Методические рекомендации МР 01.019-07 Определение интегральной токсичности почв с помощью биотеста "Эколюм".

     МР 01.019-07

 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

 Определение интегральной токсичности почв с помощью биотеста "Эколюм"

1. Методические рекомендации разработаны: ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (Ревазова Ю.А., Донерьян Л.Г.), Московским государственным университетом им. М.В.Ломоносова (Данилов B.C.),  ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора (Брагина И.В, Ластенко Н.С., Федосеева Т.А).

2. С выходом настоящих методических рекомендаций утрачивают силу методические рекомендации "Определение общей токсичности почв с помощью бактериального теста "Эколюм" от 8 июня 2000 г. МР N 11-134-09.

УТВЕРЖДЕНЫ Главным врачом ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека", Председателем Лабораторного совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А.И.Верещагиным 15 июня 2007 г.

 1. Назначение и область применения

Настоящий документ устанавливает методику быстрого и количественного контроля степени интегральной химической токсичности водных вытяжек из почвы. Тест-система представлена биосенсорами серии "Эколюм" и измерительным прибором серии "Биотокс-10". Тест-система реагирует на токсичные соединения разнообразной химической природы и смеси веществ.

Документ предназначен для учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и служб федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор.

Опасность загрязнения почв определяется уровнем ее возможного отрицательного влияния на контактирующие среды (вода, воздух), пищевые продукты и прямо или косвенно на человека.

Результаты обследования учитывают при определении и прогнозе степени опасности почв для здоровья и условий проживания населения в населенных пунктах, разработке мероприятий по их рекультивации, технических решений по реабилитации и охране территорий, оценке эффективности санитарно-экологических мероприятий и текущего санитарно-эпидемиологического надзора за объектами, воздействующими на окружающую среду населенного пункта.

 2. Нормативные ссылки

1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 года N 52 ФЗ в редакции Федерального закона от 22 августа 2004 года N 122 ФЗ.

2. СанПиН 2.1.7.1287-03 "Санитарно-эпидемиологические требования к качеству почвы!".

3. ГОСТ 27793-88* (СТ СЭВ 5298-85) "Почвы. Термины и определения".     

4. ГОСТ 17.2.2.01-81* (СТ СЭВ 4470-84) "Охрана природы. Почвы. Номенклатура показателей санитарного состояния".

5. ГОСТ 17.4.3.01-83 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб".

6. ГОСТ 17.4.3.03-85 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ".

7. ГОСТ 17.4.4.02-84 "Охрана природы. Почва. Методы отбора и подготовки проб почвы для химического, бактериологического и гельминтологического анализа".

8. ГОСТ 17.4.3.06-86 (СТ СЭВ 5101-85) "Охрана природы. Почвы. Общие требования к классификации почв по влиянию на них химических загрязняющих веществ".

 3. Термины и определения

Санитарно-гигиенический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением гигиенических нормативов качества окружающей среды.

Химическое загрязнение почвы - изменение химического состава почвы, возникшее под прямым или косвенным воздействием антропогенного фактора (промышленного, сельскохозяйственного, коммунального и т.п.), вызывающее снижение ее качества и возможную опасность для здоровья человека.

Фоновые почвы - почвы территорий, не подвергающихся техногенному воздействию или испытывающих его в минимальной степени.

Токсичность - степень проявления вредного действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность - один из важных факторов, определяющих качество окружающей среды, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности объектов при их использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе.

Критерий токсичности (индекс токсичности) - достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности изучаемого объекта. Среди тест-параметров наиболее часто используют выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и метаболической активности организмов.

Тест-реакция - это изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или другого функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.

Биотестирование - проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.

Токсические эффекты, регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемом объекте, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.

Биолюминесценция - интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.

 4. Принцип методики

Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции биосенсора при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.

При изучении токсикологических свойств объектов окружающей среды люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на животных, культуры клеток человека и другие известные биотесты.

Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с контролем. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

 5. Количественная оценка параметров тест-реакции

Токсическое действие исследуемой пробы на тест-объект определяется по уменьшению интенсивности биолюминесценции за 30-ти минутный (в экспрессном варианте - 5 минут) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины - индекса токсичности "

" и функциональными токсикологическими параметрами ЕС20 и ЕС50.

Индекс токсичности "

", равный отношению

, где

и

соответственно интенсивность биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с биосенсором.

Токсикологические параметры пробы ЕС20 и ЕС50, определяемые также посредством измерения

и

, позволяют быстро и экономно выяснить вопрос при каких объемах исходного слабо токсического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях сильно токсический образец станет безопасным (величины менее ЕС20).

ЕС50 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация), вызывающий тушение свечения биосенсора на 50% по сравнению с контролем. В этом случае образец сильно токсичен (индекс токсичности равен 50). ЕС20 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация), который приводит к 20%-ному тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен (индекс токсичности равен 20). Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют о том, что образец имеет допустимую степень токсичности.

Вычисление величин ЕС проводят с использованием гамма-функции. Гамма-функция (G) представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой

, где

и

соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте. Функция

очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец сильно токсичен. График

-функции в логарифмических координатах как функция изменения объема пробы (или концентрации отдельного вещества) есть теоретически прямая линия молекулярности реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими эти токсиканты в тест-объекте.

Люминометр "Биотокс-10" автоматически вычисляет величину индекса токсичности и параметры ЕС20 и ЕС50.

Методика предусматривает три пороговых уровня индекса токсичности:

- допустимая степень токсичности образца: индекс токсичности

меньше 20; объем пробы или концентрация вещества в пробе меньше величины ЕС20;

- образец токсичен: индекс

равен или больше 20 и меньше 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе) меньше величины ЕС50 и больше или равен ЕС20;

- острая токсичность образца: индекс токсичности

равен или более 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе) равен или больше величины ЕС50.

 6. Оборудование, материалы, реактивы

1. Лиофилизированный биосенсор "Эколюм", ТУ 2639-236-00209792-01;

2. Прибор серии "Биотокс-10", сертификат об утверждении типа средств измерений RU.C.31,003.A N 21703, с набором кювет для измерения биолюминесценции объемом 1,5 мл;

3. Весы лабораторные общего назначения. ГОСТ 24104;

4. рН-метр, ГОСТ 25.7416.0171 или аналоги;

5. Термометр лабораторный 0-55 °С, цена деления шкалы - 0,5 °С, ГОСТ 215;

6. Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474;

7. Холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание (-18±1 °С) и хранение проб (2-4 °С);

8. Часы сигнальные, ТУ 25-07-57;

9. Подставка (из пластика, дерева) с углублением для пенициллиновых пузырьков или измерительных кювет, на которой можно разместить не менее 12 кювет;

10. Буры почвенные, ножи почвенные, ГОСТ 2307;

11. Лопаты, ГОСТ 19596;

12. Бумажные фильтры обеззоленные типа ФОБ (красная, белая ленты), ТУ 6-09-1678;

13. Пипетки автоматические дозаторы любого типа объемом 0,02-0,5 мл ±1,0%;

14. Цилиндры вместимостью 25, 50 мл второго класса точности, ГОСТ 1770;

15. Стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 10, 50 мл, ГОСТ 25336;

16. Пипетки объемом 0,5 и 1,0 мл, ГОСТ 29227;

17. Пробоотборник любого типа, объемом не менее 5 мл;

18. Флаконы и банки стеклянные с навинчивающейся крышкой или с притертой пробкой для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 10, 50, 100 мл;

19. Воронки лабораторные, ГОСТ 25336;

20. Стаканчики для взвешивания (бюксы) диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148;

21. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709;

22. Кислота соляная, ГОСТ 3118;

23. Кислота серная, ГОСТ 4204;

24.Спит этиловый, х.ч. ТУ 6-091710;

25. Цинк сернокислый 7-водный, ГОСТ 4174;

26. Бумага индикаторная универсальная для измерения рН;

27. Натрия гидроокись, ГОСТ 4328;

28. Аппараты для встряхивания, тип АВУ-1, АВУ-10Р, ТУ 64-1-1081.

 7. Характеристика тест-объекта "Эколюм" и прибора "Биотокс-10"

Биосенсор "Эколюм" представляет собой лиофилизированные люминесцентные бактерии или бесклеточные препараты, содержащие бактериальную люциферазу. Производится в соответствии с требованиями ТУ 2639-236-00209792-01. Биосенсор находится в стеклянных флаконах в среде инертных газов. При температуре 2-4 °С и ниже имеет гарантированный срок хранения не менее 1 года.

Специализированный люминометр "Биотокс-10" является измерительным прибором, предназначенным для проведения токсиколого-гигиенического мониторинга объектов окружающей среды, с использованием микробных биолюминесцентных сенсоров серии "Эколюм". Сочетание биохимического датчика с современной электронной аппаратурой позволяет обнаруживать с высокой достоверностью малые количества токсических соединений и их смесей. В приборе используется простая и надежная технология отбора и предъявления проб, которая безопасна при проведении экологической экспертизы в лабораторных условиях.

Портативный прибор "Биотокс-10" может осуществлять следующие функции в автоматическом режиме: определение интенсивности биолюминесценции тест-объекта, индекса токсичности пробы и усредненной величины индекса токсичности; вычисление стандартного отклонения показателя токсичности. Прибор проводит определение величин ЕС20 и ЕС50 - пороговых значений допустимой степени и острой степени токсичности образца; исследование динамики процесса взаимодействия токсикантов с тест-объектом, компьютерную обработку данных измерения.

 8. Условия безопасного проведения работ

8.1. При работе с химическими веществами необходимо соблюдать требования техники безопасности по ГОСТ 12.4.021.

8.2. Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. В конце дня проводится влажная уборка рабочих поверхностей.

8.3. Безопасность при работе с электроустановками обеспечивается по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию.

8.4. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

8.5. Используемые в качестве биотестов лиофилизированные бактерии не патогенны, однако после каждого анализа необходимо стерилизовать всю использованную посуду, остатки растворов в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1 часа.

8.6. Хранить биосенсор "Эколюм" в холодильнике при температуре от -18 °С до 2-4 °С, следует беречь культуру лиофилизированных бактерий от нагревания и резкой смены температуры.

 9. Требования к квалификации лиц, проводящих биотестирование

Определение токсичности по настоящей методике выполняется оператором с квалификацией лаборант.

 10. Условия выполнения измерений

Биотестирование проводится в нормальных лабораторных условиях в соответствии с ГОСТ 15150. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов. Возможно проведение измерений в полевых условиях при наличии источника питания 12 вольт.

Температура окружающего воздуха в лаборатория от +15 до 30 °С. Относительная влажность воздуха 80±5%. Атмосферное давление 84-106 кПа (630-800 мм рт.ст.).

При использовании электроприборов частота переменною тока 50±1 Гц. Напряжение сети 220±10 В.

Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничивается особыми требованиями.

 11. Подготовка к проведению измерений

Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению биотестирования должна обеспечивать подготовку посуды, пробоотборников, мест хранения отобранных проб, а также подготовку рабочего места для обработки доставленных в лабораторию проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключить попадание каких-либо химических веществ в исследуемый образец.

11.1. Подготовка посуды для отбора, хранения проб и биотестирования.

Обычно для отбора почв используются матерчатые мешки.

Посуда для биотестирования должна быть химически чистой. Она промывается смесью бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью). Стенки посуды осторожно смачиваются хромовой смесью, после чего на 2-3 часа посуда оставляется, затем она тщательно промывается водопроводной водой, нейтрализуется раствором пищевой соды и промывается 3-4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями. Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной, - в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1 часа.

Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться закрытой стеклянными притертыми пробками или завинчивающимися крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т.п.

11.2. Отбор, транспортировка, хранение и подготовка проб.

11.2.1. Программа обследования почвы определяется целями и задачами исследования с учетом санитарного состояния района, уровня и характера техногенной нагрузки, условий землепользования.

11.2.2. При выборе объектов в первую очередь обследуют почвы территорий повышенного риска воздействия на здоровье населения (детские дошкольные, школьные и лечебные учреждения, зоны санитарной охраны водоемов, питьевого водоснабжения, земли, занятые под сельхозкультуры и т.д.).

11.2.3. Отбор проб почвы, ее хранение и транспортировка осуществляются в соответствии с ГОСТ 17.4.4.02-84, ГОСТ 12071-84* "Грунты. Отбор, упаковка, транспортировка и хранение образцов".

11.2.4. Контроль загрязнения почв населенных пунктов проводится с учетом функциональных зон города. Пробная площадка должна располагаться на типичном для изучаемой территории месте. При неоднородности рельефа площадки выбирают по элементам рельефа. На территорию, подлежащую контролю, составляют описание с указанием адреса, точки отбора, общего рельефа микрорайона, расположение мест отбора и источников загрязнения, типа почвы и других данных, необходимых для правильной оценки и трактовки результатов анализов образцов.

11.2.5. При контроле над загрязнением почв промышленными источниками площадки для отбора проб располагают на площади трехкратной величины санитарно-защитной зоны вдоль векторов розы ветров на расстоянии 100, 200, 300, 500, 1000, 2000, 5000 м и более от источника загрязнения (ГОСТ 17.4.4.02-84).

11.2.6. Для контроля санитарного состояния почв детских дошкольных, школьных и лечебно-профилактических учреждений, игровых площадок и зон отдыха отбор проб проводят не менее 2 раз в год - весной и осенью. Размер пробной площадки должен быть не более 5х5 м. При контроле санитарного состояния почв территорий детских учреждений и игровых площадок отбор проб проводится отдельно из песочниц и общей территории с глубины 1-10 см. С каждой песочницы отбирается одна объединенная проба, составленная из 5 точечных.

11.2.7. В том случае если известны границы какого-либо локального участка загрязнения или проводится мониторинг за степенью общего загрязнения почвы в местах захоронения вредных веществ, отвалах, свалках и т.п., одновременно с отбором образцов в предполагаемых загрязненных участках проводится отбор "фоновых" почв. Под фоновыми почвами понимаются почвы прилегающих территорий, со сходными условиями, которые можно считать незагрязненными по отношению к исследуемым участкам. Так, при контроле почв в районе точечных источников загрязнения (выгребы, мусоросборники и т.п.) пробные площадки размером не более 5х5 м закладываются на разном расстоянии от источника и в относительно чистом участке (контроль).

11.2.8. При изучении загрязнения почв транспортными магистралями подобные площадки закладываются на придорожных полосах с учетом рельефа местности, метео- и гидрологических условий. Пробы почвы отбирают с узких полос длиной 200-500 м на расстоянии 0-10, 10-50, 50-100 м от полотна дороги. Одна смешанная проба составляется из 20-25 точечных, отобранных с глубины 1-10 см.

11.2.9. При оценке сельскохозяйственных территорий пробы почвы отбирают из верхнего почвенного горизонта (до 20 см) в 5 точках по типу "конверта". Масса объединенной пробы (из 5 точечных) должна составлять не менее 0,5 кг. Размер пробной площади определяется целями поставленных исследований и представляет собой часть исследуемой территории, характеризующейся сходными условиями. При оценке сельскохозяйственных территорий на предмет их пригодности для производства экологически чистой продукции она может составлять от 1 до 5 га при однородном почвенном покрове и от 0,5 до 1 га - при неоднородном. При необходимости проведения более детального картирования общего уровня загрязнения размер пробной площади может составлять десятки м

.

11.2.10. Отобранные образцы освобождают от крупных корней, камней и высушивают при 105 °С в течение 1 часа. Воздушно-сухую пробу почвы растирают в ступке (почво-измельчителе), просеивают через сито с отверстиями в 3 мм и тщательно перемешивают. Подготовленный образец нужно хранить в сухом месте в пакете из бумаги крафт. Навеску почвы (массой не менее 5,0 г) помещают в коническую колбу, мерным цилиндром приливают пятикратный объем дистиллированной воды, взбалтывают в течение 5 минут и оставляют для экстракции на 24 часа. Через 24 часа экстракт фильтруют через бумажный фильтр - белая, красная ленты (только в случае мутной надосадочной жидкости). Полученный экстракт тестируют на токсичность.

В экспрессном варианте навеску почвы с добавленной дистиллированной водой взбалтывают на аппарате для встряхивания в течение 3 часов и фильтруют через бумажный фильтр. Если по истечении этого времени устанавливается факт сильной токсичности почвы стандартная процедура экстракции не проводится.

11.3. Подготовка тест-объекта "Эколюм" и прибора "Биотокс-10"

11.3.1. Подготовку прибора "Биотокс-10" проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

11.3.2. Реконструкция тест-системы "Эколюм".

11.3.2.1. Вскрыть флакон с лиофилизированным биосенсором. Добавить 10 мл дистиллированной воды (комнатная температура, рН 6,8-7,4) - получают исходную суспензию биопрепарата. В случае необходимости рН дистиллированной воды доводят до нужного диапазона подщелачиванием раствором NaOH или подкислением раствором НСl. При отсутствии такой воды или ее плохого качества можно использовать стандартный физиологический раствор.

11.3.2.2. Выдержать суспензию биопрепарата в течение 30 минут, периодически перемешивая.

11.3.2.3. Держать флакон с суспензией можно на лабораторном столе при нормальном освещении. Рекомендуется перемешивание суспензии перед каждым отбором определенных объемов для проведения анализа.

11.3.2.4. Если у биосенсора истек гарантийный срок хранения и/или он стал плохо растворяться в холодной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию через бумажный фильтр.

11.3.3. Определение рабочей концентрации тест-системы "Эколюм".

11.3.3.1. Измерить фоновое значение прибора "Биотокс-10" (по инструкции к прибору) и записать это значение.

11.3.3.2. Добавить 0,1 мл исходной суспензии из флакона в кювету люминометра, затем туда же добавить 0,9 мл дистиллированной воды (рН 6,8-7,4; комнатная температура).

11.3.3.3. Вставить кювету с биосенсором в люминометр и измерить величину интенсивности биолюминесценции.

11.3.3.4. Рекомендуется, чтобы интенсивность свечения биосенсора находилась в интервале, превышающем фоновое значение прибора в 100-500 раз. Если величина свечения намного больше верхнего предела, то рекомендуется разбавить исходную суспензию дистиллированной водой и повторить измерение.

 12. Процедура биотестирования

12.1. Определение индекса токсичности.

При определении индекса токсичности необходимо проводить параллельное измерение водных вытяжек из контрольных образцов почвы (или в качестве контроля используется дистиллированная вода) и водных вытяжек из опытных проб почвы. Рекомендуется иметь не менее трех повторностей опытной пробы. Для большей достоверности данных число повторностей опытной пробы может быть увеличено до 10 измерений. Существуют два варианта измерений. Первый вариант - измеряется контрольная проба и прибор запоминает значение интенсивности свечения. Затем измеряются повторности опытной пробы, и прибор автоматически фиксирует значения индекса токсичности каждой пробы, усредненное значение индекса токсичности и погрешности измерения. Второй вариант - измеряются последовательно три (или более) пары контроль-опыт. В каждой паре прибор автоматически фиксирует индекс токсичности и в конце измерения выдает значения усредненного индекса токсичности пробы и значения погрешности измерения. Объем добавляемой суспензии бактерий к пробе может быть произвольным, но равным в контроле и исследуемой пробе.

12.1 1. При стандартном анализе отбирают из флакона по 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и добавляют в три кюветы от люминометра контрольные и три (или более - до 10) кюветы для пробы. Добавляют в контрольные кюветы по 0,9 мл дистиллированной воды (рН 6,8-7,4). Добавляют в остальные кюветы по 0,9 мл опытной пробы, замечают время экспозиции и через определенный интервал измеряют интенсивность биолюминесценции бактерий.

12.1.2. Измерение интенсивности биолюминесценции и индекса токсичности проводят с помощью прибора "Биотокс-10" согласно инструкции по эксплуатации прибора в стандартном варианте через 30 минут экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 минут.

12.2. Определение токсикологических параметров пробы, ЕС20 и ЕС50.

Эта операция предназначена для быстрого выяснения вопроса, при каких объемах исходного слабо токсического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях сильно токсический образец станет безопасным (величины менее ЕС20). При этом происходит регистрация величины индекса токсичности измеряемого образца.

ЕС50 есть эффективный объем образца, вызывающий тушение свечение биосенсора на 50% по сравнению с контролем. В этом случае образец сильно токсичен. ЕС20 есть эффективный объем образца, который приводит к 20%-ному тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен. Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют о том, что образец безвреден для человека.

Вычисление величин ЕС проводят с использованием достаточно известной в токсикологии гамма-функции. Гамма-функция (

) представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой

, где

и

соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте. Функция

очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец сильно токсичен. График

-функции в логарифмических координатах против объемов пробы есть теоретически прямая линия молекулярности реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими эти токсиканты в тест-объекте. Люминометр "Биотокс-10" позволяет автоматически представлять величины

для каждой пробы, а также вычисляет величины ЕС20 и ЕС50 (см. описание к прибору "Биотокс-10").

12.2.1. Рекомендуется перед измерением коэффициентов ЕС убедиться при измерении токсичности неразбавленной пробы, что величина

для данной пробы не превышает значения 25. В случае, если величина

больше, может увеличиться погрешность измерения величин ЕС. В таком случае необходимо развести пробу дистиллированной водой до указанного предела и учесть предварительное разбавление.

12.2.2. После вывода прибора в режим измерения ЕС (см. инструкцию к прибору) для измерения параметров исследуются 4 пробы: исходная (обозначена на дисплее прибора как 1:1) и 3 пробы, получаемые путем последовательного разбавления в два раза исходной пробы дистиллированной водой в отношениях 1:2, 1:4 и 1:8. Для всех 4-х проб автоматически определяется

-функция, значения которой заносятся в оперативную память микроконтроллера прибора. По данным этих 4-х измерений микроконтроллер при нажатии специальных кнопок клавиатуры управления производит автоматически вычисление коэффициентов ЕС20 и ЕС50 и представляет данные на дисплее.

При интенсивности биолюминесценции любого из 4-х образцов больше контроля или равной ему вычисление параметров ЕС не производится. Если исходный образец имеет интенсивность биолюминесценции больше контроля, то для изучения параметров ЕС его необходимо концентрировать. В случае если исходный образец имеет интенсивность биолюминесценции меньше контроля, но последние разбавления дают активацию свечения, рекомендуется сильно уменьшить степень разбавления исходного образца.

 13. Обработка и оценка результатов

13.1. Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности "

" (прибор "Биотокс-10" позволяет автоматически вычислять индекс токсичности). Абсолютная величина интенсивности биолюминесценции контроля не имеет принципиального значения в диапазоне допустимых значений прибора "Биотокс-10".

13.2. Индекс токсичности "

" есть величина безразмерная, и определяется по формуле

, где

и

соответственно интенсивность свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом. Обработку результатов измерений токсичности выполняют путем расчета среднеарифметического значения величины индекса токсичности "

" по формуле

, где

- повторности (до 10) опытной пробы. Величины

,

и  

получают из трех параллельных измерений контроль-опыт в короткий промежуток времени или при измерении в последовательности контроль, и затем серия опытных образцов.

13.3. В случае наличия токсичности пробы ("

" равно или больше 20) можно определить насколько это связано со значениями рН исследуемого раствора. Для этого измеряют pH пробы и если величина рН находится за пределами 6,5-8,0, приводят рН до значений 6,8-7,4 и повторяют измерение токсичности.

13.4. В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения "

" делается вывод об отсутствии токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.

13.5. Представленные прибором показатели параметров ЕС показывают насколько надо разбавить анализируемую пробу, чтобы достичь уровня токсичности (ЕС20) или острой токсичности (ЕС50).

13.6. По величине индекса токсичности и параметров ЕС анализируемые пробы классифицируются на три группы, представленные в таблице.

Группы	Величина индекса токсичности " "	Величина параметра ЕС	Степень токсичности пробы
1	меньше 20	объем или концентрация пробы меньше величины ЕС20	допустимая степень токсичности
2	от 20 до 49,99	объем или концентрация пробы меньше величины ЕС 50 и больше или равен ЕС20	образец токсичен
3	равна или больше 50	объем или концентрация пробы равный или больше величины ЕС50	высокая токсичность образца

13.7. Прибор серии "Биотокс-10" обеспечивает в автоматическом режиме вычисление усредненного значения индекса токсичности, погрешности измерения индекса токсичности и гамма-функции исследуемой пробы (токсикологических характеристик - ЕС20 и ЕС50).

13.8. Результат токсикологического анализа представляется в виде протокола (Приложение 1).

 14. Контроль погрешности методики токсикологического анализа

14.1. Контроль качества оценки токсичности проводится по определению чувствительности тест-системы "Эколюм" к модельному "эталонному" токсиканту цинку сернокислому 7-водному (ZnSO

·7

Н

О), растворенному в дистиллированной воде (рН 6,8-7,4). Концентрация модельного токсиканта, при действии которого через 30 минут экспозиции интенсивность биолюминесценции ингибируется не менее чем на 50%, должна быть не более 7,0 мг/дм

цинка сернокислого.

Испытания проводят в соответствии с прописью методики в трех независимых опытах. Если концентрация модельного токсиканта, вызвавшая острую токсичность, находится в интервале 6,0-7,0 мг/дм

цинка сернокислого, то чувствительность тест-объекта соответствует необходимым требованиям. Если концентрация модельного токсиканта, вызвавшая острую токсичность, не находится в данном интервале, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов, условий проведения опытов. Если ошибки при проведении опытов исключены, необходимо сменить исходный материал.

14.2. Оперативный контроль сходимости проводится при анализе каждой рабочей пробы.

 15. Форма представления результатов анализа

Результат токсикологического анализа в документах - индекс токсичности, предусматривающих его использование, представляется в виде:

, при

- среднее арифметическое определений.

За результат анализа (

) принимают среднее арифметическое результатов трех (или более - до 10) параллельных измерений индекса токсичности. Индекс токсичности

 вычисляется по формуле

, где

 и

 соответственно интенсивности биолюминесценции бактерий в контрольной и опытной пробах.

Среднее квадратичное отклонение (

) результатов определений количественного выражения тест-реакции - индекса токсичности вычисляется по формуле:

,

где

-

-й результат определений,

- число параллельных определений.

Среднее арифметическое

результатов определений количественного выражения тест-реакций вычисляется по формуле:

.

Все указанные статистические параметры вычисляются измерительным прибором "Биотокс-10" автоматически по команде оператора.

 Библиографические данные

1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 года N 52 ФЗ в редакции Федерального закона от 22 августа 2004 года N 122 ФЗ.

2. СанПиН 2.1.7.1287-03"Санитарно-эпидемиологические требования к качеству почвы".

3. ГОСТ 27793-88 (СТ СЭВ 5298-85) "Почвы. Термины и определения".     

4. ГОСТ 17.2.2.01-81 (СТ СЭВ 4470-84) "Охрана природы. Почвы. Номенклатура показателей санитарного состояния".

5. ГОСТ 17.4.3.01-83 (СТ СЭВ 3847-82) "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб".

6. ГОСТ 17.4.3.03-85  "Охрана природы. Почвы. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ".

7. ГОСТ 17.4.4.02-84 "Охрана природы. Почва. Методы отбора и подготовки проб почвы для химического, бактериологического и гельминтологического анализа".

8. ГОСТ 17.4.3.06-86 (СТ СЭВ 5101-85) "Охрана природы. Почвы. Общие требования к классификации почв по влиянию на них химических загрязняющих веществ".

9. Методические указания по оценке степени опасности загрязнения почвы химическими веществами N 4266-87. Утв. МЗ СССР 13.03.87.

10. Методические указания по геохимической оценке загрязнения территорий городов химическими элементами. - М.: ИМГРЭ, 1982.

11. МУ 2.1.7.730-99. "Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест". Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 1999.

12. ГН 2.1.7.2041-06, ГН 2042-06* "Предельно допустимые концентрации химических веществ в почве (ПДК) и ориентировочно-допустимые концентрации (ОДК) химических веществ в почве".

13. Дмитриев М.Т., Казнина Н.И., Пинигина И.А.: Справочник: Санитарно-химический анализ загрязняющих веществ в окружающей среде. - М.: Химия, 1989.

14. ГОСТ 26204-84*, 26213-84** "Почвы. Методы анализа".

15. Порядок определения параметров ущерба от загрязнения земель химическими веществами. Утв. Председателем Комитета Федерации по земельным ресурсам и землеустройству 10.11.93. Министерством охраны окружающей среды и природных ресурсов 18.11.93.

16. Инструкция по выявлению деградированных сельскохозяйственных угодий и загрязненных земель. Утв. Роскомземом 08.12.94 и Минприроды РФ 15.02.95.

17. Методические указания по определению тяжелых металлов в почвах сельхозугодий и продукции растениеводства. (2-е изд.). - М., 1992.

18. Оценка степени загрязнения почв химическими веществами. - Ч.1. Тяжелые металлы и пестициды. - М., Минприроды РФ, 1982.

19. Данилов B.C., Егоров Н.С. Бактериальная биолюминесценция. М., Изд-во МГУ, 1985.

20. Альтернативные методы исследований (экспресс-методы) для токсиколого-гигиенической оценки материалов, изделий и объектов окружающей среды. Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. М., 1999.

21. МР N 11-134-09. Методические рекомендации "Определение общей токсичности почв с помощью бактериального теста "Эколюм" от 8 июня 2000 г.

22. Оценка токсичности материалов, изделий и объектов окружающей среды на альтернативных биологических моделях (экспресс-методы). - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 220 с.

23. Скачков В.Б. Обоснование и разработка экспресс-методов контроля гигиенической безопасности среды обитания. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. Москва. 2002. - 46 с.

Приложение 1 (рекомендуемое)

ПРОТОКОЛ N

определения токсичности пробы с помощью биотеста "Эколюм"

и прибора "Биотокс-10"

Наименование учреждения/отдела

Наименование образца:

Наименование предприятия-изготовителя:

Наименование заявителя (отдела):

Упаковка, маркировка, описание образца:

НД на методы испытаний:

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ