ГОСТ ISO/TS 10272-2-2013 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 2. Метод подсчета колоний.
ГОСТ ISO/TS 10272-2-2013
Группа H09
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ
Методы обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp.
Часть 2
Метод подсчета колоний
Microbiology of food and animal feeding stuffs. Methods for detection and enumeration of Campylobacter spp.
Part 2. Colony-count technique
МКС 07.100.30
Дата введения - 2014-07-01
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены
ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и
ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС")
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2013 г. N 43)
За принятие проголосовали:
|
|
|
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Казахстан | KZ | Госстандарт Республики Казахстан |
Киргизия | KG | Кыргызстандарт |
Россия | RU | Росстандарт |
Таджикистан | TJ | Таджикстандарт |
Узбекистан | UZ | Узстандарт
|
4
Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июня 2013 г. N 228-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO/TS 10272-2-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 г.
5 Настоящий стандарт идентичен международному документу ISO/TS 10272-2:2006* Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. - Part 2: Colony-count technique (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 2. Метод подсчета колоний)
Международный стандарт разработан подкомитетом SC 9 "Микробиология" технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).
Перевод с английского языка (en).
Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий стандарт, и международных стандартов, на которых даны ссылки, имеются в национальных (государственных) органах по стандартизации указанных выше государств.
Степень соответствия - идентичная (IDT).
Стандарт подготовлен на основе применения
ГОСТ Р 53993-2010/ISO/TS 10272-2:2006
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод подсчета Campylobacter spp.
Настоящий стандарт распространяется:
- на пищевую продукцию и корма для животных;
- пробы окружающей среды в области производства и обращения пищевой продукции.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты*:
ISO 6887 (все части) Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований)
ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs - General requirements and guidance for microbiological examinations (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации для микробиологических исследований)
ISO 8261 Milk and milk products. General guidance for the preparation of tests samples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination (Молоко и молочные продукты. Общие правила приготовления испытуемых проб для анализа, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований)
ISO/TS 11133-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Правила приготовления и производства питательных сред. Часть 1. Общие правила по обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории)
ISO/TS 11133-2 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству питательных сред. Часть 2: Практические руководящие указания по определению эффективности питательных сред)
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 Campylobacter (Campylobacter): Микроорганизмы, образующие характерные колонии на твердой селективной среде, при инкубировании в аэробных условиях при температуре 41,5 °C, но не при температуре 25 °C, и которые обладают характерной подвижностью, биохимическими свойствами и способностью к росту, при условии проведения испытаний в соответствии с настоящим стандартом.
Примечание - Наиболее часто встречающимися видами являются Campylobacter jejuni и Campylobacter coli. Вместе с тем, были описаны и другие виды (Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis и некоторые другие).
3.2 подсчитанное число Campylobacter (count of Campylobacter): Число Campylobacter, обнаруженное в миллилитре или в грамме испытуемой пробы, когда испытания проводят в соответствии с настоящим стандартом.
4 Сущность метода
4.1 Приготовление разведений
Приготовление десятичных разведений на основе испытуемой пробы - по ISO 6887 и ISO 8261.
4.2 Подсчет
Испытуемую пробу наносят на твердую селективную среду, модифицированный агар с углем, цефоперазоном и дезоксихолатом (агар mCCD), если продукт является жидким, или на исходную суспензию в случае других продуктов.
При соблюдении тех же условий приготовляют другие чашки, используя десятикратные разведения испытуемой пробы или исходной суспензии.
Чашки инкубируют при температуре 41,5 °C в аэробных условиях в течение 40-48 ч.
Колонии, предположительно Campylobacter, пересевают на неселективную агаровую среду, колумбийский кровяной агар, затем подтверждают посредством исследования под микроскопом и надлежащего биохимического испытания и теста на контроль роста.
5 Питательные среды и реактивы
5.1 Общие положения
Качество подготовки, изготовления и оценки эффективности питательных сред для выращивания Campylobacter - по ISO 7218, ISO/TS 11133-1 и ISO/TS 11133-2.
5.2 Разбавитель - по ISO 6887.
5.3 Модифицированный агар с углем, цефоперазоном и дезоксихолатом (агар mCCD)
5.3.1 Базовая среда
5.3.1.1 Состав:
мясной экстракт - 10,0 г;
продукт ферментативного переваривания животных тканей - 10,0 г;
натрия хлорид - 5,0 г;
древесный уголь - 4,0 г;
продукт ферментативного переваривания казеина - 3,0 г;
натрия дезоксихолат - 1,0 г;
железа (II) сульфат - 0,25 г;
натрия пируват - 0,25 г;
________________
5.3.1.2 Приготовление
Основные компоненты или полную сухую базовую среду растворяют в воде, доводя до кипения. При необходимости корректируют pH так, чтобы после стерилизации он был равен (7,4±0,2) при температуре 25 °C. Базовую среду переносят в колбы подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121 °C в течение 15 мин.
5.3.2 Раствор антибиотиков
5.3.2.1 Состав:
цефоперазон - 0,032 г;
амфотерицин B - 0,01 г;
5.3.2.2 Приготовление
Компоненты растворяют в воде. Стерилизуют путем фильтрации.
5.3.3 Полная среда
5.3.3.1 Состав:
5.3.3.2 Приготовление
5.3.3.3 Проверка эффективности
Определение селективности и производительности - по ISO 11133-1. Информация о критериях эффективности - в ISО 11133-2, таблица B.5.
5.4 Колумбийский кровяной агар
5.4.1 Базовая среда
5.4.1.1 Состав:
продукт ферментативного переваривания животных тканей - 23,0 г;
крахмал - 1,0 г;
натрия хлорид - 5,0 г;
________________
5.4.1.2 Приготовление
Основные компоненты или полную сухую среду растворяют в воде, доводя до кипения. При необходимости корректируют pH так, чтобы после стерилизации он был равен (7,3±0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Базовую среду переносят в колбы подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121 °C в течение 15 мин.
5.4.2 Стерильная дефибринированная баранья кровь.
5.4.3 Полная среда
5.4.3.1 Состав:
5.4.3.2 Приготовление
5.4.3.3 Проверка эффективности
Определение селективности и производительности сред - по ISO/TS 11133-1. Информация о проверке эффективности - по ISO/TS 11133-2. Контрольные штаммы C. coli ATCC 43478 или C. jejuni ATCC 33291 должны демонстрировать значительный рост на колумбийском кровяном агаре после аэробной инкубации в течение 24 ч при температуре 37 °C.
5.5 Жидкая среда для бруцелл
5.5.1 Состав:
продукт ферментативного переваривания казеина - 10,0 г;
продукт ферментативного переваривания животных тканей - 10,0 г;
глюкоза - 1,0 г;
экстракт из дрожжей - 2,0 г;
натрия хлорид - 5,0 г;
натрия гидросульфит - 0,1 г;
5.5.2 Приготовление
5.5.3 Проверка эффективности
Определение селективности и производительности сред - по ISO/TS 11133-1. Информация о критериях эффективности - в ISO/TS 11133-2, таблица B.4.
5.6 Реактив для обнаружения оксидазы
5.6.1 Состав:
N,N,N’,N’-тетраметил-1,4-фенилендиамина, дигидрохлорид - 1,0 г;
5.6.2 Приготовление
Растворяют данный компонент в воде непосредственно перед использованием.
6 Оборудование и химическая стеклянная посуда
Используют микробиологическое лабораторное оборудование по ИСО 7218 и, в частности, нижеприведенное.
6.1 Оборудование для сухой стерилизации (сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав) по ISO 7218.
6.2 Сушильный шкаф, ламинарный бокс или термостат, способные функционировать в диапазоне температур от 37 °C до 55 °C.
6.3 Термостат, работающий при температуре (41,5±1) °C.
6.4 Термостат, работающий при температуре (25±1) °C.
6.5 Водяная баня, работающая в диапазоне 44 °C - 47 °C.
6.6 pH-метр с точностью 0,1 ед. pH при температуре 25 °C.
6.7 Сосуды, пробирки, колбы, пригодные для стерилизации и хранения разбавителя и питательных сред.
6.8 Чашки Петри, предпочтительно с выемками, стеклянные или пластиковые, диаметром 90-100 мм.
6.10 Резиновые груши или любая другая система безопасности, которую можно адаптировать к градуированным пипеткам.
6.11 Стерильные петли из проволоки платино-иридиевой, никелево-хромовой диаметром приблизительно 3 мм или стеклянная или пластиковая палочка.
Примечание - Никелево-хромовая петля не пригодна для использования в испытании с оксидазой (см. 9.4.3).
6.12 Шпатель, стеклянный или пластиковый.
6.13 Микроскоп, предпочтительно с фазовым контрастом (для наблюдения характерной подвижности Campylobacter).
7 Отбор проб
В лабораторию направляют представительную пробу. Проба не должна быть повреждена или изменена в процессе транспортирования или хранения.
Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Отбор проб проводят в соответствии с конкретным стандартом на данную продукцию. Рекомендуется достижение соглашения заинтересованных сторон по отбору проб конкретного продукта при отсутствии соответствующего стандарта.
Принимая во внимание, что Campylobacter spp. весьма чувствительны к замораживанию, испытуемые пробы следует хранить при температуре (3±2) °C и анализировать в кратчайшие сроки. Принимают меры по предотвращению высыхания проб.
8 Приготовление испытуемой пробы
Испытуемую пробу приготовляют в соответствии с конкретным стандартом на определенные виды продукции. Если не существует конкретного стандарта, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны достигли соглашения по данному вопросу.
9 Методика проведения испытания
9.1 Подготовка пробы, исходной суспензии и разведение - по ISO 6887 и конкретному стандарту на определенные виды продукции.
Приготовляют единичную серию десятикратных разведений на основе испытуемой пробы, если продукция жидкая, или на основе исходной суспензии в случае продукции других видов.
9.2 Посев и инкубация
При необходимости данную процедуру повторяют с последующими десятикратными разведениями.
9.2.2 Чашки (9.2.1) инкубируют при температуре 41,5 °C в течение 40-48 ч в аэробных условиях (6.14).
9.3 Подсчет и отбор колоний для подтверждения
9.3.1 На агаре mCCD типичные колонии имеют сероватый цвет, нередко с металлическим отблеском, они плоские и влажные, с тенденцией к распространению. Размеры колоний уменьшаются на более сухой агаровой поверхности. Могут появиться другие формы колоний.
Отбирают чашки (9.2.2), содержащие менее 150 типичных или подозрительных колоний; эти колонии подсчитывают. Затем отбирают случайным образом пять таких колоний для субкультивирования для проведения подтверждающих испытаний (9.4).
9.3.2 Проводят штриховой посев каждой из отобранных колоний (9.3.1) на чашки с колумбийским кровяным агаром (5.4) с целью содействия развитию изолированных колоний. Чашки инкубируют в аэробных условиях при температуре 41,5 °C в течение 24-48 ч. Для исследования морфологии, подвижности, аэробного роста при температуре 25 °C, аэробного роста при температуре 41,5 °C и наличия оксидазы используют чистые культуры.
9.4 Подтверждение вида Campylobacter
9.4.1 Исследование морфологии и подвижности
9.4.1.2 Для последующих исследований сохраняют все культуры (9.3.2), в которых обнаружены изогнутые бациллы с подвижностью спирального штопора (9.4.1.1).
9.4.2 Исследование аэробного роста при температуре 25 °C и 41,5 °C
Изолированные колонии, указанные в 9.4.1.2, пересевают петлей (6.11) на поверхность обеих чашек с колумбийским кровяным агаром (5.4).
Инкубируют одну чашку при температуре 25 °C в аэробных условиях (6.14) в течение 40-48 ч. Инкубируют вторую чашку при температуре 41,5 °C в аэробных условиях в течение 40-48 ч.
Исследуют чашки на предмет видимого роста колоний Campylobacter.
9.4.3 Обнаружение оксидазы
Используя платиново-иридиевую петлю или стеклянную палочку (6.11), отбирают часть изолированной колонии из каждой отдельной чашки (9.4.1.2) и наносят на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом для обнаружения оксидазы (5.6). Появление лилового, сиреневого или темно-синего цвета в течение 10 с свидетельствует о положительной реакции. Если используется имеющийся в продаже набор для анализа оксидазы, необходимо следовать инструкциям изготовителя.
Результаты подтверждают, используя положительный и отрицательный контроль. Примерами подходящих контрольных штаммов являются Pseudomonas aeruginosa NCTC 10662 (положительный контроль) и Escherichia coli NCTC 9001 (отрицательный контроль).
9.4.4 Интерпретация
Campylobacter spp. дает результаты согласно таблице 1.
Таблица 1 - Характеристики Campylobacter spp.
|
|
Наименование показателя | Характеристика |
Морфология (9.4.1)
| Малые искривленные бациллы |
Подвижность (9.4.1)
| Характерная |
Аэробный рост при 25 °C (9.4.2)
| - |
Аэробный рост при 41,5 °C (9.4.2)
| - |
Оксидаза (9.4.3)
| + |
10 Обработка результатов
10.1 Подсчет колоний Campylobacter
10.1.1 Если подтверждается по крайней мере 80% отобранных колоний (9.4.4), за число Campylobacter принимают число, приведенное в подсчете в соответствии с 9.3.
10.1.2 Во всех остальных случаях рассчитывают числа Campylobacter, которые были получены в соответствии с 9.3 и подтверждены (9.4.4). Результат округляют до целого числа колоний.
10.2 Метод расчета
10.2.1 Общий случай - чашки, содержащие от 15 до 150 колоний презумптивных Campylobacter
|
|
(1) |
Результаты округляют до двух значащих цифр. Это делают следующим образом: в случае, когда третья цифра меньше 5, предыдущую цифру не изменяют; если третья цифра больше или равна 5, предыдущую цифру увеличивают на единицу.
В качестве результата принимают число предпочтительно между 1,0 и 9,9, умноженное на 10 в соответствующей степени или целое число с двумя значащими цифрами.
Результат выражают следующим образом:
Пример - Подсчет дал следующие результаты:
Было проведено испытание отобранных колоний:
- для 66 колоний: пять колоний, четыре из которых согласуются с приведенным критерием а = 66 (см. 10.1.1);
- для 80 колоний: пять колоний, три из которых согласуются с приведенным критерием а = 48;
- для семи колоний: пять колоний, четыре из которых согласуются с приведенным критерием а = 7;
- для четырех колоний: все четыре колонии подтверждены.
10.2.2 Случай двух чашек, содержащих менее 15 колоний
|
|
(2) |
Пример - Подсчет дал следующие результаты:
10.2.3 Случай двух чашек, не содержащих колоний
Если обе чашки при посеве и выдержке в случае испытуемой пробы (жидкий продукт), исходной суспензии (другие виды продуктов) или первого разведения не содержат никаких колоний, результаты выражают следующим образом:
10.3 Прецизионность
Исключительно в силу статистических причин, в 95% случаев, доверительные пределы данного метода подсчета колоний от ±16% до 52% [3]. В случае подсчета колоний, когда их не более 15 в одной чашке, доверительные пределы приведены в приложении A. На практике может иметь место даже больший разброс, особенно среди результатов, полученных различными операторами.
Приложение A
(справочное)
Доверительные пределы для подсчета малых количеств колоний
A.1 Доверительные пределы при уровне 95% для подсчета малых количеств, когда имеющихся колоний не более 15, приведены в таблице А.1.
Таблица A.1
|
|
|
Количество колоний микроорганизмов | Доверительные пределы при уровне 95% | |
| нижний | верхний |
1 | <1 | 2 |
2
| <1 | 4 |
3
| <1 | 5 |
4
| 1 | 6 |
5
| 2 | 9 |
6
| 2 | 10 |
7
| 2 | 12 |
8
| 3 | 13 |
9
| 4 | 14 |
10 | 4 | 16 |
11
| 5 | 18 |
12
| 6 | 19 |
13
| 7 | 20 |
14
| 7 | 21 |
15
| 8 | 23 |
Приложение ДA
(справочное)
Сведения о соответствии ссылочных межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам
Таблица ДА.1
|
|
|
Обозначение и наименование ссылочного международного стандарта | Степень соответствия | Обозначение и наименование соответствующего межгосударственного стандарта |
ISO 6887 (все части)
| - | * |
ISO 7218:2007 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям | IDT | ГОСТ ISO 7218-2008* Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям |
| ||
ISO 8261:2001 Молоко и молочные продукты. Общие правила приготовления проб для анализа, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований
| - | * |
ISO/ТS 11133-1:2000 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Правила приготовления и производства питательных сред. Часть 1. Общие правила по обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории | IDT | ГОСТ ISO 11133-1-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культурных сред в лаборатории
|
ISO/ТS 11133-2:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Правила приготовления и производства питательных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по определению функциональных характеристик питательных сред | IDT | ГОСТ ISO 11133-2-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред
|
* Соответствующий межгосударственный стандарт отсутствует. До его утверждения рекомендуется использовать перевод на русский язык данного международного стандарта. Перевод данного международного стандарта находится в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов.
Примечание - В настоящем стандарте использовано условное обозначение степени соответствия стандарта:
- IDT - идентичные стандарты.
|
________________
Библиография
|
|
[1] | BOLTON, F.J. et al. A blood-free selective medium for the isolation of Campylobacter jejuni from faeces. J. Clin. Microbiol. 19, 1984, pp. 169-171 |
[2] | CORRY, J.E.L. et al. (eds). Handbook of culture media for food microbiology. Progress in Industrial Microbiology. Vol. 37, Elsevier, Amsterdam, 2003 |
[3] | COWELL N.D. and MORISETTI M.D. J. Sci. Fd. Agric. 20, 1969, p. 573 |
[4] | HUNT, J.M. et al. Campylobacter. In: Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, AOAC, Arlington VA, USA, 1998 |
[5] | HUTCHINSON, D.N. and BOLTON, F.J. Improved blood-free selective medium for the isolation of Campylobacter jejuni from faecal specimen. J. Clin. Pathol. 37, 1984, pp. 956-957 |