ГОСТ EN 14122-2020
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКЦИЯ ПИЩЕВАЯ
Определение содержания витамина
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Foodstuffs. Determination of vitamin
by high performance liquid chromatography
МКС 67.050
Дата введения ____________*
Предисловие
Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации (ЕАСС) представляет собой региональное объединение национальных органов по стандартизации государств, входящих в Содружество Независимых Государств. В дальнейшем возможно вступление в ЕАСС национальных органов по стандартизации других государств.
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены".
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН научно-производственным республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации" (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Евразийским советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протоколом от 30 июня 2020 г. N 131-П)
За принятие стандарта проголосовали:
| | |
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения | AM | Минэкономики Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт |
Казахстан | KZ | Госстандарт Республики Казахстан |
Кыргызстан | KG | Кыргызстандарт |
Россия | RU | Росстандарт |
Таджикистан | TJ | Таджикстандарт |
Узбекистан | UZ | Узстандарт |
4 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 14122:2014* "Продукты пищевые. Определение витамина
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" ("Foodstuffs - Determination of vitamin
by high performance liquid chromatography", IDT).
Европейский стандарт разработан техническим комитетом по стандартизации CEN/TC 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы" Европейского комитета по стандартизации (CEN).
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочного европейского стандарта соответствующий ему межгосударственный стандарт, сведения о котором приведены в дополнительном приложении ДА
5 ВЗАМЕН ГОСТ EN 14122-2013
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных (государственных) стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"
Предупреждение - Применение настоящего стандарта может быть связано с проведением опасных операций, использованием вредных веществ, опасного оборудования. В задачи настоящего стандарта не входит решение всех вопросов безопасности, связанных с его применением. Ответственность за соблюдение техники безопасности и установление необходимых ограничений при применении настоящего стандарта несет его пользователь.
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания витамина
в пищевой продукции с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением ферментативной обработки и предколоночной или послеколоночной дериватизации. Данный метод был валидирован в двух межлабораторных исследованиях. В первом исследовании проводился анализ проб цельнозерновой муки, сухого молока/сухого молока, полученного методом распылительной сушки, смеси лиофилизированных овощей и лиофилизированной свиной печени в пределах от 0,295 до 0,807 мг/100 г. Во втором исследовании анализировали пробы раствора для энтерального питания, пищевой продукции для детского питания с овощами, сухого молока, цельнозерновой муки с фруктами, дрожжей, продуктов переработки зерна, шоколадного порошка и биологически активной добавки к пище в диапазоне от 0,11 до 486 мг/100 г. Содержание витамина
представляет собой массовую долю общего тиамина, включая его фосфорилированные производные.
Для получения более подробной информации о валидации см. раздел 8 и приложение B.
2 Нормативные ссылки
Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).
EN ISO 3696, Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (ISO 3696) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)
3 Сущность метода
Тиамин извлекают из пищевой продукции путем кислотного гидролиза с последующим дефосфорилированием, используя ферментативную обработку, и определяют его количество методом ВЭЖХ с предколоночной или послеколоночной дериватизацией до тиохрома. Для количественной оценки используют метод внешнего стандарта. Для получения дополнительной информации см. [1]-[7].
4 Реактивы
Для проведения анализа, если не указано иное, используют только реактивы признанной аналитической чистоты и воду не ниже первой степени чистоты по EN ISO 3696 или бидистиллированную воду.
)
99,8%.
4.2 Раствор уксусной кислоты, 
)=0,02 моль/дм
.
)
98%.
)
99,8%.
4.5 Соляная кислота, w(HCl)=36%.
.
)=0,05 моль/дм
.
99%.
4.9 Раствор гидроксида натрия, массовая концентрация
(NaOH)=150 г/дм
.
4.10 Раствор гидроксида натрия,
(NaOH)=200 г/дм
.
4.11 Гексацианоферрат (III) калия, 
]}
99%.
4.12 Раствор гексацианоферрата (III) калия,
{
]}=10 г/дм
.
4.13 Щелочной раствор гексацианоферрата (III) калия (для предколоночной дериватизации),
{
]}=0,4 г/дм
.
2,0 см
раствора гексацианоферрата (III) калия (см. 4.12) помещают в мерную колбу вместимостью 50 см
и объем содержимого колбы доводят до метки раствором гидроксида натрия (см. 4.9). Раствор готовят в день проведения испытания.
4.14 Щелочной раствор гексацианоферрата (III) калия (для послеколоночной дериватизации),
{
]}=0,5 г/дм
.
2,5 см
раствора гексацианоферрата (III) калия (см. 4.12) помещают в мерную колбу вместимостью 50 см
и объем содержимого колбы доводят до метки раствором гидроксида натрия (см. 4.10).
4.15 Фермент или смесь ферментов, способные высвобождать витамин
из пищевой продукции в виде свободного тиамина.
Примечание 1 - Для получения прецизионных данных, указанных в таблице B.1, была использована така-диастаза, произведенная компанией Pfaltz and Bauer
. Для получения прецизионных данных, указанных в таблицах B.2 и B.3, была использована смесь
-амилазы из ячменя и така-диастазы, произведенной Servа
.
_______________
Информация о поставщиках така-диастазы Pfaltz & Bauer, Уотербери, CT 06708, США (N Т00040) и Serva приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой CEN указанной продукции. Допускается использовать аналогичную продукцию при условии обеспечения идентичных результатов.
Примечание 2 - Проблему неполного дефосфорилирования можно решить с помощью раздельного количественного определения ТМФ (тиамина монофосфата), см. [7].
)=2,5 моль/дм
.
)=0,5 моль/дм
.
4.18 Подвижные фазы ВЭЖХ.
Примеры соответствующих смесей с объемными долями метанола (см. 4.1) от 10% до 50% в воде или использования фосфатного или ацетатного буфера представлены в приложениях A и C. Также представлен вариант подвижной фазы с использованием ион-парного реагента.
4.19 Раствор фосфатный буферный (pH 3,5), 
)=9,0 ммоль/дм
.
)
98%.
)
98%.
4.22 Раствор ацетатный буферный (pH 4,0), )=50 ммоль/дм
.
4.23 Стандартные вещества.
4.23.1 Тиамина хлорид гидрохлорид, 
)
99%.
Используется для метода внешнего стандарта, см. 6.3.
4.23.2 Тиамина монофосфат хлорид, 
)
98%.
Используется для проверки ферментов, см. 6.2.2.
4.23.3 Тиамина пирофосфат хлорид (кокарбоксилаза), 
)
98%.
Используется для проверки ферментов, см. 6.2.2.
4.24 Основные растворы.
4.24.1 Основной раствор тиамина хлорида гидрохлорида,
(
)
0,1 мг/см
.
Растворяют точно взвешенное количество стандартного вещества тиамина хлорида гидрохлорида (см. 4.23.1) в определенном объеме соответствующего растворителя, например 10 мг стандартного вещества витамина
в 100 см
раствора соляной кислоты (см. 4.6). Срок хранения раствора - четыре недели при температуре 4
4.24.2 Основной раствор тиамина монофосфата,
(
)
0,1 мг/см
.
Растворяют точно взвешенное количество тиамина монофосфата хлорида (см. 4.23.2) в определенном объеме соответствующего растворителя, например 10 мг тиамина монофосфата хлорида в 100 см
раствора соляной кислоты (см. 4.6). Срок хранения раствора - четыре недели при температуре минус 20
4.24.3 Основной раствор тиамина пирофосфата,
(
)
0,1 мг/см
.
Растворяют точно взвешенное количество тиамина пирофосфата хлорида (см. 4.23.3) в определенном объеме соответствующего растворителя, например 10 мг тиамина пирофосфата хлорида в 100 см
раствора соляной кислоты (см. 4.6).
4.24.4 Определение точной концентрации тиамина хлорида гидрохлорида
10 см
раствора тиамина хлорида гидрохлорида (см. 4.24.1) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см
и объем содержимого колбы доводят до метки раствором соляной кислоты (см. 4.6). Оптическую плотность данного раствора измеряют на УФ-спектрометре (см. 5.1) при максимальной длине волны 247 нм (
) в кювете с длиной оптического пути 1 см, используя раствор соляной кислоты (см. 4.6) в качестве раствора сравнения. Массовую концентрацию раствора тиамина хлорида гидрохлорида
, мкг/см
, рассчитывают по формуле
, (1)
где
- молярный коэффициент поглощения тиамина хлорида гидрохлорида при максимальной длине волны 247 нм
=14200 дм
моль
см
. Данное значение рассчитывается исходя из коэффициента экстинкции
=421 в 0,1 моль/см
HCl [8], [7] и молярной массы M=337,21. Значение округляют до четырех значащих цифр;
M - молярная масса, г/моль. Значение равно 337,21;
- значение оптической плотности раствора тиамина хлорида гидрохлорида.
4.25 Стандартные растворы.
4.25.1 Стандартный раствор тиамина хлорида гидрохлорида,
(
)
от 1 до 10 мкг/см
.
В мерную колбу вместимостью 100 см
переносят пипеткой от 1 до 10 см
раствора тиамина хлорида гидрохлорида (см. 4.24.1) и объем содержимого колбы доводят до метки подходящим растворителем, например раствором соляной кислоты (см. 4.6). Раствор можно хранить в течение месяца при температуре 4
4.25.2 Стандартный раствор тиамина монофосфата,
(
)
от 1 до 10 мкг/см
.
В мерную колбу вместимостью 100 см
переносят пипеткой от 1 до 10 см
раствора тиамина монофосфата (см. 4.24.2) и объем содержимого колбы доводят до метки подходящим растворителем, например раствором соляной кислоты (см. 4.6). Раствор можно хранить в течение месяца при температуре 4
4.25.3 Стандартный раствор тиамина пирофосфата,
(
)
от 1 до 10 мкг/см
.
В мерную колбу вместимостью 100 см
переносят пипеткой от 1 до 10 см
раствора тиамина пирофосфата (см. 4.24.3) и объем содержимого колбы доводят до метки, например, раствором соляной кислоты (см. 4.6). Раствор можно хранить в течение месяца при температуре 4
5 Оборудование
Используют стандартное лабораторное оборудование, стеклянную посуду, в том числе оборудование, перечисленное ниже:
5.1 УФ-спектрометр, пригодный для измерения оптической плотности при определенной длине волны (247 нм) с соответствующими кюветами с длиной оптического пути 1 см.
5.2 Автоклав или нагревательный прибор, автоклав для экстракции проб, например электрического типа, работающий под давлением, со считывающим устройством давления или температуры, плитка электрическая или водяная баня.
5.3 Система ВЭЖХ.
Система ВЭЖХ состоит из насоса, устройства для ввода проб, флуоресцентного детектора с длиной волны возбуждения и эмиссии, установленных на уровнях 366 и 435 нм соответственно (см. приложение C), а также устройства для обработки данных, например интегратора.
5.4 Колонка для ВЭЖХ.
5.4.1 Общие положения.
Допускается использовать колонку другого внутреннего диаметра и длины, заполненную сорбентом с размером частиц, отличным от указанных в настоящем стандарте. Условия хроматографического разделения подбирают применительно к используемой колонке для обеспечения сопоставимости результатов анализов. Критерием пригодности аналитической колонки является отделение пика тиамина от пиков других компонентов матрицы пробы
на уровне базовой линии.
_______________
Подходящие силикагелевые наполнители для колонок, имеющиеся в продаже: Lichrosorb® Si 60, Spherisorb® Si, Hypersil® Si и Lichrospher® 100 DIOL. Подходящие наполнители колонок для обращенно-фазовой хроматографии: Spherisorb® ODS,
-Bondapak radial C18, Supelco® LC-18-DB и Hypersil® ODS. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой CEN указанной продукции.
5.4.2 Колонка для ВЭЖХ при анализе с использованием предколоночного окисления
Аналитические колонки, например Lichrospher® 60 RP Select B
, размер частиц 5 мкм, диаметр от 4,0 до 4,6 мм, длина от 100 до 250 мм.
_______________
Подходящие силикагелевые наполнители для колонок, имеющиеся в продаже: Lichrosorb® Si 60, Spherisorb® Si, Hypersil® Si и Lichrospher® 100 DIOL. Подходящие наполнители колонок для обращенно-фазовой хроматографии: Spherisorb® ODS,
-Bondapak radial C18, Supelco® LC-18-DB и Hypersil® ODS. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой CEN указанной продукции.
5.4.3 Колонка для ВЭЖХ при анализе с использованием послеколоночного окисления
Аналитические колонки, например Supelco® LC-18-DB
, размер частицы 5 мкм, диаметр от 4,0 до 4,6 мм, длина от 100 до 250 мм.
_______________
Подходящие силикагелевые наполнители для колонок, имеющиеся в продаже: Lichrosorb® Si 60, Spherisorb® Si, Hypersil® Si и Lichrospher® 100 DIOL. Подходящие наполнители колонок для обращенно-фазовой хроматографии: Spherisorb® ODS,
-Bondapak radial C18, Supelco® LC-18-DB и Hypersil® ODS. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой CEN указанной продукции.
5.5 Фильтровальное устройство.
Фильтрация подвижной фазы, а также раствора анализируемой пробы через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм до использования или ввода проб продлевает срок службы колонок.
5.6 Послеколоночный реакторный насос и трубка для дериватизации, подходящая система подачи реактива, Т-образная соединительная трубка и трубка для дериватизации (например, 10 м
0,33 мм).
6 Методика проведения испытания
