ГОСТ ISO 13493-2014 Мясо и мясные продукты. Метод определения содержания хлорамфеникола (левомицетина) с помощью жидкостной хроматографии.

ГОСТ ISO 13493-2014

 МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

 МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ

 Метод определения содержания хлорамфеникола (левомицетина) с помощью жидкостной хроматографии

 Meat and meat products. Method for determination of chloramphenicol (levomycetin) content using liquid chromatography

МКС 67.120.10

Дата введения 2016-01-01

 Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт птицеперерабатывающей промышленности" Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ "ВНИИПП" Россельхозакадемии) на основе cобственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 июня 2014 г. N 45)

За принятие проголосовали:

(Поправка).

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 сентября 2014 г. N 1048-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 13493-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2016 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 13493:1998* "Мясо и мясные продукты. Определение содержания хлорамфеникола. Метод жидкостной хроматографии" ("Meat and meat products - Determination of chloramphenicol content - Method using liquid chromatography", IDT).

Международный стандарт разработан подкомитетом SC 6 "Мясо и мясные продукты" Технического комитета ISO/TC 34 "Пищевые продукты".

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р ИСО 13493-2005*

________________________

* Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 сентября 2014 г. N 1048-ст национальный стандарт ГОСТ Р ИСО 13493-2005 отменен с 1 января 2016 г.

7 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

8 ИЗДАНИЕ (ноябрь 2019 г.) с Поправкой (ИУС 10-2019)     

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

      1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания хлорамфеникола (левомицетина) в мышечной ткани мяса, включая мясо птицы, с помощью жидкостной хроматографии.

Данный метод применим для определения хлорамфеникола при его содержании более 6,5 мкг/кг.

Данный метод неприменим к испорченным образцам.

Примечание - Настоящий стандарт допускается применять для определения содержания хлорамфеникола во всех видах мяса и мясопродуктов. Однако межлабораторные испытания по установлению точности метода были проведены только на образцах мышечной ткани.

      2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения).

ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Спецификация и методы испытаний)

      3 Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1 содержание хлорамфеникола в мясе и мясных продуктах: Содержание хлорамфеникола, измеренное в соответствии с методом, указанным в настоящем стандарте.

Примечание - Содержание хлорамфеникола выражают в микрограммах на килограмм.

      4 Сущность метода

Хлорамфеникол из части пробы для анализа экстрагируют водой. Экстракт фильтруют и полученный водный раствор очищают от липофильных компонентов методом твердофазной экстракции. Хлорамфеникол элюируют с экстракционного патрона дихлорметаном. Органический растворитель выпаривают и остаток очищают с помощью жидкостной экстракции в системе вода - толуол. Хлорамфеникол определяют методом обращенно-фазной хроматографии с детектированием в ультрафиолетовой (УФ) области спектра.

      5 Реактивы

При отсутствии специальных указаний используют реактивы только официально признанной аналитической чистоты.

5.1 Вода, согласно требованиям ISO 3696, должна быть не ниже 3-й степени чистоты. Вода не должна содержать органические примеси.

5.2 Азот, пригодный для выпаривания растворителей.

5.3 Дихлорметан.

5.4 Толуол.

5.5 Ацетатный буфер,

(

)=0,01 моль/дм

, рН=4,3

Растворяют 0,82 г безводного ацетата натрия примерно в 970 см

воды. С помощью рН-метра (см. 6.1) доводят рН до 4,3 добавлением уксусной кислоты массовой долей 50%. Переносят раствор в мерную колбу вместимостью 1000 см

. Доводят водой до метки и перемешивают.

5.6 Ацетонитрил для УФ спектроскопии.

5.7 Подвижная фаза

К 250 см

ацетонитрила (см. 5.6) добавляют 750 см

ацетатного буфера (см. 5.5) и тщательно перемешивают.

Перед использованием элюент фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм (см. 6.2) и дегазируют.

5.8 Основной раствор хлорамфеникола массовой концентрации 100 мкг/см

Взвешивают 10 мг хлорамфеникола с точностью 0,1 мг и переносят в мерную колбу вместимостью 100 см

. Добавляют метанол до метки и перемешивают.

Приготовленный основной раствор стабилен в течение 1 мес при хранении в темноте.

5.9 Стандартные растворы хлорамфеникола

Пипеткой вносят 5,0 см

основного раствора (см. 5.8) в мерную колбу вместимостью 100 см

. Разбавляют водой до метки и перемешивают.

Разбавляют 1,0, 2,0, 5,0 и 15,0 см

этого раствора до 100 см

для получения четырех стандартных растворов с массовой концентрацией хлорамфеникола соответственно 0,05; 0,10; 0,25 и 0,75 мкг/см

.

Эти стандартные растворы стабильны в течение одной недели при хранении в темноте.

      6 Оборудование

Используют обычное лабораторное оборудование, в частности:

6.1 рН-метр.

6.2 Мембранный фильтр с малым мертвым объемом и размером пор 0,22 мкм.

6.3 Механическое или электрическое устройство, пригодное для измельчения образца.

В качестве такого устройства могут быть использованы высокоскоростной ротационный куттер или мясорубка с решеткой, диаметр отверстий которой не превышает 4,0 мм.

6.4 Лабораторный гомогенизатор (например, гомогенизатор типа Стомахер или Вортекс)

.

________________

Это примеры коммерчески доступной продукции. Данная информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой разработчика.

6.5 Фильтровальная бумага обеззоленная быстрофильтрующая диаметром примерно 15 см.

Примечание - Например, можно использовать Ватман 41

.

________________

Это примеры коммерчески доступной продукции. Данная информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой разработчика.

6.6 Экстракционные патроны вместимостью 20 см

с диатомитовой землей, которая задерживает липофильные компоненты из водных растворов.

Примечание - Можно использовать, например, картриджи Extrelut@ производства фирмы Merk, Дармштадт, Германия (N 11737)

.

________________

Это примеры коммерчески доступной продукции. Данная информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой разработчика.

6.7 Водяная баня или нагревательный блок, позволяющие поддерживать температуру (40±1)°С с устройством для выпаривания потоком азота (см. 5.2), или ротационный испаритель.

6.8 Центрифужные пробирки вместимостью 25 см

.

6.9 Смеситель для пробирок типа Вортекс, обеспечивающий частоту вращения примерно 700 мин

.

6.10 Центрифуга, обеспечивающая радиальное ускорение примерно 1000 g.

6.11 Микропипетки вместимостью 300 мм

.

6.12 Жидкостной хроматограф, оборудованный:

- насосом постоянного потока;

- инжектором;

- хроматографической колонкой внутренним диаметром 3 мм, длиной 20 см, заполненной обращенной фазой С8 или С18 с размером частиц 5 мкм, или другой колонкой с эквивалентными характеристиками;

- детектором УФ/ВИД, обеспечивающим измерение при длине волны 285 нм, если возможно - диодно-матричным детектором (используется для подтверждения обнаружения хлорамфеникола);

- самописцем с регулируемым диапазоном измерения или интегратором.

      7 Отбор проб

Отбор проб не является частью метода, изложенного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приведен в [1].

Очень важно, чтобы в лабораторию поступали представительные пробы, которые в процессе хранения и транспортирования не были испорчены или изменены.

От представительной пробы, поступившей в лабораторию, отбирают лабораторную пробу массой не менее 200 г. Пробу хранят в условиях, исключающих ее порчу и изменение состава.

      8 Подготовка пробы для анализа

Доводят температуру пробы до комнатной. Удаляют жировую ткань и несъедобные части пробы.

Измельчают лабораторную пробу с помощью устройства (см. 6.3). При этом следят за тем, чтобы температура пробы не превышала 25°С. При использовании мясорубки пробу пропускают через нее не менее двух раз.

Приготовленную пробу помещают в герметично закрываемую емкость. Закрывают и хранят так, чтобы не допустить порчи и изменения ее состава.

При необходимости пробу хранят при температуре менее минус 18°С.

Анализ пробы проводят как можно быстрее, но не позднее 24 ч после измельчения.

      9 Проведение анализа

Примечание - Для контроля повторяемости результатов (см. 11.2) проводят два параллельных определения в соответствии с 9.1-9.6.

9.1 Общая часть

Параллельно с анализом раствора (или серии растворов), полученного из анализируемой пробы (или нескольких анализируемых проб), проводят анализ раствора, полученного из пробы, заведомо не содержащей хлорамфеникол (контрольная проба), и раствора, полученного из пробы, в которую добавлен хлорамфеникол в количестве 10 мкг/кг (контрольная проба с внесенным хлорамфениколом).

9.2 Подготовка части пробы для анализа

В конической колбе вместимостью 100 см

взвешивают 10 г (

m

) измельченной анализируемой пробы (см. раздел 8) с точностью 0,1 г.

9.3 Приготовление экстракта

Добавляют 40,0 см

воды и энергично перемешивают в течение 3 мин с помощью лабораторного гомогенизатора (см. 6.4).

Общий объем образующейся водной фазы (

) равен 40,0 см

плюс объем воды, содержащейся в части пробы для анализа (обычно в 10 г пробы содержится примерно 7,5 см

воды).

Гомогенат фильтруют через бумажный фильтр (см. 6.5).

9.4 Твердофазная экстракция

Переносят 20 см

полученного фильтрата (

) в экстракционный патрон (см. 6.6).

Через (15±2) мин элюируют хлорамфеникол с помощью 70 см

дихлорметана (см. 5.3). Выпаривают органическую фазу до объема примерно 1 см

на водяной бане (см. 6.7) в слабом потоке азота (см. 5.2) или с помощью ротационного вакуумного испарителя (см. 6.7).

С помощью примерно 10 см

дихлорметана (см. 5.3) переносят остаток в центрифужную пробирку (см. 6.8).

Осторожно выпаривают досуха.

9.5 Жидкостная экстракция

К остатку добавляют 400 мм

воды (

) и 2,0 см

толуола (см. 5.4) и перемешивают с умеренной интенсивностью в течение 1 мин на смесителе Вортекс (см. 6.9) с частотой вращения примерно 700 мин

.

Центрифугируют в течение 5 мин на центрифуге (см. 6.10) с радиальным ускорением 1000 g.

Пипеткой отбирают как можно больше органической фазы и отбрасывают ее.

Добавляют 1,5 см

толуола и перемешивают с умеренной интенсивностью в течение 1 мин на смесителе Вортекс (см. 6.9) с частотой вращения примерно 700 мин

.

Центрифугируют в течение 5 мин на центрифуге (см. 6.10) с радиальным ускорением 1000 g.

Пипеткой отбирают как можно больше органической фазы и отбрасывают ее.

Микропипеткой (см. 6.11) переносят 300 мм

водной фазы в подходящий сосуд.

9.6 Хроматографический анализ

9.6.1 Условия хроматографирования

Длина волны	285 нм;
диапазон шкалы детектора	от 0,005 до 0,010 единиц оптической плотности, что соответствует полной шкале самописца;
шкала самописца	10 мВ;
скорость бумаги самописца	1,0 см/мин;
объемная скорость потока подвижной фазы (см. 5.7)	0,6 см /мин;
объем анализируемого раствора, вводимый (инжектируемый) в хроматограф	100 мм .

Примечание - Инжектируемый объем и объемная скорость потока зависят от размеров колонки.

9.6.2 Хроматографирование

После стабилизации системы жидкостного хроматографа (см. 6.12) инжектируют растворы, полученные из контрольной пробы и контрольной пробы с внесенным хлорамфениколом, четыре стандартных раствора хлорамфеникола (см. 5.9), раствор, приготовленный из анализируемой пробы по 9.5, и снова стандартные растворы хлорамфеникола (см. 5.9).

На хроматограммах проб проверяют наличие сигнала на участке, соответствующем времени удерживания хлорамфеникола.

9.6.3 Измерение

Измеряют высоты или площади хроматографических пиков хлорамфеникола для анализируемого раствора и стандартных растворов хлорамфеникола.

Измеренные для стандартных растворов высоты или площади пиков должны линейно зависеть от содержания хлорамфеникола в этих растворах.

Примечание - С помощью диодно-матричного детектора может быть подтверждено обнаружение хлорамфеникола при его содержании в образце более 10 мкг/кг.

      10 Обработка результатов

Содержание хлорамфеникола

, мкг/кг, в анализируемой пробе рассчитывают по формуле

,

где

- высота или площадь пика в единицах длины или площади, измеренные для анализируемого раствора;

- высота или площадь пика, измеренные для одного из стандартных растворов (см. 5.9);

- содержание хлорамфеникола в стандартном растворе, мкг/см

;

- масса части пробы для анализа (см. 9.2), г;

- объем водной фазы, полученной после гомогенизации по 9.3, см

(

=40 см

+ объем воды в пробе, взятой для анализа);

- объем фильтрата (

=20 см

), перенесенного по 9.4 в экстракционный патрон, см

;

- объем воды (

=400 мм

), добавленной по 9.5 к сухому остатку, мм

.

Результат вычислений округляют до 0,1 мкг/кг.

Результат испытаний нельзя корректировать на открываемость. Открываемость должна быть указана в протоколе испытаний (см. раздел 12).

      11 Точность

11.1 Межлабораторные испытания

Точность метода была установлена с помощью межлабораторных испытаний, проведенных в соответствии с [2]

.

________________

Получение результатов по точности проводилось по ISO 5725:1986 (в настоящее время отменен).

Результаты этой межлабораторной проверки опубликованы в [5]. Результаты этой проверки не могут быть распространены на области концентраций и матрицы, отличные от указанных в настоящем стандарте.

Результаты другой межлабораторной проверки, проведенной в соответствии с ISO 5725, показывают, что открываемость для мяса, мясных продуктов и мяса птицы воспроизводима и равна примерно 55%.

11.2 Повторяемость

Абсолютное значение разности результатов двух независимых единичных испытаний, выполненных за короткий промежуток времени одним методом для одной идентичной анализируемой пробы в одной лаборатории одним оператором на одном и том же оборудовании, может превышать 2,1 мкг/кг не более чем в 5% случаев при содержании хлорамфеникола в образце 10 мкг/кг.

11.3 Воспроизводимость

Абсолютное значение разности результатов двух независимых единичных испытаний, выполненных одним методом для идентичной анализируемой пробы в разных лабораториях разными операторами с использованием разного оборудования, может превышать 4,9 мкг/кг не более чем в 5% случаев при содержании хлорамфеникола в образце 10 мкг/кг.

      12 Протокол испытаний

В протоколе испытания необходимо указать:

- информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

- использованный метод отбора проб (если известен);

- использованный метод испытаний с указанием ссылки на настоящий стандарт;

- условия проведения анализа, не отраженные в настоящем стандарте или считающиеся неоднозначными, а также все имевшие место случаи, которые могут повлиять на результаты анализа;

- полученный результат анализа или два результата анализа, если проводилась проверка повторяемости;

- открываемость.

Приложение ДА

(справочное)

 Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов межгосударственным стандартам

Таблица ДА.1 - Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам

 Библиография