ГОСТ Р 53400-2009 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод подсчета колоний Clostridium perfringens.

ГОСТ Р 53400-2009

(ИСО 7937:2004)

Группа Н00

 НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ

 Метод подсчета колоний Clostridium perfringens

 Method microbiology of food and animal feeding stuffs. Method of Clostridium perfringens colonies count

ОКС 67.040,

         65.120

Дата введения 2011-07-01

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") и Государственным учреждением "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Российской академии медицинских наук (ГУ "НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" РАМН) на основе аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 сентября 2009 г. N 423-ст

4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 7937:2004 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета Clostridium perfringens. Метод подсчета колоний" (ISO 7937:2004 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens - Colony-count technique"). При этом в него не включены предисловие, отдельные слова и фразы примененного международного стандарта, которые нецелесообразно применять в национальной стандартизации. Дополнительные слова, фразы, абзацы, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены курсивом*.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2004 (пункт 3.5).

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам Российской Федерации, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок, приведены в приложении В

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

      1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод подсчета жизнеспособных микроорганизмов Clostridium perfringens.

Настоящий стандарт применяется при исследовании продуктов, предназначенных для употребления в пищу человеком, и кормов для животных, а также образцов окружающей среды в местах производства и оборота пищевых продуктов.

      2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 7218-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие правила микробиологических исследований

ГОСТ Р ИСО 11133-1-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории

ГОСТ Р ИСО 11133-2-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред

ГОСТ Р 51426-99 (ИСО 6887-83) Микробиология. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Общее руководство по приготовлению разведений для микробиологических исследований

ГОСТ Р 51448-99 (ИСО 3100-2-88) Мясо и мясные продукты. Методы подготовки проб для микробиологических исследований

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

      3 Термины и определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 Clostridium perfringens (С.perfringens): Бактерии, которые образуют типичные колонии (черный осадок, вызванный разложением сульфита до сульфида, который окрашивает колонии в черный цвет) в определенных селективных средах, и которые дают положительные реакции подтверждения, если испытания проводят в соответствии с одним из двух методов, указанных в настоящем стандарте.

3.2

подсчет

колоний

С.perfringens:

Определение количества способных к росту и подтвержденных бактерий Clostridium perfringens в см

или г образца при условии проведения испытания в соответствии с методом, указанным в настоящем стандарте.

      4 Сущность метода *

4.1 Посев в чашки Петри определенного количества испытуемой пробы, если исходный продукт жидкий, или установленного количества исходной суспензии.

Следующий посев в чашки Петри проводят в аналогичных условиях с использованием десятикратного разведения испытуемой пробы или исходной суспензии.

Добавляют селективную среду (метод пластинчатого посева) и заливают посев сверху слоем той же среды.

4.2 Анаэробная инкубация чашек при 37 °С в течение (20±2) ч.

4.3 Подсчет типичных колоний.

4.4 Подтверждение ряда типичных колоний и определение количества колоний С.perfringens в г или см

продукта.

      5 Разведение, питательные среды и реактивы*

В лабораторной практике используют ГОСТ Р ИСО 7218, ГОСТ Р 51448, ГОСТ Р ИСО 11133-1 и ГОСТ Р ИСО 11133-2 для приготовления, производства, проверки и применения питательных сред.

5.1 Разведения

В общем случае разведения по ГОСТ Р ИСО 7218.

5.2 Сульфит-циклосериновый агар (SC)

5.2.1 Состав в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1

Состав	Значение показателя
Ферментативный белковый гидролизат, г	15,0
Ферментативный соевый гидролизат, г	5,0
Дрожжевой экстракт, г	5,0
Двунатрий дисульфит безводный (Na S O ), г	1,0
Железо (III) - аммония цитрат*, г	1,0
Агар, г	От 9,0 до 18,0**
Вода, см	1000
* Реактив должен содержать не менее 15% железа (массовая доля).     ** В зависимости от гелеобразующей способности агара.

5.2.1.1 Приготовление среды

Растворяют компоненты среды в горячей воде и доводят до кипения. Устанавливают уровень рН, чтобы после стерилизации он соответствовал (7,6±0,2) при 25 °С.

Разливают среду во флаконы или бутылки соответствующей емкости.

Стерилизуют в автоклаве (см. 6.1) 15 мин при 121 °С.

Хранят в холодильнике при температуре (5±3) °С не более двух недель после приготовления.

5.2.2 Раствор D-циклосерина

5.2.2.1 Состав в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2

Состав	Значение показателя
D-циклосерин*, г	4,0
Вода, см	100
* Используется белый кристаллический порошок.

5.2.2.2 Приготовление среды

Растворяют D-циклосерин в воде и стерилизуют.

Среду хранят в холодильнике при температуре (3±2) °С не более четырех недель после приготовления.

5.2.3 Полная среда

Непосредственно перед посевом чашечным методом (см. 9.2) добавляют 1 см

раствора D-циклосерина (см. 5.2.2) к каждой порции стерильной расплавленной основы среды объемом 100 см

(см. 5.3.1), охлажденной до 44

°

С - 47 °С.

5.2.4 Проверка качества среды (SC)

Определение селективности и качества среды проводят по ГОСТ Р ИСО 11133-1. Для проверки характеристик применяют ГОСТ Р ИСО 11133-2 (таблица В.1).

5.3 Жидкая тиогликолатная среда

5.3.1 Состав в соответствии с таблицей 3.

Таблица 3

Состав	Значение показателя
Ферментативный перевар казеина, г	10,0
L-Цистин, г	0,5
D-Глюкоза, г	5,5
Дрожжевой экстракт, г	5,0
Хлорид натрия, г	2,5
Натрия тиогликолат (меркаптоацетат), г	0,5
Агар, г	0,5-2,0*
Диазорезорин, г	0,001
Вода, см	1000
* В зависимости от гелеобразующей способности агара.

5.3.2 Растворяют компоненты в воде, при необходимости раствор доводят до кипения. Устанавливают уровень рН, чтобы после стерилизации он соответствовал (7,3±0,2) при 25 °С.

Среду разливают по 10 см

в пробирки 16х160 мм и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 121

°

С.

Перед использованием среда должна быть деаэрирована.

5.3.3 Проверка качества тиогликолатной среды

Определение селективности и качества среды проводят по ГОСТ Р ИСО 11133-1. Для проверки характеристик применяют ГОСТ Р ИСО 11133-2 (см. таблицу В.4).

5.4 Лакто-сульфитная среда (LS) (необязательно)

5.4.1 Основа среды

5.4.1.1 Состав в соответствии с таблицей 4.

Таблица 4

Состав	Значение показателя
Ферментативный перевар казеина, г	5,0
Дрожжевой экстракт, г	2,5
Хлорид натрия, г	2,5
Лактоза, г	10,0
L-Цистин гидрохлорид, г	0,3
D-Глюкоза, г	5,5
Вода, см	1000

5.4.1.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, при необходимости раствор доводят до кипения. Устанавливают уровень рН, чтобы после стерилизации он соответствовал (7,1±0,2) при 25 °С.

Среду разливают по 8 см

в пробирки с обратными трубками Дархема и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 121

°

С.

Среду хранят в холодильнике при температуре (3±2) °С не более четырех недель после приготовления.

5.4.2 Раствор безводного метабисульфита натрия

5.4.2.1 Состав в соответствии с таблицей 5.

Таблица 5

Состав	Значение показателя
Двунатрий дисульфит (Na S O ) безводный, г	1,2
Вода, см	100

5.4.2.2 Приготовление

Растворяют двунатрий дисульфит в воде и стерилизуют.

Раствор используют в течение дня.

5.4.3 Раствор цитрата железа (III) - аммония

5.4.3.1 Состав в соответствии с таблицей 6.

Таблица 6

Состав	Значение показателя
Железа (III) - аммония цитрат, г	1,0
Вода, см	100

5.4.3.2 Приготовление раствора

Растворяют цитрат железа (III) - аммония в воде и стерилизуют раствор фильтрованием.

Раствор используют в течение дня.

5.4.4 Полная среда

Перед составлением полной среды ее деаэрируют нагреванием и последующим быстрым охлаждением. В случае хранения среды во флаконах с завинчивающимися крышками крышки ослабляют перед нагреванием и затем завинчивают перед охлаждением.

Затем к каждым 8 см

основы среды (см. 5.4.1) добавляют 0,5 см

раствора цитрата железа (III) - аммония (см. 5.4.3) и 0,5 см

раствора двунатрия дисульфита (см. 5.4.2).

Среда используется в течение дня.

5.5 Подвижная нитратная среда (необязательно)

5.5.1 Состав в соответствии с таблицей 7.

Таблица 7

Состав	Значение показателя
Ферментативный гидролизат казеина, г	5,0
Мясной экстракт, г	3,0
Галактоза, г	5,0
Глицерин, г	5,0
Азотнокислый калий (KNO ), г	1,0
Динатрийфосфат (Na HPO ), г	2,5
Агар, г	1,0-5,0*
Диазорезорин, г	0,001
Вода, см	1000
* В зависимости от гелеобразующей способности агара.

5.5.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, при необходимости раствор доводят до кипения. Устанавливают уровень рН, чтобы после стерилизации он соответствовал (7,3±0,2) при 25 °С.

Среду разливают в пробирки с выросшей разводкой-культурой по 10 см

и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 121

°

С. Если среду не использовали в день приготовления, то ее хранят в холодильнике при температуре (5

±3) °

С не более четырех недель после приготовления.

Непосредственно перед использованием подогревают в кипящей воде или на пару в течение 15 мин и затем быстро охлаждают до температуры разведения.

5.6 Нитратный реактив обнаружения (необязательно)

5.6.1 Раствор 5-амино-2-нафталинсульфокислоты (5-2-ANSA)

Растворяют 0,1 г 5-2-ANSA в 100 см

15%-ного (объемная доля) раствора уксусной кислоты. Фильтруют через бумажный фильтр.

Реактив хранят в хорошо закупоренном флаконе (предпочтительно с капельницей шаровидной формы) в холодильнике при температуре (5±3) °С.

5.6.2 Раствор сульфаниловой кислоты

Растворяют 0,4 г сульфаниловой кислоты в 100 см

15%-ного (объемная доля) раствора уксусной кислоты. Фильтруют через бумажный фильтр.

Реактив хранят в хорошо закупоренном флаконе (предпочтительно с капельницей шаровидной формы) в холодильнике при температуре (5±3) °С.

5.6.3 Приготовление полного реактива

Смешивают равные количества двух растворов (см. 5.6.1 и 5.6.2) непосредственно перед использованием. Неиспользованный реактив уничтожают.

5.7 Цинковая пыль (необязательно)

5.8 Лактозо-желатиновая среда

5.8.1 Состав в соответствии с таблицей 8.

Таблица 8

Состав	Значение показателя
Ферментативный гидролизат казеина, г	15,0
Дрожжевой экстракт, г	10,0
Галактоза, г	10,0
Желатин, г	120,0
Фенол красный, г	0,05
Вода, см	1000

5.8.2 Приготовление среды

Растворяют компоненты в воде (кроме лактозы и фенола красного). Устанавливают уровень рН, чтобы после стерилизации он соответствовал (7,5±0,2) при 25 °С.

Добавляют лактозу и фенол красный. Среду разливают в пробирки по 10 см

и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 121

°

С.

Если среду не использовали в день приготовления, то ее хранят в холодильнике при температуре (5

±3) °

С не более трех недель после приготовления.

Непосредственно перед использованием подогревают в кипящей воде или на пару в течение 15 мин и затем быстро охлаждают до температуры разведения.

      6 Оборудование и лабораторная посуда*

Примечание - При одинаковой спецификации одноразовое оборудование предпочтительнее многоразового.

Используют обычное лабораторное оборудование, а также следующее:

6.1 Стерилизаторы сухожаровые (печи) или паровые (автоклавы) по ГОСТ Р ИСО 7218.

6.2 Термостат, поддерживающий температуру (37±1) °С.

6.3 Анаэростат, обеспечивающий культивирование анаэробных микроорганизмов.

6.4 рН-метр с разрешением 0,01 единиц рН и точностью ±0,1 рН при 25 °С.

6.5 Бактериологические петли из платино-иридиевого или никель-хромового сплава, около 3 мм в диаметре, и иглы из тех же материалов для пересева в агаровые косяки.

6.6 Приборы для фильтрования, предназначенные для стерилизации растворов.

6.7 Пробирки размером 16х160 мм с перевернутыми трубками Дархема, длиной 35 мм и диаметром 7 мм.

6.8 Пипетки с полным сливом, номинальным объемом от 1 до 10 см

.

6.9 Чашки Петри, из стекла или пластмассы, диаметром 90-100 мм.

6.10 Водяная баня, поддерживающая температуру от 44 °С до 47 °С.

6.11 Резиновые колбы, используемые с градуированными пипетками для разбрызгивания компонентов нитратного реактива обнаружения (при необходимости).

      7 Отбор проб

В лабораторию направляют представительный образец. Образец не должен быть поврежден или изменен в процессе транспортирования или хранения.

Отбор проб не является частью метода, приведенного в настоящем стандарте. Рекомендуется достижение соглашения заинтересованных сторон касательно отбора проб конкретного продукта при отсутствии специального стандарта для данного продукта.

      8 Подготовка проб для испытания*

Подготовку проб проводят в соответствии со специальным стандартом для данного продукта. Рекомендуется достижение соглашения заинтересованных сторон касательно подготовки проб конкретного продукта при отсутствии специального стандарта на подготовку проб данного продукта.

      9 Проведение определения*

9.1 Метод приготовления исходной суспензии и последующие разведения

Приготовление пробы и первичного разведения в зависимости от вида продукта согласно соответствующей части ГОСТ 26669.

9.2 Посев и инкубирование (чашечный метод)

С помощью стерильной пипетки (см. 6.8) переносят в двух повторностях 1

см

исходной суспензии или испытуемой пробы (если продукт жидкий) в центр пустых чашек Петри (см. 6.9).

Наливают в обе чашки от 10 до 15

см

SC агара (см. 5.2.3), подогретого в водяной бане (см. 6.10) при температуре от 44

°

С до 47

°

С, и хорошо перемешивают с испытуемой пробой, осторожно вращая чашки. После затвердевания среды добавляют сверху 10

см

дополнительно

SC агара.

Оставляют чашки для затвердевания агара. Застывшие чашки агара с исходной пробой помещают в анаэростат или другие приборы, обеспечивающие культивирование анаэробных микроорганизмов, и инкубируют в анаэробных условиях в течение (20±2) ч при температуре 37 °С.

Более продолжительное инкубирование может привести к излишнему почернению среды.

Повторяют процедуру с последующими десятикратными разведениями (см. 9.1).

9.3 Подсчет и выделение колоний

После установленного периода инкубации (см. 9.2) выделяют все чашки Петри, содержащие менее 150 колоний. Из них выделяют чашки с двумя последовательными разведениями. Подсчитывают на каждой чашке характерные колонии, предположительно относящиеся к С.perfringens.

Выделяют из каждой чашки пять типичных колоний и подтверждают их, используя одну из методик, описанных в 9.4.2 или 9.4.3.

9.4 Биохимическое подтверждение

9.4.1 Общие положения

Для целей подтверждения может быть использован набор сред для биохимических испытаний в соответствии с ГОСТ Р ИСО 7218.

9.4.2 Методика подтверждения с использованием среды LS

Примечание - Реакция, протекающая в лактозо-сульфитной среде (см. 5.4) при 46 °С, очень специфична для С.perfringens и С.absonum. Поэтому необязательно добиваться дополнительной очистки черных колоний, выделенных с агаровой среды, перед их посевом на тиогликолатную и затем на лактозо-сульфитную среду.

9.4.2.1 Пересев и инкубирование

Каждую изолированную колонию (см. 9.3) пересевают на жидкую тиогликолатную среду (см. 5.3). Инкубируют в анаэробных условиях в течение 18-24 ч при температуре 37 °С.

9.4.2.2 Обработка результатов

Исследуют пробирку с LS средой, учитывая образование газа и наличие черного окрашивания (осадок сульфита железа). Трубки Дархема, заполненные более чем на одну четвертую часть газом, и пробирки, содержащие черный осадок, оценивают как положительные.

В сомнительных случаях, когда трубка Дархема в пробирке с почерневшей средой заполнена газом менее чем на четверть, без промедления, с помощью стерильной пипетки переносят пять капель культуры с LS средой (см. 9.4.2.1) в другую пробирку с той же средой. Инкубируют на водяной бане (см. 6.10) при температуре от 46 °С в течение 18-24 ч. Оценивают эти пробирки, как описано выше.

Бактерии, которые образуют типичные колонии на LS среде и дают положительную реакцию подтверждения на LS среде, относят к С.perfringens. Во всех прочих случаях пробирки с посевами рассматривают как отрицательные.

9.4.3 Методика подтверждения с использованием подвижной нитратной среды и лактозо-желатиновой среды

9.4.3.1 Общие положения

Для данной методики подтверждения требуются хорошо изолированные типичные колонии. Если их нет (т.е. они чрезмерно разрослись на поверхности чашек, и нет возможности выбрать хорошо изолированные типичные колонии), засевают пять типичных колоний на предварительно деаэрированные жидкие тиогликолатные среды (см. 5.3).

Инкубируют в анаэробных условиях при температуре 37

°

С в течение 18-24 ч. Штрихуют колонии на чашках с основным агаром SC (5.2.1.2) и добавляют сверху 10

см

основного агара SC.

Дают застыть агару и инкубируют в анаэробных условиях при температуре 37 °С в течение 18-24 ч. Потом выбирают из каждой чашки одну типичную и хорошо выделенную колонию.

При необходимости повторяют штрихование и посев на чашки Петри с основным агаром SC до получения хорошо изолированных типичных колоний.

Подтверждают каждую колонию, как описано в 9.4.3.2, 9.4.3.3 и 9.4.3.4.

9.4.3.2 Инокуляция и исследование подвижной нитратной среды

Инокулируют уколом каждую выделенную колонию (см. 9.3) в только что деаэрированную подвижную нитратную среду (см. 5.5).

Инкубируют в анаэробных условиях при 3 °С в течение 24 ч. Исследуют пробирку с подвижной нитратной средой на тип культуры по линии укола. Подвижность очевидна по диффузному распределению бактерий в среду от линии укола.

Проводят испытание на присутствие нитрита, добавляя с помощью градуированной пипетки (см. 6.8) и резиновой колбы (см. 6.11) от 0,2 до 0,5

см

нитритного реактива обнаружения (см. 5.6) в каждую пробирку с подвижной нитратной средой.

Примечание - В целях безопасности проводят это испытание в вытяжном шкафу.

Образование красного цвета подтверждает восстановление нитрата до нитрита. Если красный цвет не появляется в течение 15 мин, добавляют небольшое количество цинковой пыли (см. 5.7) и дают отстояться в течение 10 мин. Если красный цвет не появился после добавления цинковой пыли, восстановления нитрата не произошло.

9.4.3.3 Инокуляция и исследование лактозо-желатиновой среды

Инокулируют каждую выделенную колонию (см. 9.3) в только что деаэрированную лактозо-желатиновую среду (см. 5.8). Инкубируют в анаэробных условиях при 37 °С в течение 24 ч.

Исследуют пробирку с лактозо-желатиновой средой на присутствие газа и желтого цвета (благодаря образованию кислоты), указывающих на ферментацию лактозы. Охлаждают пробирки при 5 °С в течение 1 ч и проверяют на сжижение желатина. Если среда застыла, повторно инкубируют в течение еще 24 ч и снова проверяют на сжижение желатина.

9.4.3.4 Интерпретация

Бактерии, которые образуют черные колонии в среде SC, неподвижны, обычно восстанавливают нитрат до нитрита, вырабатывают кислоту и газ из лактозы и сжижают желатин за 48 ч, относятся к бактериям С.perfringens. Культуры, которые дают слабую реакцию на нитрит (т.е. розового цвета), должны быть ликвидированы, так как бактерии С.perfringens дают сильную и немедленную реакцию.

      10 Обработка результатов

10.1 Метод расчета

Обработка результатов - по ГОСТ Р ИСО 7218.

10.2 Сходимость

10.2.1 Межлабораторные испытания

Данные о сходимости этого метода, описанные в настоящем стандарте, базируются на результатах межлабораторного испытания [1]. Детали этого межлабораторного испытания приведены в приложении А. Предельные значения повторяемости и воспроизводимости определялись на трех видах продуктов, загрязненных на разных уровнях, и на контрольных материалах.

Значения, полученные на основе этого межлабораторного испытания, не могут применяться к пределам концентраций и матрицам, отличным от приведенных здесь.

10.2.2 Повторяемость

Абсолютная разность между двумя отдельными (

-преобразованными) результатами испытаний (число С.perfringens на г или см

) или отношение большего к меньшему из двух результатов по нормальной шкале, полученных при использовании одного и того же метода, на идентичном испытуемом материале, одним и тем же оператором, использующим одно и то же оборудование, в течение короткого допустимого промежутка времени, будет превышать предел повторяемости (

) не более чем в 5% случаев.

В качестве общего показателя повторяемости (

) при испытании проб пищевых продуктов допускается использовать следующие значения. Эти значения

являются общими для всех матриц, рассматриваемых в процессе межлабораторного испытания:

-

0,21 для подтверждения LS или 0,25 для подтверждения MN/LG (выраженные как разница между

-преобразованными результатами испытания) или

-

1,67 для подтверждения LS или 1,8 для подтверждения MN/LG (выраженные как отношение большего к меньшему из двух результатов испытания).

Для контрольных материалов (см. таблицу А.4) могут применяться следующие значения:

-

0,13 для подтверждения LS или 0,12 для подтверждения MN/LG (выраженные как разница между

-преобразованными результатами испытания) или

-

1,3 для подтверждения LS или 1,8 для подтверждения MN/LG (выраженные как отношение большего к меньшему из двух результатов испытания).

Пример

Получен первый результат 10000 или 1,0х10

предполагаемых бактерий С.perfringens на грамм продукта. В условиях повторяемости отношение большего результата к меньшему не должно быть свыше 1,9. Следовательно, второй результат будет между 5263 (=10000/1,9) и 19000 (10000х1,9) предполагаемых бактерий С.perfringens на грамм.

10.2.3 Воспроизводимость

Абсолютная разность между двумя отдельными (

-преобразованными) результатами испытаний (число С.perfringens на г или

см

) или абсолютное соотношение между результатами двух испытаний по нормальной шкале, полученными при использовании одного и того же метода, на идентичном испытуемом материале в разных лабораториях, разными операторами, использующими различное оборудование, будут превышать предел воспроизводимости (

) не более чем в 5% случаев.

В качестве показателя предела воспроизводимости (

) при испытании различных видов пищевых продуктов и контрольных материалов могут использоваться значения из таблицы 9. Эти значения

являются средними значениями, полученными в результате межлабораторного испытания для различных уровней*.

________________

* В случае данного межлабораторного испытания значения воспроизводимости, которые должны быть выражены как общее значение, применимое ко всем пробам продуктов, очень сильно отличаются между пробами.

Таблица 9 - Примеры значений для

Вид пробы	Подтверждение LS		Подтверждение MN и LG
	*	**	*	**
Сыр	0,26	1,8	0,31	2,1
Мясо	0,55	3,5	0,52	3,3
Сухой корм для животных	0,65	4,5	0,72	5,3
Контрольный материал	0,27	1,9	0,29	1,9
* - предел воспроизводимости, выраженный как разность между -трансформированными результатами испытаний.   ** - предел воспроизводимости, выраженный как соотношение между результатами испытаний.

Примеры

1 Во-первых, лаборатория нашла результат испытания, равный 10000 или 1,0х10

С.perfringens на грамм сыра. В условиях воспроизводимости отношение большего результата к меньшему не должно быть свыше 2,1. Следовательно, результат второй лаборатории должен быть между 4761 (=10000/2,1) и 21000 (10000х2,1) предполагаемых бактерий С.perfringens на грамм.

2 Во-вторых, лаборатория хочет знать максимальный уровень, который она может найти и который соответствует установленному уровню (например предел в 100000 или

5). Для этого значение

(0,31х0,59) является разностью между

-трансформированными результатами испытаний, а значение 1,52 (10

) представляет соотношение между результатами испытаний. Следовательно, результаты до

5,18 (

5+

0,18) или 152000 (100000х1,52) не указывают несоответствие пределу. Коэффициент 0,59 отражает тот факт, что испытание с односторонним 95%-ным интервалом проводят для того, чтобы узнать, превышен ли предел. Коэффициент 0,59 вычислен по формуле

.

      11 Протокол испытания

В протоколе испытания указывают:

- всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

- метод отбора пробы, если известен;

- использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

- все детали исследования, не оговариваемые в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, а также детали иного свойства, могущие оказать влияние на результаты исследований;

- полученные результаты.

Приложение А

(справочное)

Результаты межлабораторного испытания

Межлабораторное совместное испытание [1], в котором принимали участие 17 лабораторий из 15 стран, проводилось на пробах сыра, мяса, сухого корма для животных и контрольном материале. Каждая проба пищевых продуктов/кормов для животных была испытана на трех различных уровнях загрязнения бактериями Clostridium perfringens.

В соответствии с [2] в процессе межлабораторного испытания были получены следующие параметры. Испытание было организовано Голландским национальным институтом общественного здоровья (RIVM) в январе 2000 г. и дало данные по сходимости, приведенные в таблицах А.1-А.4.

Таблица А.1 - Результаты анализа данных, полученных на пробах сыра

Проба	Сыр (низкий уровень)	Сыр (средний уровень)	Сыр (высокий уровень)
Число лабораторий с положительными результатами	13	13	13
Число проб	2	2	2
Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов	13	13	13
Число выбросов	0	0	0
Число принятых проб	26	26	26
Среднее значение	2,5/2,5	3,5/3,5	4,5/4,5
Среднеквадратическое отклонение повторяемости	0,11/0,11	0,06/0,07	0,08/0,10
Среднее относительное отклонение повторяемости, %	4,37/4,59	1,63/1,97	1,85/2,31
Предел повторяемости :
- как разность по шкале	0,30/0,32	0,16/0,19	0,23/0,29
- как соотношение по нормальной шкале	2,0/2,1	1,5/1,6	1,7/1,9
Среднеквадратическое отклонение воспроизводимости	0,13/0,13	0,08/0,15	0,11/0,14
Среднее относительное отклонение воспроизводимости, %	5,21/5,11	2,32/4,38	2,50/3,11
Предел повторяемости :
- как разность по шкале	0,36/0,35	0,23/0,43	0,31/0,39
- как соотношение по нормальной шкале	2,3/2,2	1,7/2,7	2,1/2,4
Первый результат был получен с использованием лактозо-желатиновой среды, а второй - с использованием подвижной нитратной и лактозо-желатиновой среды.

Таблица А.2 - Результаты анализа данных, полученных на пробах мясного фарша

Проба	Мясной фарш (низкий уровень)	Мясной фарш (средний уровень)	Мясной фарш (высокий уровень)
Число лабораторий с положительными результатами	13	13	13
Число проб	2	2	2
Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов	13	13	13
Число выбросов	0	0	0
Число принятых проб	26	26	26
Среднее значение	2,7/2,7	3,6/3,6	4,5/4,5
Среднеквадратическое отклонение повторяемости	0,06/0,11	0,06/0,10	0,11/0,09
Среднее относительное отклонение повторяемости, %	2,32/4,22	1,67/2,70	2,33/2,01
Предел повторяемости :
- как разность по шкале	0,18/0,32	0,17/0,27	0,29/0,25
- как соотношение по нормальной шкале	1,5/2,1	1,5/1,9	2,0/1,8
Среднеквадратическое отклонение воспроизводимости	0,14/0,18	0,18/0,18	0,18/0,22
Среднее относительное отклонение воспроизводимости, %	5,01/6,54	5,07/5,05	3,90/4,76
Предел повторяемости :
- как разность по шкале	0,38/0,49	0,51/0,50	0,49/0,60
- как соотношение по нормальной шкале	2,4/3,1	3,2/3,2	3,1/4,0
Первый результат был получен с использованием лактозо-сульфитной среды, а второй - с использованием подвижной нитратной и лактозо-желатиновой среды.

Таблица А.3 - Результаты анализа данных, полученных на пробах сухого корма для животных

Проба	Сухой корм (низкий уровень)	Сухой корм (средний уровень)	Сухой корм (высокий уровень)
Число лабораторий с положительными результатами	13	13	13
Число проб	2	2	2
Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов	13	13	13
Число выбросов	0	0	0
Число принятых проб	25	25	25
Среднее значение	2,6/2,6	3,8/3,9	4,8/4,9
Среднеквадратическое отклонение повторяемости	0,07/0,10	0,08/0,08	0,06/0,04
Среднее относительное отклонение повторяемости, %	2,85/3,79	2,09/1,93	1,22/0,75
Предел повторяемости :
- как разность по шкале	0,21/0,28	0,22/0,21	0,16/0,10
- как соотношение по нормальной шкале	1,6/1,9	1,7/1,6	1,5/1,3
Среднеквадратическое отклонение воспроизводимости	0,32/0,32	0,25/0,24	0,17/0,17
Среднее относительное отклонение воспроизводимости, %	12,21/12,03	6,53/6,18	3,50/3,49
Предел повторяемости :
- как разность по шкале	0,88/0,88	0,69/0,67	0,47/0,47
- как соотношение по нормальной шкале	7,6/7,6	4,9/4,7	3,03/3,0
Первый результат был получен с использованием лактозо-сульфитной среды, а второй - с использованием подвижной нитратной и лактозо-желатиновой среды.

Таблица А.4 - Результаты анализа данных, полученных на контрольном материале

Проба	Контрольный материал
Число лабораторий с положительными результатами	13
Число проб	2
Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов	13
Число выбросов	0
Число принятых проб	26
Среднее значение	3,7/3,7
Среднеквадратическое отклонение повторяемости	0,05/0,5
Среднее относительное отклонение повторяемости, %	1,24/1,21
Предел повторяемости :
- как разность по шкале	0,13/0,12
- как соотношение по нормальной шкале	1,3/1,3
Среднеквадратическое отклонение воспроизводимости	0,09/0,09
Среднее относительное отклонение воспроизводимости, %	2,51/2,39
Предел повторяемости :
- как разность по шкале	0,26/0,25
- как соотношение по нормальной шкале	1,8/1,6
Первый результат был получен с использованием лактозо-сульфитной среды, а второй - с использованием подвижной нитратной и лактозо-желатиновой среды.

Приложение В

(справочное)

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам Российской Федерации, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок

Таблица В.1

________________

* Заменен на ИСО 6887-2:2003.

 Библиография