Методические указания по методам контроля МУК 4.2.2217-07 Выявление бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды.

             МУК 4.2.2217-07

 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 Выявление бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды

Дата введения 2007-08-01

1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Г.Ф.Лазикова, Ю.М.Федоров); ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (И.В.Брагина, М.В.Зароченцев, Э.Ф.Опочинский); ГУ "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи" РАМН (И.С.Тартаковский, Т.И.Карпова, Ю.Е.Дронина, Ю.С.Аляпкина, Ю.М.Романова, А.Л.Гинцбург); ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" (А.Н.Куличенко, С.А.Портенко, Н.А.Осина, В.В.Кутырев); ФГУЗ "Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт" (Ю.М.Ломов, А.Н.Терентьев, Г.Л.Карбышев, Л.И.Шелохович, Г.Д.Харабаджахян, И.К.Савельева); ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г.Москве" (Н.Я.Салова); Управлением Роспотребнадзора по г.Москве (Л.В.Родина); ФГУЗ Причерноморская ПЧС (В.И.Малай, Н.Д.Темежникова); Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана (Г.М.Трухина); ГУП "Мосводоканал" (Г.П.Кашкарова); МГУ инженерной экологии (А.Н.Цедилин, Е.М.Иванникова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Роспотребнадзора (прот. N 1 от 29 марта 2007 г.).

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г.Онищенко 30 мая 2007 г.

 1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методику проведения лабораторных исследований объектов окружающей среды по выявлению в них бактерий Legionella pneumophila - возбудителя болезни легионеров.

Проведение мониторинга объектов окружающей среды на наличие Legionella pneumophila позволит определить степень их контаминации возбудителем и дать оценку эффективности принимаемых мер в целях профилактики болезни легионеров и обеспечения безопасности здоровья населения.

1.2. Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, осуществляющих контроль за объектами окружающей среды; в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право осуществления контроля безопасности объектов окружающей среды на наличие возбудителя болезни легионеров.

1.3. Методические указания являются обязательными:

в порядке надзора за соблюдением установленных требований в области обеспечения безопасности объектов окружающей среды, в т.ч. в соответствии с СанПиН 2.1.2.1331-03 "Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды аквапарков", СанПиН 2.1.2.1188-03 "Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества";

в ходе проведения противоэпидемических мероприятий и при эпидемиологическом расследовании возможных эпидемических вспышек и спорадических случаев болезни легионеров.

1.4. Предлагаемый метод выявления бактерий Legionella pneumophila в окружающей среде согласуется с международным стандартом ISO 11731 и руководством ВОЗ "Legionella and the prevention of legionellosis" (2006 г.).

 2. Нормативные ссылки

2.1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ.

2.2. Постановление Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554 "Об утверждении Положения о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации и Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании".

2.3. СанПиН 2.1.2.1331-03 "Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды аквапарков".

2.4. СанПиН 2.1.2.1188-03 "Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества".

2.5. МУК 4.2.1884-04 "Санитарно-микробиологический и санитарно-эпидемиологический анализ воды поверхностных вод".

2.6. Методические рекомендации МЗ СССР "Эпидемиология, клиника, лечение и профилактика легионеллеза", 1988.

2.7. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтов".

2.8. Методические указания МУ 1.3.1888-04 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности".

2.9. Методические указания МУ 3.5.5.1034-01 "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности, при работе методом ПЦР".

2.10. European Guidelines for Control and Prevention of Travel associated Legionnaires Disease, 2002.

2.11. ISO 1998.ISO 11731:1998 Water Quality-detection and enumeration of Legionella.

2.12. Legionella and the prevention of Legionellosis. - WHO guidelines. 2006.

 3. Характеристика возбудителя болезни легионеров

Legionella pneumophila - грамотрицательная бактерия, возбудитель острых тяжелых пневмоний с высоким процентом летальных исходов (5-10%) и респираторных заболеваний. В природных условиях легионеллы обитают повсеместно в пресноводных водоемах, преимущественно в некультивируемой форме, и паразитируют в амебах и других простейших, не представляя серьезной опасности для человека. Размножение легионелл активно идет в теплой воде в диапазоне температур 25-45 °С, хотя их выделяют и из холодной воды.

Высокие адаптивные способности легионелл позволяют им успешно колонизировать искусственные водные системы - системы охлаждения и кондиционирования, градирни, компрессорные устройства, джакузи, фонтаны, медицинское оборудование и др. Условия для размножения легионелл в искусственных водных системах более благоприятны, чем в естественных, что приводит к накоплению в них возбудителя в высокой концентрации. Легионеллы активно колонизируют синтетические и резиновые поверхности промышленного, водопроводного, медицинского оборудования с образованием биопленок, в которых легионеллы значительно более устойчивы к действию дезинфицирующих веществ. В состав естественных биопленок помимо легионелл входят бактерии рода Pseudomonas, Klebsiella, Acinetobacter и др. Важная роль в персистенции легионелл в биопленках принадлежит амебам, в которых легионеллы активно размножаются перед образованием сложных биопленок в ассоциации с другими микроорганизмами.

Эпидемические вспышки и спорадические случаи болезни легионеров преимущественно выявляют в местах общественного назначения: у посетителей и персонала гостиниц; торговых, спортивных и выставочных комплексов; промышленных предприятий, больниц, учреждений; круизных судов и др. Фактором передачи служит водный мелкодисперсный аэрозоль, содержащий возбудителя и генерируемый системами водных коммуникаций.

Сочетание высокой концентрации легионелл в водной среде с источниками мелкодисперсного аэрозоля позволяет возбудителю инфекции вследствие ингаляции микробного аэрозоля попадать в нижнюю часть респираторного тракта и легкие человека, где происходит контакт с альвеолярными макрофагами, в которых вирулентные штаммы возбудителя активно размножаются.

При спорадическом легионеллезе и отдельных нозокомиальных вспышках заболевания возможна аспирация воды, контаминированной легионеллами без образования аэрозоля (бассейны, емкости для хранения и транспортирования воды и др.). Это обусловлено возрастанием восприимчивости к легионеллезу лиц со сниженной иммунологической реактивностью на фоне сопутствующих заболеваний, иммунодепрессивной терапии и др.

Эпидемические вспышки и спорадические случаи легионеллеза выявляют повсеместно. Особое значение в последние годы уделяется случаям болезни легионеров, возникающим во время поездок, путешествий и диагностируемым после возвращения из них. Инкубационный период составляет от 2 до 10 дней. Более 30% случаев спорадического легионеллеза, многочисленные эпидемические вспышки в гостиницах, на круизных судах послужили причиной создания международной системы эпидемиологического надзора за случаями легионеллеза, связанного с поездками.

В настоящее время известно около 50 видов легионелл, преимущественно выделенных из окружающей среды, из которых собственно болезнь легионеров вызывает вид Legionella pneumophila, насчитывающий 16 серогрупп. Причем более 80% случаев заболевания вызывают штаммы 1-й серогруппы. Среди других представителей рода Legionella в качестве микробов-оппортунистов, вызывающих заболевание при нарушении клеточного иммунитета и/или на коморбидном фоне, следует отметить L. micdadei, L. longbeachae, L. dumoffii и L. bozemanii. Остальные виды Legionella spp. не патогенны для человека.

 4. Материально-техническое обеспечение*

_______________

* Указанное оборудование и расходные материалы могут быть заменены на аналогичные по характеристикам производства других фирм.

4.1. Средства измерения

рН метр - рН 410; диапазон рН от -1 до 14, точность 0,01 рН, температура анализируемой среды от -10 до 100 °С (Белоруссия)

Весы Adventurer

- прецизионные одночашечковые электронные цифровые с функцией обнуления тары и другими вспомогательными функциями, стандартного уровня, максимальная загрузка - 210 г, погрешность при измерении - 0,001 г (OHAUS, США)

Весы ScoutPro - портативные одночашечковые электронные цифровые с функцией обнуления тары, максимальная нагрузка - 2000 г, погрешность при измерении - 0,1 г (OHAUS, США)

4.2. Оборудование

Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П, поддерживающий температуру плюс (160±5) °С (Россия)

Термостат суховоздушный ТС-1/80, объем 80 л с температурой до 60 °С (Россия)

СО

инкубатор МСО 5АС, персональный, объем 49 л, тепловая рубашка, ТС-датчик СО

(Sanyo) или анаэростат GasPak 100 (на 11 чашек), GasPak 150 (на 36 чашек)

Стерилизатор паровой ВК-30 с вертикальной камерой, объем 150 л

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды ГОСТ 6709-72

Облучатель бактерицидный настенный УФИК 1х30

Холодильник бытовой электрический с температурой в камере плюс 4-6 °С

Морозильная камера с температурой в камере до -20 °С

Водяная баня TW 2.03, автоматическое регулирование температуры до 85/90 °С, объем 8,5 л, внутренняя и внешняя циркуляция (Elmi, Латвия)

Батометр Молчанова ГР-18, предназначенный для взятия проб воды с различной глубины водоемов, с одновременным измерением температуры воды исследуемого слоя, при температуре окружающей среды от 1 до 40 °С (Россия)

Прибор для мембранной фильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм и устройство для создания разрежения 0,5-1,0 атм. (САРТОГОСМ, Россия)

Прибор для подсчета колоний бактерий (Schuett)

Мешалка магнитная BioMMS-3000, без подогрева, максимальный объем 2 л, скорость вращения 0-3000 об./мин, размер платформы 150х150 мм

Универсальная центрифуга для пробирок до 50 мл "Ева 21" с роторами 6х50 мл (угловая скорость - до 6000 об./мин), 12х15 мл (угловая скорость - до 6000 об./мин), 30х2 мл (угловая скорость - до 12000 об./мин) (Hettich-Zentrifugen, Германия)

Микроцентрифуга/встряхиватель ТЭТА 2 (Биоком, Россия)

Малогабаритная высокоскоростная лабораторная микроцентрифуга "МиниСпин

", угловая скорость - до 13400 об./мин, 12х1,5 (2,0) мл (Ерpendorf, Германия)

Твердотельный термостат Термо 24-15 с диапазоном рабочих температур от 0 до 120 °С (Биоком, Россия)

Охладитель проб ОП-1 с диапазоном температур oт -4 до 30 °С (Биоком, Россия)

Амплификатор Терцик МС-2 (ДНК-Технология, Россия)

Амплификатор iCycler для проведения ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, оптический и реакционный модули, комплект фильтров iQ5 Optical System (BIORAD, США)

Источник тока Эльф-4 (ДНК-технология, Россия)

Камера для горизонтального электрофореза SE-2 (Хеликон, Россия)

Фотодокументирующая система GelDoc 2000 (BIORAD, США)

4.3. Вспомогательные изделия и расходные материалы

Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89

Пинцет для работы с мембранными фильтрами

Ножницы медицинские ГОСТ 21239-89*

Скальпель хирургический, 15 см ГОСТ 21240-89

Термометр ртутный с диапазоном измерений от 0 до 100 °С ГОСТ 13646-68

Лупа микробиологическая ГОСТ 25706-83

Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82

Часы механические сигнальные ГОСТ 3145-84

Емкости эмалированные

Пробки различных размеров: силиконовые, резиновые и другие, выдерживающие стерилизацию сухим жаром или автоклавированием  ГОСТ 12026-76

Тампоны (свабы) в полипропиленовой пробирке в упаковке с аппликатором-палочкой

Вата хлопковая медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81

Марля медицинская ГОСТ 9412-77*

Маркеры водостойкие

Лейкопластырь

Перчатки резиновые

Шпагат

Бумага плотная для упаковки посуды

Пленка Parafilm A

Газогенераторные пакеты CampyPak для факультативных анаэробов, 10 шт./уп.

Индикаторные полоски СО

, 50 шт./уп.

Мембранные фильтры на основе ацетата целлюлозы для микробиологических целей с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм или другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, имеющие сертификат качества

Мембранные фильтры поликарбонатные с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм

Петли бактериологические

Чашки Петри пластиковые микробиологические, стерильные (Россия) ГОСТ 23932-90

Стекла предметные для микропрепаратов ГОСТ 6672-75

Пробирки типов П1, П2 ГОСТ 25336-82

Бутыли стеклянные градуированные с крышкой автоклавируемые или пластиковые флаконы (одноразовые), емкостью 500 и 1000 мл (Wheaton, США)

Пакеты полиэтиленовые стерильные для отбора проб воды на 100 мл типа "вихрь"

Центрифужные пробирки, объемом 50 и 15 мл

Микроцентрифужные пробирки, объемом 0,2, 0,6 и 1,5 мл (QSP, США)

Автоматические пипетки переменного объема автоклавируемые "Ленпипет" серия Дигитал: 1-10, 5-40, 40-200, 200-1000 мкл (Россия)

Автоматические пипетки переменного объема Eppendorf 500-5000, 1000-10000 мкл

Наконечники до 10 мкл (QSP, США)

Наконечники до 200 мкл с фаской (QSP, США)

Наконечники до 1000 мкл (QSP, США)

Наконечники до 5000 мкл (Eppendorf, Германия)

Наконечники до 10000 мкл (Eppendorf, Германия)

Наконечники с фильтром до: 10, 100, 200, 1000 мкл (QSP, США)

Штативы для центрифужных пробирок, объемом 50 и 15 мл (Германия)

Штатив "рабочее место" для микропробирок, объемом 1,5 мл (Хеликон, Россия)

Штатив "рабочее место" для микропробирок, объемом 0,6 мл (Хеликон, Россия)

Штатив "рабочее место" для микропробирок, объемом 0,2 мл (Хеликон, Россия)

Штатив для пипеток переменного объема (Ленпипет, Россия)

Штатив для хранения микропробирок, объемом 1,5 мл (Хеликон, Россия)