

Пробы этикетируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией, заполняют бланк направления и помещают в контейнер для транспортирования биологического материала на исследование.

Транспортирование материала в лабораторию осуществляется при температуре (4-12) °С в течение двух часов после взятия.

I этап исследования

(пробоподготовка и посев нативного материала)

Проводят "холодовое обогащение" исследуемого материала: внесенный в среду ПК, в ЗФР или 1%-ю пептонную воду (среды накопления) материал помещают в холодильник (6±2) °С и выдерживают в нем до первого положительного высева на 2-3, 5-7 или 10-15 сутки.

Постановка ускоренных методов исследования нативного материала: ПЦР или ИФА для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза 1 серотипа*. При получении положительного результата выдают предварительный положительный ответ.

_______________

* Производственный выпуск "Тест-системы иммуноферментной для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза 1 серотипа" будет осуществляться в НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Пастера с 2012 г.

II этап исследования

(на 2-3 сутки от начала исследования)

Проводят высев со сред накопления (2-3 сутки "холодового обогащения") на плотные дифференциально-диагностические среды (СБТС, Эндо) или другие коммерческие дифференциальные среды для диагностики иерсиниозов, разрешенные к применению на территории Российской Федерации (среда Мак-Конки и др.) - петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности!), не взбалтывая пробирки (!).

Для инактивации посторонней микрофлоры перед каждым высевом на плотную питательную среду проводят щелочную обработку материала 0,72%-м раствором гидроксида калия в 0,5%-м растворе хлорида натрия (30-60 с) или 5%-м раствором тринатрий фосфата. Посевы инкубируют при (26±2) °С 48 ч (на среде СБТС) или (на среде Эндо) 24 ч (не более 30 ч!).

Ускоренные методы исследования материала из сред накопления (2-3-и сутки "холодового обогащения"): ПЦР или ИФА для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза 1 серотипа. При получении положительного результата выдают подтверждение предварительного положительного ответа и продолжают бактериологическое исследование пробы до выделения культуры. При отрицательных результатах ПЦР на этапах I-II дальнейшее бактериологическое исследование пробы прекращают.

III этап исследования

(4-5-е сутки от начала исследования)

Просмотр посевов на дифференциально-диагностических средах, засеянных на этапе II исследования, и учет морфологии колоний.

Проводят отбор характерных для Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica колоний на дифференциальную среду с мочевиной (среду Олькеницкого, УСС или среды Ресселя I и II)* и той же колонии - на скошенные столбики (или сектора) МПА (АХ) для накопления бактериальной массы. Посевы инкубируют на средах Олькеницкого, УСС, Ресселя I при (37±1) °С, на МПА (АХ), среде Ресселя II - при (26±2) °С. При наличии сложности отбора колонии на две среды возможен первичный отбор колоний на среды с мочевиной с последующим пересевом уреазоположительных культур на МПА (АХ), среду Рессель II.

_______________

* Прописи сред и способ приготовления представлены в прилож.8.

IV этап исследования

(5-6-е сутки от начала исследования)

Проводят идентификацию и дифференциацию уреазоположительных культур из пробирки (или чашки) с МПА, засеянных на этапе II исследования (2-3 сутки "холодового обогащения"):

- микроскопия мазка, окрашенного по Граму;

- тест на цитохромоксидазу;

- ферментативная активность на средах Гисса* (26±2) °С: маннитол, сахароза, рамноза, раффиноза, сорбитол, мелибиоза, салицин, ксилоза;

_______________

* При использовании сред Ресселя I и II проводят постановку следующих биохимических тестов - сахароза, рамноза, раффиноза, салицин, ксилоза, сорбит, индол.

- реакция Фогеса-Проскауэра (среда Кларка) при (20±2) °С и (37±1) °С;

- декарбоксилирование орнитина (среда Биргера-Крушинской) при (37±1) °С;

- утилизация цитрата (среда Симмонса) при (37±1) °С;

- дезаминирование фенилаланина (агар с фенилаланином) при (37±1) °С;

- образование индола (0,3% полужидкий агар) при (20±2) °С и (37±1) °С;

- проба с псевдотуберкулезным фагом (агар Хоттингера, МПА) при (26±2) °С;

- постановка ОРА на стекле с псевдотуберкулезной и иерсиниозной сыворотками - культуры с МПА (АХ), среды Ресселя II;

- идентификация возбудителя с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации ("Vitek-2", "Mini API", "Микроб-2", "Микроб-Автомат" или аналоги) - при наличии оборудования и тест-систем.

V этап исследования

(5-7-е сутки от начала исследования)

Проводят высев со сред накопления (5-7-е сутки "холодового обогащения") на плотные дифференциально-диагностические среды после предварительной щелочной обработки.

Проводят учет результатов биохимической идентификации и дифференциации Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica, проведенных на IV этапе исследования (2-3-и сутки "холодового обогащения"), определяют биотип Y.enterocolitica.

Проводят реакцию агглютинации на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям.

Выдача окончательного положительного ответа.

VI этап исследования

(7-8-е сутки от начала исследования)

Просмотр посевов на дифференциально-диагностических средах, засеянных на V этапе исследования (5-7-е сутки "холодового обогащения").

Проводят отбор характерных для Y.pseudotuberculosis и Y.Enterocolitica колоний на дифференциальную среду с мочевиной (среду Олькеницкого, УСС или среды Ресселя I и II) и МПА (АХ).

VII этап исследования

(8-10-е сутки от начала исследования)

Проводят идентификацию и дифференциацию уреазоположительных культур, засеянных на VI этапе исследования (5-7-е сутки "холодового обогащения") по тестам, предусмотренным на IV этапе исследования.

VIII этап исследования

(9-11-е сутки от начала исследования)

Проводят учет результатов биохимической идентификации и дифференциации Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica, проведенных на VII этапе исследования (5-7-е сутки "холодового обогащения"), определяют биотип Y.enterocolitica.

Проводят реакцию агглютинации на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям.

Выдача окончательного положительного ответа.

IX этап исследования

(10-е сутки от начала исследования)

Проводят высев со сред накопления на дифференциально-диагностические среды после предварительной щелочной обработки (10-е сутки "холодового обогащения").

X этап исследования

(12-е сутки от начала исследования)

Просмотр посевов на дифференциально-диагностических средах, засеянных на IX-м этапе исследования (10-е сутки "холодового обогащения"), отбор характерных для Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica колоний на дифференциальную среду с мочевиной (среду Олькеницкого, УСС или среды Ресселя I и II) и агар МПА (АХ).

XI этап исследования

(13-е сутки от начала исследования)

Проводят идентификацию и дифференциацию уреазоположительного изолята, засеянного на X-м этапе исследования (10-е сутки "холодового обогащения"), по набору биохимических тестов, предусмотренных на IV-м этапе исследования.

XII этап исследования

(14-е сутки от начала исследования)

Проводят учет результатов биохимической идентификации и дифференциации Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica, проведенных на XI-м этапе исследования (10-е сутки "холодового обогащения").

Выдача окончательного положительного ответа.

Передача выделенной культуры для дальнейшей идентификации в специализированную лабораторию возможна на любом этапе исследования.

5.1.3.2. Полимеразная цепная реакция

Для выявления ДНК иерсиний используют наборы для ПЦР, зарегистрированные в установленном порядке. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению. Материал для исследования отбирается в одноразовую пробирку (или контейнер) в соответствии с п.5.1.3.1 в среду накопления ЗФР (рН 7,2-7,4).

Наиболее информативным для ПЦР являются испражнения и кровь в период лихорадки. Материал забирается немедленно при выявлении больного и до назначения антибиотиков (!).

Исследование проб проводят в первые сутки их получения и на 2-3 сутки после "холодового обогащения" в ЗФР. Непосредственно перед исследованием проводят пробоподготовку материала, используя набор для выделения ДНК.

При использовании этих методов при пробоподготовке получают препарат суммарной ДНК всех содержащихся в пробе микроорганизмов, что может вызвать ингибирование ПЦР и снижение ее чувствительности. Разработан способ подготовки проб, основанный на использовании щелочной обработки материала, при котором большая часть индигенной микрофлоры погибает и удаляется как супернатант при центрифугировании, а относительно устойчивые к щелочи иерсинии выживают (патент от 27.07.2000 N 2153671):

1. Исследуемый материал (нативный) центрифугируют при 500-1000 об./мин 1,5-2,0 мин для осаждения грубых частиц или отстаивают 2-3 ч при комнатной температуре.

2. Переносят 0,2-0,5 мл верхней фазы (в том числе, после "холодового обогащения" в течение 2-3 суток) в лунки полистиролового планшета для серологических реакций и смешивают с 0,72% КОН в таком же объеме.

3. После 30-60 с экспозиции проводят посев материала на дифференциально-диагностические среды и сразу же в лунки планшета добавляют 0,2-0,5 мл БХ для прекращения действия щелочи как селективного агента.

4. Материал из лунки переносят в пробирку типа "Эппендорф" и центрифугируют на микроцентрифуге при 10000-12000 об./мин 3-5 мин.

5. Надосадочную жидкость удаляют, осадок дважды промывают дистиллированной водой путем центрифугирования.

6. К осадку добавляют 20 мкл деионизованной воды, прогревают 10 мин при 100 °С, центрифугируют при 12000 об./мин 2 мин. Для ПЦР используют 1-3 мкл надосадочной жидкости.

5.1.3.3. Иммунологические методы выявления специфических антигенов

Для выявления антигенов иерсиний используют тест-систему иммуноферментную для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза 1 серотипа.

Материал для исследования, сроки и правила его взятия аналогичны п.5.1.3.1.

Исследование проб проводят в первые сутки их получения и затем на 3-5-е сутки после "холодового обогащения" в среде ПК. Непосредственно перед исследованием материал инактивируют 30 мин при (56±1) °С, центрифугируют при 3000 об./мин и берут для исследования надосадочную жидкость. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.

5.1.3.4. Серологическое исследование на иерсиниозы

Для исследования требуется две пробы крови, взятые в разные периоды заболевания (парные сыворотки!): 1-я неделя начала заболевания и коней 2-й, начало 3-й недели болезни.

Серологическая диагностика основывается на появлении или нарастании титра антител в течение болезни. Достоверным считается 2-4-кратное и выше нарастание титра антител при исследовании парных сывороток.

Реакция агглютинации (РА). Для постановки РА используют стандартные иерсиниозные антигены распространенных серотипов, представляющие собой 10 млрд взвесь иерсиний эталонных штаммов в S-форме, убитых формалином и суспендированных в 0,9%-м растворе хлорида натрия. Перед постановкой микробную взвесь разводят в 10 раз до рабочей концентрации 1 млрд/мл. Реакцию ставят методом равных объемов (0,5 мл сыворотки + 0,5 мл взвеси). Диагностический титр - 1:160.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Для постановки РНГА используют коммерческие эритроцитарные диагностикумы к Y.pseudotuberculosis I серотипа и Y.enterocolitica серотипов О:3 и О:9, представляющие собой полисахаридные антигены иерсиний, фиксированные на поверхности формалинизированных бараньих эритроцитов. Методика постановки и учета РНГА приведена в инструкции по применению. При постановке РНГА с псевдотуберкулезным диагностикумом диагностический титр равен 1:100, кишечноиерсиниозными - 1:200.

Для повышения диагностической эффективности РНГА и исключения ложноположительных результатов рекомендуется соблюдать следующие правила при постановке:

1. Непосредственно перед постановкой РНГА чистые полистироловые пластины ополаскивают дистиллированной водой, а затем высушивают.

2. Накануне постановки РНГА эритроцитарный диагностикум разводят 10 мл ЗФР (рН 7,2) и помещают в холодильник на ночь (для регидратации эритроцитов). Диагностикум, используемый сразу после разведения, часто дает нечеткий результат.

3. Исследуемые сыворотки крови, разведенные ЗФР в соотношении 1:25, необходимо прогреть при 56 °С в течение 30 мин для устранения неспецифических гемагглютининов, которые могут содержаться в сыворотках крови людей.

4. Поскольку некоторые сыворотки крови человека содержат антитела к эритроцитам барана (последние используются для конструирования коммерческого диагностикума), рекомендуется предварительно перед использованием провести адсорбцию каждой сыворотки 50%-й взвесью бараньих эритроцитов (0,1 мл на 1 мл сыворотки) в течение ночи при температуре холодильника.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для постановки ИФА используют тест-системы "Иерсиниоз-ИФА-IgA", "Иерсиниоз-ИФА-lgM", "Иерсиниоз-ИФА-IgG", предназначенные для выявления антител классов А, М и G к возбудителям кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.

5.1.4. Регистрация и оформление результатов исследования

Данные о проведении исследований (испытаний) регистрируются в учётной документации, включающей:

- направления на проведение исследований;

- журналы регистрации образцов, поступивших на исследование;

- журналы регистрации результатов исследований.

Результаты каждого исследования (испытания) оформляются по унифицированным формам.

 5.2. Порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы в ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации*

5.2.1. Требования к лабораториям филиалов (отделений) ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации, осуществляющим исследования на иерсиниозы

Согласно п.5.1.1.

5.2.2. Номенклатура и объем исследований

Микробиологические лаборатории филиалов (отделений) ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации при проведении эпидемиологического надзора в соответствии с требованиями СП 3.1.2615-10* "Профилактика иерсиниозов" осуществляют в плановом порядке:

- исследование проб с эпидемически значимых объектов ("объекты риска"): смывы с оборудования, инвентаря, овощей, пищевых продуктов в овощехранилищах, мясо- и молокоперерабатывающих предприятиях, объектах торговли продуктами растительного происхождения, пищеблоках объектов общественного питания, общеобразовательных учреждениях, детских и медицинских организациях;

- исследования продуктов животноводства, птицеводства, плодоовощной продукции в разрезе Программы производственного контроля (по согласованию);

- лабораторные исследования материала от больных (подозрительных на заболевание) - осуществляются по согласованию.

По эпидпоказаниям исследованию подлежат:

- материал от людей, находящихся в одинаковых с больными условиях по риску заражения, в эпидемических очагах при проведении эпидемиологического расследования и санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий;

- в эпидемических очагах иерсиниозов или при неблагополучной эпидемиологической ситуации:

- смывы с овощей, фруктов и других продуктов, не подвергающихся термической обработке;

- смывы с поверхности оборудования, инвентаря и тары в овощехранилищах, пищеблоках организованных коллективов, домашних очагах;

- остатки подозреваемых пищевых продуктов (салаты, сок домашнего приготовления, фляжное молоко, творог домашнего приготовления, сырое свиное мясо, субпродукты и т.д.);

- экскременты домашних и сельскохозяйственных животных, смывы с их подстилок;

- помет мелких млекопитающих;

- вода открытых водоемов и из ёмкостей для хранения.

В лабораториях филиалов (отделений) ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации проводят диагностические исследования материала в следующем объеме:

1) посев на среды накопления, "холодовое обогащение" с периодическими высевами на дифференциально-диагностические среды, отсев характерных по морфологическим свойствам колоний иерсиний на ПУС;

2) идентификация и дифференциация выделенных культур до вида возбудителя по морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам;

3) выявление антител в парных сыворотках (РНГА, ИФА).

5.2.3. Порядок лабораторных исследований на иерсиниозы в филиалах (отделениях) ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации

5.2.3.1. Правила отбора и транспортирования проб из объектов окружающей среды

Отбор проб и доставку осуществляют специалисты, владеющие методами отбора проб из объектов окружающей среды филиалов (отделений) ФБУЗ "ЦГиЭ".

- Пищевые продукты. В стерильную емкость помещают 25 г каждого продукта.

- Овощи. Одним влажным стерильным тампоном делают смыв не менее чем 10 экз. каждого вида овощей на границе здоровой и загнивающей части, помещают тампон в 5,0-10,0 мл среды накопления.

-

Смывы с оборудования, инвентаря, тары

. Одним влажным тампоном производят смыв с одноименных поверхностей площадью 100 см

каждая, тампон помещают в 5,0-10,0 мл среды накопления.

- Вода из емкостей для хранения и открытых водоемов. В стерильные флаконы забирают 1-2 л воды.

- Помет. Собирают стерильной палочкой 1-2 г и помещают в 5,0 мл среды накопления.

Пробы маркируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией, заполняют бланк-направление и помещают в контейнер для транспортирования материала для исследования. Транспортирование осуществляют при температуре 4-12 °С в течение двух часов после забора.

5.2.3.2. Правила отбора и транспортирования проб от больных (подозрительных на заболевание) и лиц, находящихся с ними в одинаковых условиях по риску заражения.

Материал от больных (подозрительных на заболевание) и лиц, находящихся с ними в одинаковых условиях по риску заражения, забирает медицинский персонал МО немедленно при выявлении больного, до начала лечения антибиотиками.

Пробы маркируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией и вместе с бланком-направлением транспортируют при 4-12 °С в лабораторию МО или филиал (отделение) ФБУЗ "ЦГиЭ" (по договоренности) в течение двух часов после забора.

Взятие материала осуществляют согласно п.5.1.3.1.

5.2.3.3. Порядок проведения лабораторного исследования на иерсиниозы объектов окружающей среды и материала от людей.

Исследование проб объектов окружающей среды, исследование клинического материала на иерсиниозы, видопринадлежность выделенных культур осуществляют в соответствии с п.5.1.3.

5.2.4. Регистрация и оформление результатов исследования

Регистрация результатов анализа производится по учетным формам филиалов (отделений) ФБУЗ "ЦГиЭ" согласно п.5.1.4.

5.2.5. Порядок передачи информации и выделенных культур лабораториями филиалов (отделений) ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации

Информация о выделенных штаммах Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica в лабораториях филиалов (отделений) ФБУЗ "ЦГиЭ" от людей и объектов окружающей среды передается в ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации.

Культуры Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica направляются в лаборатории ФБУЗ "ЦГиЭ" в субъекте Российской Федерации. Передача и транспортирование осуществляются в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру в одном экземпляре (прилож.7 к МУ), сопроводительное письмо, акт передачи живых культур.

 5.3. Порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы в лабораториях ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации*

5.3.1. Требования к лабораториям ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации

Согласно п.5.1.1.

5.3.2. Номенклатура и объем исследований

Микробиологические лаборатории ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации проводят в плановом порядке:

- исследования проб с эпидемиологически значимых объектов "объектов риска" (смывы с оборудования, инвентаря, овощей, пищевых продуктов в овощехранилищах, мясо- и молокоперерабатывающих предприятиях, объектах торговли продуктами растительного происхождения, пищеблоках объектов общественного питания, общеобразовательных учреждениях, детских и медицинских организациях);

- исследования продуктов животноводства, птицеводства, плодоовощной продукции в разрезе Программы производственного контроля (по согласованию);

- исследования материала от больных (подозрительных на заболевание) (по согласованию);

- подтверждение и идентификацию культур иерсиний, выделенных лабораториями МО и филиалами (отделениями) ФБУЗ "ЦГиЭ" по морфологическим, культурально-биохимическим и серологическим свойствам.

По эпидпоказаниям исследованию подлежат:

- материал от людей, находящихся в одинаковых с больными условиях по риску заражения, в эпидемических очагах при проведении санитарно-противоэпидемических мероприятий;

- смывы с овощей, фруктов и других продуктов, не подвергающихся термической обработке;

- смывы с поверхности оборудования, инвентаря и тары в овощехранилищах, пищеблоках организованных коллективов, домашних очагах;

- остатки подозреваемых пищевых продуктов (салаты, сок домашнего приготовления, фляжное молоко, творог домашнего приготовления, сырое свиное мясо, субпродукты и т.д.);

- экскременты домашних и сельскохозяйственных животных, смывы с их подстилок;

- помет мелких млекопитающих;

- вода открытых водоемов и из ёмкостей для хранения;

- исследование проб, собранных в ходе эпизоотологического обследования (тонкий кишечник мелких млекопитающих и птиц, брыжейка и мезентеральные лимфоузлы, гнезда грызунов, почва).

В лабораториях ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации проводят исследования материала в следующем объеме:

1) посев на среды накопления, "холодовое обогащение" с периодическими высевами на дифференциально-диагностические среды, отсев характерных для иерсиний колоний на ПУС с одновременным выполнением экспресс-методов диагностики иерсиниозов (ПЦР, Real-time ПЦР);

2) идентификация и дифференциация выделенных культур до вида по морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам, в том числе с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации ("Vitek-2", "Mini API", "Микроб-2", "Микроб-Автомат" или аналоги) при наличии оборудования и тест-систем;

3) индикация и идентификация культур иерсиний с использованием ПЦР, Real-time ПЦР;

4) выявление антител в парных сыворотках (РНГА, ИФА, РА).

5.3.3. Порядок лабораторных исследований на иерсиниозы в ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации

5.3.3.1. Правила отбора и транспортирования проб из объектов окружающей среды.

Отбор и транспортирование материала осуществляют согласно п.5.2.3.1.

5.3.3.2. Правила отбора и транспортирования клинического материала.

Отбор и транспортирование материала осуществляют согласно пп.5.1.3.1 и 5.2.3.2.

5.3.3.3. Правила отбора проб материала от животных, собранных при обследовании природных или антропоургических* очагов иерсиниозов.

Материал, собранный в ходе обследования природных и антропургических* очагов, должен быть свежим, поэтому органы животных следует забирать в максимально короткие сроки или соблюдать низкотемпературный режим для транспортировки и хранения полевого материала. Лабораторному исследованию подвергают: тонкий кишечник мелких млекопитающих, птиц, сельскохозяйственных и домашних животных, субстрат гнезд грызунов:

- Тонкий кишечник. 1,0-2,0 г в месте перехода тонкой кишки в толстую с содержимым забирают стерильно и помещают в 5,0 мл среды накопления.

- Брыжейка, мезентеральные лимфоузлы. 1,0-2,0 г стерильно измельчают, 1 мл суспензии помещают в 5,0 мл среды накопления.

- Гнезда грызунов. Субстраты гнезд (примерно 10 г каждого) растирают в ступке пестиком с фосфатно-буферным раствором, 1,5 мл взвеси вносят в 15,0 мл среды накопления.

5.3.3.4. Порядок проведения лабораторного исследования на иерсиниозы объектов окружающей среды, материала от людей, полевого материала, выделенных культур.

Исследование материала от людей с диагностической целью и по эпидпоказаниям, проб из объектов окружающей среды по эпидпоказаниям проводят в соответствии с п.5.1.3. При осуществлении планового эпизоотологического мониторинга за природными очагами иерсиниозов высевы со сред накопления рекомендуется проводить до 21 суток.

Идентификация выделенной культуры проводится по следующим тестам:

- характерная морфология колоний;

- типичные биохимические свойства;

- чувствительность к псевдотуберкулезному фагу;

- серологическое типирование с использованием диагностических сывороток к Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica;

- биотипирование Y.enterocolitica по набору тестов (ферментация салицина, липазная активность, образование индола, ферментация ксилозы, нитратредуктазная активность, реакция Фогес-Проскауэра);

- определение вирулентности иерсиний по фенотипическим признакам (тест на аутоагглютинацию, определение кальцийзависимости роста иерсиний);

- РА на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям.

5.3.4. Регистрация и оформление результатов исследования

Регистрация результатов анализа производится по учетным формам ФБУЗ "ЦГиЭ" согласно п.5.1.4.

5.3.5. Порядок передачи информации и выделенных культур лабораториями ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II-IV групп патогенности

Информация о выделенных или идентифицированных культурах Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica передается в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II-IV групп патогенности.

Культуры иерсиний, выделенных от людей, мелких млекопитающих и объектов окружающей среды, и идентифицированные в лабораториях ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации передаются в установленном порядке в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II-IV групп патогенности. Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов II-IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру, сопроводительное письмо и акт передачи патогенных биологических агентов III-IV групп за пределы организации.

 6. Порядок организации и проведения исследований на иерсиниозы для лабораторий регионального уровня

 6.1. Порядок организации и проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности в федеральных округах*

6.1.1. Требования к лабораториям Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности

Согласно п.5.1.1.

6.1.2. Номенклатура и объем исследования

Лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности проводят:

- верификацию культур иерсиний и их расширенную идентификацию;

- диагностические исследования материала от больных и объектов окружающей среды - в случае отсутствия диагностических возможностей на местах, трудности дифференциальной диагностики, наличия тяжелых и атипичных форм инфекции и т.д.;

- исследование проб, собранных в ходе эпизоотологического обследования природных и антропургических очагов иерсиниозов;

- контроль качества питательных сред.

Лаборатории Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности проводят исследования в следующем объеме:

- идентификация культур, доставленных (определение биотипа, серотипа возбудителя, определение вирулентности культуры по фенотипическим признакам);

- индикация и идентификация культур иерсиний при использовании ПЦР, Real-time ПЦР;

- посев на среды накопления с одновременным выполнением экспресс-методов диагностики (ПЦР, Real-time ПЦР);

- высев со сред накопления на дифференциально-диагностические среды, отсев подозрительных колоний для последующей родовой и видовой дифференциации;

- идентификация возбудителя с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации ("Vitek-2", "Mini API", "Микроб-2", "Микроб-Автомат" или аналоги) при наличии оборудования.

6.1.3. Организация и обеспечение исследований на иерсиниозы в лабораториях Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности

Порядок исследований клинического материала, проб из объектов окружающей среды, грызунов, птиц, материала от сельскохозяйственных и домашних животных проводят в соответствии с п.5.1.3.

К подтверждающим тестам относительно Y.pseudotuberculosis/Y.enterocolitica относятся:

- характерная морфология колоний;

- типичные биохимические свойства;

- чувствительность к псевдотуберкулезному бактериофагу;

- серологическое типирование с использованием диагностических сывороток к Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis;

- биотипирование Y.enterocolitica по набору тестов (ферментация салицина, ксилозы, образование индола, редукция нитратов, реакция Фогес-Проскауэра);

- тест на аутоагглютинацию, определение кальцийзависимости роста иерсиний, определение температурозависимой морфологии колоний; РА на стекле для выявления вирулентных иерсиний с СВИ;

- определение чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом;

- определение видоспецифических ДНК-мишений методом ПЦР.

6.1.4. Регистрация и оформление результатов исследования

Регистрация результатов исследования оформляется согласно п.5.1.4.

6.1.5. Порядок передачи информации и выделенных культур лабораториями Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности в Референс-центры

Информация о выделенных и идентифицированных культурах Y.pseudotuberculosis и патогенных Y.enterocolitica передается в Референс-центр по мониторингу за возбудителями иерсиниозов (ФБУН "Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" Роспотребнадзора) и Референс-центр по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекций (ФКУЗ "Иркутский НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока" Роспотребнадзора).

При невозможности проведения диагностических исследований для установления причинно-следственной связи при работе в эпидемическом очаге, верификации и расширенной идентификации культур в Региональном центре по мониторингу за возбудителями II-IV групп патогенности лабораторные исследования (пп.6.1.2 и 6.1.3) проводятся в других Региональных центрах по мониторингу за возбудителями II-IV групп патогенности по согласованию с Референс-центром по иерсиниозам (Региональные опорные базы-консультантов). Лаборатории данных центров должны соответствовать требованиям, изложенным в п.5.1.1.

Культуры Y.pseudotuberculosis и патогенных Y.enterocolitica от людей, грызунов и объектов окружающей среды, идентифицированные в лабораториях ФБУЗ "ЦГиЭ" в субъекте РФ, Региональных центрах по мониторингу возбудителей II-IV групп патогенности и в Региональных опорных базах - консультантов в федеральных округах передаются в установленном порядке в Референс-центр по иерсиниозам, а для территорий Сибирского и Дальневосточного федеральных округов - в Референс-центр по природно-очаговым инфекционным болезням.

Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с действующими СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов II-IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру (прилож.7 к МУ), сопроводительное письмо и акт передачи патогенных биологических агентов III-IV групп за пределы организации.

 7. Порядок организации и проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях федерального уровня (Референс-центр по мониторингу за иерсиниозами, Референс-центр по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекционных болезней)

 7.1. Требования к лабораториям Референс-центра по мониторингу за иерсиниозами и Референс-центра по мониторингу за

возбудителями природно-очаговых инфекционных болезней*

Согласно п.5.1.1.

 7.2. Номенклатура и объем исследований*

Диагностические лаборатории Референс-центров проводят:

- расширенную идентификацию и изучение биологических, биохимических, молекулярно-генетических характеристик иерсиний, в том числе культур с атипичными свойствами;

- проводят генотипирование иерсиний современными методами;

- проводят исследования клинического материала, проб из объектов окружающей среды и проб полевого материала - на договорной основе;

- оказывают консультативно-методическую помощь по проведению лабораторных исследований на иерсиниозы организациям Роспотребнадзора и здравоохранения в субъектах Российской Федерации;

- обеспечивают повышение профессиональной подготовки специалистов лабораторного звена организаций Роспотребнадзора и здравоохранения при наличии соответствующих разрешительных документов;

- направляют в Государственные коллекции штаммы иерсиний в установленном порядке;

- организуют работы по внешнему контролю качества лабораторных исследований и мониторинга за иерсиниями по согласованию с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

 7.3. Организация и обеспечение деятельности при мониторинге за иерсиниозами*

Материалом для исследования служат культуры иерсиний, в том числе культуры с атипичными свойствами, выделенные в лабораториях территориального (муниципального) и регионального уровней; клинический материал, сыворотка крови больных иерсиниозами и подозрительных на инфекцию лиц, пробы из объектов окружающей среды и полевой материал по эпидпоказаниям и на договорной основе.

При исследовании культур возбудителей иерсиниозов, в том числе культур с атипичными свойствами, используют биологические и современные высокотехнологичные методы бактериологического, иммуносерологического и молекулярно-генетического анализа, а также современные серологические методы исследования сывороток крови больных иерсиниозами и подозрительных на эти инфекции, обследуемых по эпидпоказаниям.

Порядок исследования клинического материала, проб из объектов окружающей среды, мелких млекопитающих на иерсиниозы соответствуют п.5.1.3.

Идентификация поступивших культур осуществляется по полной схеме:

- характерная морфология колоний;

- изучение биохимических свойств на расширенной биохимической панели, определение биотипа Y.enterocolitica;

- постановка развернутой реакции агглютинации с иерсиниозными агглютинирующими сыворотками (к Y.enterocolitica серотипов О:3; О:5,27; О:8; О:9 и др.; к Y.pseudotuberculosis серотипов О:1, О:3);

- определение детерминант патогенности в ПЦР (гены "острова высокой патогенности" HPI; "острова патогенности" YAPI; гены адгезии - инвазии inv, ail, гены энтеротоксинов ystA, ystB, гены плазмиды вирулентности иерсиний);

- определение чувствительности к антибиотикам (диско-диффузионным методом, методом разведений в агаре и бульоне);

- определение плазмидного спектра выделенных штаммов;

- определение серо- генотипа ПЦР (в случае отсутствия диагностических сывороток);

- электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) - определение пульсотипа;

- мультилокусный вариабельный анализ (MLVA);

- определение вирулентности

Y.pseudotuberculosis

(определение LD

при пероральном заражении белых мышей с помощью зонда; постановка кератоконъюнктивальной пробы на морских свинках).

При идентификации культур иерсиний с атипичными свойствами используют дополнительные биохимические, серологические, иммунологические и другие методы для подтверждения принадлежности культур к роду Yersinia и известным видам:

- расширенная панель биохимических тестов;

- ПЦР с использованием дополнительных специфических праймеров;

- постановка иммуносерологических реакций с использованием моноклональных антител.

Окончанием идентификации должно быть составление молекулярного профиля возбудителя.

 7.4. Порядок взаимодействия лабораторий Референс-центра по мониторингу за иерсиниозами с организациями Роспотребнадзора*

Информация об идентифицированных культурах иерсиний направляется в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II-IV групп патогенности по согласованию с Референс-центром по иерсиниозам. Оригинальные штаммы иерсиний, идентифицированные в бактериологических лабораториях Референс-центров, передаются в Государственную коллекцию штаммов микроорганизмов Национального центра верификации диагностической деятельности ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб" Роспотребнадзора.

Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру в одном экземпляре, сопроводительное письмо, акт передачи патогенных биологических агентов III-IV групп за пределы организации.

Приложение 1

 Подготовка кадров по лабораторным исследованиям иерсиниозов

N п/п	Перечень бактериоло- гических лабораторий с учётом уровней	Уровни подготовки
		Профессиональная переподготовка по специальности "Бактериология" ("Лабораторное дело") (не менее 500 ч)		Повышение квалификации каждые 5 лет (не менее 144 ч)		Сертифика- ционный цикл		Другие виды подготовки (тематические семинары, рабочие места в лабораториях Референс-центрах   (по согласованию)
		врачи, биологи	лабо- ранты	врачи, биологи	лабо- ранты	врачи	лабо- ранты	врачи, биологи	лабо- ранты
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Территориальный уровень
1	ЛПО	+	+	+	+	+	+	+*	+*
2	Филиалы (отделения) ФБУЗ ЦГиЭ	+	+	+	+	+	+	+*	+*
3	ФБУЗ ЦГиЭ	+	+	+	+	+	+	+*	+*
Региональный уровень
1	Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II-IV групп патогенности	+	+	+	+	+	+	-	-
2	Опорные базы - консультантов, сотрудничающие по согласованию с Референс-центром по иерсиниозам	+	+	+	+	+	+	-	-
Федеральный уровень
1	Референс-центр по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекционных болезней	+	+	+	+	+	+	-	-
	Референс-центр по мониторингу за иерсиниозами	+	+	+	+	+	+	-	-
+ - обязательный уровень подготовки;   - - не требуется подготовка для такого уровня; * - подготовка для такого уровня рекомендуется, но не является обязательной

     Приложение 2

 Требования к профессиональным навыкам специалистов, осуществляющих лабораторные исследования иерсиниозов

1. Требования к знаниям и умениям специалистов МО, выполняющих исследования на иерсиниозы

1.1. Врачи-бактериологи, врачи-лаборанты ПЦР-лаборатории должны знать:

- основные положения клинико-эпидемиологических проявлений иерсиниозов и характеристику иерсиний, особенности лабораторного обследования больного в соответствии с клиническими формами заболеваний;

- нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;

- требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на заражённость возбудителями III-IV групп патогенности;

- порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;

- порядок доставки, приёма, регистрации клинического материала;

- порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование (подготовка диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовка клинического материала);

- этапы лабораторного исследования;

- методы лабораторного исследования;

- морфологические, культуральные, серологические, биохимические, вирулентные, молекулярно-биологические свойства иерсиний;

- порядок работы на лабораторном оборудовании;

- порядок выдачи результатов лабораторного исследования;

- порядок, сроки передачи культур иерсиний в специализированную лабораторию для дальнейшего изучения;

- требования биологической безопасности при передаче ПБА.

1.2. Врачи-бактериологи должны уметь:

- проводить отбор типичных для иерсиний колоний с питательных сред;

- проводить пересев колоний на полиуглеводные среды;

- проводить биотипирование выделенных культур Y.enterocolitica;

- проводить с выделенными культурами Y.enterocolitica РА с сывороткой к вирулентным иерсиниям;

- проводить учёт полученных морфологических, культуральных, серологических, биохимических, вирулентных свойств исследуемого микроорганизма;

- проводить учёт серологического исследования крови;

- выдавать ответ по результатам исследований;

- готовить культуры, материал для передачи в специализированную лабораторию;

- вести необходимую документацию.

1.3. Врачи-лаборанты ПЦР-лаборатории должны уметь:

- готовить рабочее место для проведения ПЦР-исследования;

- проводить выделение нуклеиновых кислот, амплификацию, учёт результатов;

- проводить обеззараживание рабочего места после окончания работ;

- выдавать ответ по результатам исследований;

- вести необходимую документацию.

1.4. Лаборанты-бактериологи должны знать:

- нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;

- требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на заражённость возбудителями III-IV групп патогенности;

- порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;

- порядок доставки, приёма, регистрации клинического материала;

- порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование (подготовка диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовка клинического материала);

- этапы лабораторного исследования;

- методы лабораторного исследования;

- порядок работы на лабораторном оборудовании.

1.5. Лаборанты-бактериологи должны уметь:

- принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований доставки клинического материала;

- проводить подготовку диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовку клинического материала;

- выполнять первичные посевы клинического материала, пересевы со сред обогащения, проведение биохимических тестов;

- выполнять постановку серологических реакций (РА, ИФА, РНГА);

- готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать посевы, биологические отходы;

- готовить культуры, материал для передачи в специализированную лабораторию;

- готовить рабочие места врача и лаборанта, после окончания работ проводить обеззараживание;

- вести необходимую документацию.

1.6. Лаборанты ПЦР-лаборатории должны уметь:

- принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований забора, доставки клинического материала;

- готовить рабочее место для проведения ПЦР-исследования;

- проводить пробоподготовку клинического материала;

- проводить выделение нуклеиновых кислот;

- проводить обеззараживание рабочего места после окончания работ;

- готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать биологические отходы.

2. Требования к знаниям и умениям специалистов филиалов (отделения*) ФБУЗ ЦГиЭ, выполняющих исследования на иерсиниозы

2.1. Врачи-бактериологи должны знать:

- основные положения эпидемиологического надзора за иерсиниозами, в том числе контингент обследуемых, клинические формы заболеваний, виды исследуемых проб из объектов окружающей среды;

- нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;

- требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на заражённость возбудителями III-IV групп патогенности;

- порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;

- порядок доставки, приема, регистрации клинического материала, проб из объектов окружающей среды;

- порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование (подготовка диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовка материала);

- этапы лабораторного исследования;

- методы лабораторного исследования;

- морфологические, культуральные, серологические, биохимические, вирулентные свойства иерсиний;

- порядок работы на лабораторном оборудовании;

- порядок выдачи результатов лабораторного исследования;

- порядок, сроки передачи культур иерсиний в специализированную лабораторию для дальнейшего изучения;

- требования биологической безопасности при передаче ПБА в другую организацию.

2.2. Врачи-бактериологи должны уметь:

- проводить отбор типичных для иерсиний колоний с питательных сред;

- проводить пересев колоний на полиуглеводные среды;

- проводить биотипирование выделенных культур Y.enterocolitica;

- проводить с выделенными культурами Y.enterocolitica PA с сывороткой к вирулентным иерсиниям;

- проводить учёт полученных морфологических, культуральных, серологических, биохимических свойств и маркеров вирулентности исследуемого микроорганизма;

- проводить учёт серологического исследования крови;

- выдавать ответ по результатам исследований;

- готовить культуры, материал для передачи в специализированную лабораторию;

- вести необходимую документацию.

2.3. Лаборанты должны знать:

- нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;

- требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на заражённость возбудителями III-IV групп патогенности;

- порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;

- порядок доставки, приёма, регистрации клинического материала, проб из внешней среды;

- порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование;

- этапы лабораторного исследования;

- методы лабораторного исследования;

- порядок работы на лабораторном оборудовании.

2.4. Лаборанты должны уметь:

- принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований доставки клинического материала;

- проводить подготовку диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовку исследуемого материала;

- выполнять первичные посевы клинического материала, пересевы со сред обогащения, проведение биохимических тестов, тестов на маркеры вирулентности иерсиний - аутоагглютинации, кальцийзависимости;

- выполнять постановку серологических реакций (РА, ИФА, РНГА);

- готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать посевы, биологические отходы;

- готовить рабочие места врача и лаборанта, после окончания работ проводить обеззараживание;

- готовить культуры, материал для передачи в специализированную лабораторию;

- вести необходимую документацию.

3. Требования к знаниям и умениям специалистов региональных центров по мониторингу за возбудителями (II-IV групп патогенности), ФБУЗ ЦГиЭ, выполняющих исследования на иерсиниозы

3.1. Врачи-бактериологи должны знать:

- основные положения эпидемиологического надзора за иерсиниозами, в том числе контингенты обследуемых, клинические формы заболеваний, виды исследуемых проб от людей, из объектов окружающей среды;

- порядок организации и обеспечения консультативной и практической помощи лабораториям ЛПУ, филиалов (отделения) ФБУЗ ЦГиЭ, ФБУЗ ЦГиЭ территориального уровня;

- нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;

- требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на заражённость возбудителями III-IV групп патогенности;

- порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;

- порядок доставки, приёма, регистрации клинического материала, проб из внешней среды;

- порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование (подготовка диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовка материала);

- этапы лабораторного исследования;

- методы лабораторного исследования;

- морфологические, культуральные, серологические, биохимические, вирулентные, молекулярно-биологические свойства иерсиний;

- порядок работы на лабораторном оборудовании;

- порядок выдачи результатов лабораторного исследования;

- порядок, сроки передачи культур иерсиний в Референс-центр по иерсиниозам для дальнейшего изучения;

- требования биологической безопасности при передаче ПБА в другую организацию.

3.2. Врачи-бактериологи должны уметь:

- проводить отбор типичных для иерсиний колоний с питательных сред;

- проводить посев на полиуглеводные среды;

- проводить типирование выделенных культур Y.enterocolitica на наличие маркеров вирулентности;

- проводить с выделенными культурами Y.enterocolitica РА с сывороткой к вирулентным иерсиниям;

- проводить серологическое типирование культур иерсиний;

- проводить учёт полученных морфологических, культуральных, серологических, биохимических свойств и маркеров вирулентности исследуемого микроорганизма;

- проводить учёт серологического исследования крови;

- выдавать ответ по результатам исследований;

- готовить культуры, материал для передачи в лаборатории Регионального центра по мониторингу за возбудителями I-II группы патогенности, Референс-центр по иерсиниозам;

- вести необходимую документацию.

3.3. Врачи ПЦР-лаборатории должны уметь:

- готовить рабочее место для проведения ПЦР-исследования;

- проводить выделение нуклеиновых кислот, амплификацию, учёт результатов;

- проводить обеззараживание рабочего места после окончания работ;

- выдавать ответ по результатам исследований;

- вести необходимую документацию.

3.4. Лаборанты должны знать:

- нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;

- требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на заражённость возбудителями III-IV групп патогенности;

- порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;

- порядок доставки, приёма, регистрации клинического материала;

- порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование;

- этапы лабораторного исследования;

- методы лабораторного исследования.

3.5. Лаборанты-бактериологи должны уметь:

- принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований забора, доставки клинического материала;

- проводить подготовку диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовку клинического материала;

- выполнять первичные посевы клинического материала, пересевы со сред обогащения, проведение биохимических тестов, тестов на маркеры вирулентности иерсиний - аутоагглютинации, кальцийзависимости;

- выполнять постановку серологических реакций (РА, ИФА, РНГА);

- готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать посевы, биологические отходы;

- готовить рабочие места врача и лаборанта, после окончания работ проводить обеззараживание;

- вести необходимую документацию.

3.6. Лаборанты ПЦР-лаборатории должны уметь:

- принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований забора, доставки клинического материала;

- готовить рабочее место для проведения ПЦР-исследования;

- проводить пробоподготовку клинического материала;

- проводить обеззараживание рабочего места после окончания работ;

- готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать биологические отходы.

4. Требования к знаниям и умениям специалистов МО, ФБУЗ ЦГиЭ (филиалов, отделения филиалов), осуществляющих отбор клинического материала, проб объектов окружающей среды для исследования на иерсиниозы

4.1. Специалисты должны знать:

- основные положения эпидемиологического надзора за иерсиниозами, в том числе контингенты обследуемых, клинические формы заболеваний, виды исследуемых проб от людей, из объектов окружающей среды;

- нормативные документы, регламентирующие забор материала, проб для исследований на иерсиниозы;

- требования биологической безопасности при заборе, доставке материала, подозрительного на заражённость возбудителями III-IV групп патогенности;

- порядок доставки клинического материала, проб из внешней среды;

- порядок заполнения сопроводительной документации.

4.2. Специалисты должны уметь:

- проводить отбор проб от людей, из объектов окружающей среды;

- заполнять сопроводительную документацию;

- доставлять клинический материал, пробы из внешней среды в лабораторию в соответствии с требованиями.

Приложение 3

 Питательные среды, используемые для проведения лабораторных исследований на иерсиниозы

N п/п	Наименование питательных сред	Территориальный уровень			Региональный уровень		Федеральный уровень
		МО	Филиалы (отде- ления) ФБУЗ "ЦГиЭ"	ФБУЗ "ЦГиЭ"	Регио- нальные центры по мони- торингу за возбуди- телями инфекци- онных болезней II-IV групп патоген- ности	Опорные базы - консультантов, сотрудни- чающие по согласованию с Референс-центром по иерси- ниозам	Референс-центр по монито- рингу за возбудителями природно- очаговых инфекцион- ных болезней	Референс-центр по мониторингу за иерси- ниозами
1	2	3	5	6	7	8	9	10
1	Мясопептонный бульон РН 7,6-7,8	+	+	+	+	+	+	+
2	Бульон Хоттингера	+	+	+	+	+	+	+
3	Мясопептонный агар	+	+	+	+	+	+	+
4	Агар Хоттингера	+	+	+	+	+	+	+
5	Фосфатно-буферный раствор РН 7,6-7,8	+	+	+	+	+	+	-
6	Пептонно-калиевая среда рН 7,6-7,8	+	+	+	+	+	+	+
7	Транспортная среда Кузнецова РН 7,2-7,4*’ **	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-
8	Питательная среда для определения чувствительности к антибактериальным препаратам (АГВ)	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
9	Среда Эндо**	+	+	+	+	+	+	+
10	Среда с бромтимоловым синим (СБТС)**	+	+	+	+	+	+	+
11	Полужидкий агар (0,2-0,4%) для определения подвижности	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
12	Среда Мак Конки**	+	+	+	+	+	+	+
13	Бульон Кларка	-	-	-	-	+	+	+
14	УСС (универсальный скошенный столбик)***	+	+	+	+	+	+	+
15	Трехсахарный агар с мочевиной (среда Олькеницкого)***	+	+	+	+	+	+	+
16	Трехсахарный агар с мочевиной (среда Ресселя I)*’ ***	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-
17	Трехсахарный агар с сахарозой и маннитом (среда Ресселя II)*’ ***	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-
18	Среда с мочевиной для определения уреазы	+	+	+	+	+	+	+
19	Среда для определения гидролиза эскулина	+	+	+	+	+	+	+
20	Среда с орнитином для определения орнитиндекарбоксилазы	-	-	-	-	+	+	+
21	Среда с фенилаланином	+	+	+	+	+	+	+
22	Среда с лизином для определения лизиндекарбоксилазы	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
23	Среда для определения липазы	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
24	Среда для определения индолобразования	+	+	+	+	+	+	+
25	Среда Симмонса для определения способности утилизировать цитрат	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
	Среды Гисса для определения ферментации углеводов
26	Среда Гисса с сахарозой	+	+	+	+	+	+	+
27	Среда Гисса с рамнозой	+	+	+	+	+	+	+
28	Среда Гисса с раффинозой	+	+	+	+	+	+	+
29	Среда Гисса с трегалозой	+	+	+	+	+	+	+
30	Среда Гисса с сорбитом	+	+	+	+	+	+	+
31	Среда Гисса с ксилозой	+	+	+	+	+	+	+
32	Среда Гисса с салицином	+	+	+	+	+	+	+
33	Среда Гисса с маннитом	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
34	Среда Гисса с сорбозой	-	-	-	-	+	+	+
35	Среда Гисса с мальтозой	-	-	-	-	+	+	+
36	Среда Гисса с мелибиозой	-	-	-	-	+	+	+
+ - обязательное использование данных сред.   +/- - использование данных сред рекомендовано, но не является обязательным.   - - не используются.   * Возможно применение данных сред при наличии в лабораториях ингредиентов для приготовления.   ** Используется любая из предложенных сред или другие среды для выращивания иерсиний коммерческого изготовления, разрешённые к применению на территории Российской Федерации. *** Используется любая из предложенных полиуглеводных сред или другие дифференциальные иерсиниозные среды, в том числе коммерческого изготовления, разрешённые к применению на территории Российской Федерации

Приложение 4

 Диагностические препараты, тест-системы, используемые для проведения лабораторных исследований на иерсиниозы

Приложение 5

 Химические реактивы, используемые для проведения лабораторных исследований на иерсиниозы

N п/п	Наименование химических реактивов	Территориальный уровень			Региональный уровень		Федеральный уровень
		МО	Филиалы (отде- ления) ФБУЗ "ЦГиЭ"	ФБУЗ "ЦГиЭ"	Регио- нальные центры по мони- торингу за возбуди- телями инфекци- онных болезней II-IV групп патоген- ности	Опорные базы - консуль- тантов, сотрудни- чающие по согласо- ванию с Референс-центром по иерси- ниозам	Референс-центр по монито- рингу за возбудителями природно- очаговых инфекционных болезней	Референс-центр по мониторингу за иерси- ниозами
1	2	3	4	5	6	7	8	9
1	Андредо	+	+	+	+	+	+	+
2	Бриллиантовый зелёный	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
3	Бромтимоловый синий	+	+	+	+	+	+	+
4	Генциан-виолет	+	+	+	+	+	+	+
5	Конго красный	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
6	Метиленовый синий	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
7	Феноловый красный	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
8	Фуксин	+	+	+	+	+	+	+
9	Сахароза	+	+	+	+	+	+	+
10	Рамноза	+	+	+	+	+	+	+
11	Раффиноза	+	+	+	+	+	+	+
12	Сорбит	+	+	+	+	+	+	+
13	Ксилоза	+	+	+	+	+	+	+
14	Сорбоза	-	-	-	-	+	+	+
15	Фукоза	-	-	-	-	+	+	+
16	Мальтоза	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
17	Мелибиоза	-	-	-	-	+	+	+
18	Крахмал	+	+	+	+	+	+	+
19	Маннит	+	+	+	+	+	+	+
20	Глюкоза	+	+	+	+	+	+	+
21	Лактоза	+	+	+	+	+	+	+
22	Салицин	+	+	+	+	+	+	+
23	Эскулин	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
24	Трегалоза	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
25	Орнитин	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
26	Цистин	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
27	Фенилаланин	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
28	-нафтол	+	+	+	+	+	+	+
29	Диметилпарафенилен- диамин (тетраметилпа- рафенилендиамин, оксалат)	+/-	+/-	+/-	+	+	+	+
30	Тиосульфат натрия	+	+	+	+	+	+	+
31	Йод кристаллический	+	+	+	+	+	+	+
32	Сернисто-кислый натрий	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
33	Хлористый натрий	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
34	Калия гидрофосфат	+	+	+	+	+	+	+
35	Тринатрий фосфат*	+	+	+	+	+	+	+
36	Хлористый натрий					+	+	+
37	Гидроокись калия*	+	+	+	+	+	+	+
38	Молибденово-кислый аммоний	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
39	Углекислый натрий безводный	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
40	Железо-аммонийные квасцы	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
41	Мочевина	+	+	+	+	+	+	+
42	Танин	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
43	Леворин	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
44	Грамицидин	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
45	Желчь	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+	+
46	Масло вазелиновое	+	+	+	+	+	+	+
47	Масло иммерсионное	+	+	+	+	+	+	+
48	Масло иммерсионное нефлуоресцирующее	+/-	-	+	+	+	+	+
49	Спирт этиловый	+	+	+	+	+	+	+
50	Глицерин	+	+	+	+	+	+	+
51	Хлорамин или другие дезинфектанты, активные в отношении иерсиний, разрешённые к применению на территории РФ	+	+	+	+	+	+	+
52	ДП-2Т	+/-	-	+	+	+	+	+
+ - обязательное использование данных средств.   +/- - использование данных средств рекомендовано, но не является обязательным. - - не используются

Приложение 6

 Приборы и оборудование, используемые для проведения лабораторных исследований на иерсиниозы