Методические указания по методам контроля МУК 4.1.770-99 Количественное определение формальдегида в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

     МУК 4.1.770-99

 4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 Количественное определение формальдегида в крови

методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Дата введения 1999-09-06

УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 6 июля 1999 г.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 "Методики выполнения измерений", ГОСТа Р 1.5-92 "Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика анализа аттестована и обеспечивает определение формальдегида в диапазоне концентраций 0,05-3,0 мкг/см

.

Формальдегид (муравьиный альдегид, метаналь) - газ с резким запахом. 35-40%-ный водный раствор формальдегида называется формалином или формолем. Растворы выделяют газообразный формальдегид при комнатной температуре. Т

- минус 19,3

°

С, Т

- минус 118,3

°

С. Формальдегид растворим в воде и органических растворителях (бензол, толуол, ацетон, этанол, этилацетат и др.). Формальдегид - раздражающий газ, вызывает дегенеративные процессы в паренхиматозных органах, сенсибилизирует кожу, действует на ЦНС. Относится ко 2 классу опасности.

Содержание формальдегида в крови контрольной группы - мкг/см

.

Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью результата измерений 20,0% при доверительной вероятности 0,95.

 Сущность метода

Методика основана на предварительном переводе формальдегида в 2,4-динитрофенилгидразон формальдегида, экстракции продукта дериватизации из биологического материала гексаном, упаривании гексанового экстракта, растворении упаренного остатка в ацетонитриле и анализе на жидкостном хроматографе.

Измерение концентрации формальдегида выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора.

Определению не мешают метанол, этанол, уксусный альдегид, ацетон, муравьиная кислота и другие карбонильные соединения.

Длительность анализа, включая подготовку пробы, - 50 мин.

 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

При выполнении анализа применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными метрологическими характеристиками.

Средства измерений
Жидкостный хроматограф с насосом высокого давления (ЧССР) и ультрафиолетовым детектором LCD 2563 (ЧССР)
Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические	ТУ 25-06113-79
Разновесы Г -210	ГОСТ 73208-82*
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2, пределы 0-100 °С, цена деления 1 °С	ТУ 25-2021-003-88
Секундомер "Агат"	ГОСТ 5072-792.2*
Микрошприцы МШ-10	ТУ 5Е2.833.106
Лупа измерительная	ГОСТ 25706-83
Линейка металлическая измерительная, цена деления 1 мм	ГОСТ 17435-72
Цилиндр мерный вместимостью 50 см	ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные вместимостью 1, 5 и 10 см	ГОСТ 20292-74*
Пробирки центрифужные мерные вместимостью 10 см
Колбы мерные вместимостью 50, 100 см	ГОСТ 1770-74
Стандартные образцы:
Формальдегид в воде с концентрацией 1,0 мг/см	ГСО 6263-91.2.1
Вспомогательные устройства
Колонка из кварцевого стекла длиной 15 см и внутренним диаметром 3,3 мм, заполненная сорбентом Separon С 18 с размером частиц 5 мкм
Центрифуга СМ-4 (2750 об/мин)
Дистиллятор	ТУ 61-1-721-79
Сушильный шкаф ШСС-80 П УХЛ 4.2	ТУ 16.531.743-83
ИК-лампа
Дефлегматор длиной 300 мм	ГОСТ 9425-60
Холодильник шариковый ХШ-300 (6 шар.)	ГОСТ 1770-74
Холодильник прямой ХПТ-3-300	ГОСТ 1770-74
Воронка Шотта (пор 16)	ГОСТ 25336
Воронки делительные вместимостью 250 см	ГОСТ 23932-79
Бюксы вместимостью 10 см с притертой крышкой	ГОСТ 25336-82
Стакан термостойкий вместимостью 2 дм	ГОСТ 25336-82
Колба для перегонки круглодонная вместимостью 2 дм	ГОСТ 25336-82
Реактивы
Гексан, х.ч., очищенный для хроматографии	ГОСТ 6-09-4521-77*
Ацетонитрил, ч., очищенный для хроматографии	ТУ 6-09-3534-87
Вода дистиллированная 2,4-динитрофенилгидразин, ч., очищенный перекристаллизацией из ацетонитрила, чистота не менее 99,0%.	ГОСТ 6709-72
2,4-динитрофенилгидразон формальдегида, перекристаллизованный из метанола или этанола, чистота не менее 99,0%	ТУ 6-09-2394-77
Кислота соляная (плотность 1,19), х.ч.	ГОСТ 3118-77
Перманганат калия, ч.	ГОСТ 20490-75
Калий двухромовокислый, ч.д.а.	ГОСТ 4220-75

Требования к безопасности

Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям "Пожарных норм проектирования зданий и сооружений" (СНиП ПА-5-700) и "Санитарных норм проектирования промышленных предприятий" (СН-245-71*) и СНиП-74.

При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.

При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях", утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М.,1981), и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением", утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989).

При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

 Требования к квалификации оператора

К выполнению хроматографических измерений биологических проб допускаются лица, прошедшие обучение работе на жидкостном хроматографе.

 Условия измерений

При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

температура воздуха (20±10) °С;

атмосферное давление 630-800 мм рт.ст.;

влажность воздуха - не более 80% при температуре 25 °С.

Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

 Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды и растворителей, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

Подготовка посуды

Используемую посуду необходимо тщательно вымыть хромовой смесью, тщательно ополоснуть водопроводной и дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С.

Подготовка растворителей

Очистка ацетонитрила от примесей. В колбу, вместимостью 2 дм

, помещают 1 дм

ацетонитрила и 20 г КМnO

, кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч, затем перегоняют с дефлегматором, отбирая фракции по 200 см

. Когда в колбе останется около 200 см

продукта, перегонку прекращают. Остаток можно смешивать с новой порцией растворителя. Первую фракцию отбрасывают, а остальные проверяют на поглощение в УФ-области.

Приготовление растворов

Хромовая смесь. В термостойкий стакан, вместимостью 2 дм

, насыпают 50 г хромовокислого калия, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 дм

концентрированной серной кислоты.

Элюент для хроматографии. 50 см

очищенного ацетонитрила смешивают с 50 см

дистиллированной воды. Подвижную фазу фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия или азота в течение 5-10 мин со скоростью 50-60 об

/мин.

Соляная кислота, 2 моль/дм

. 163,0 см

концентрированной HCl (плотность 1,19 г/см

) вносят в мерную колбу вместимостью 1 дм

, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

2,4-динитрофенилгидразин, 0,2%-ный раствор в 2М соляной кислоте. 0,2 г 2,4-динитрофенилгидразина вносят в мерную колбу вместимостью 100 см

и доводят до метки 2М раствором соляной кислоты.

Исходный раствор формальдегида для калибровки (раствор А). 1 см

ГСО формальдегида с концентрацией 1,0 мг/см

переносят в мерную колбу вместимостью 100 см

и доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора - 36 ч.

Рабочий раствор для градуировки УФ-детектора. В мерную колбу вместимостью 100 см

вносят 10 см

раствора А и доводят дистиллированной водой до метки (раствор Б). Срок хранения раствора - 36 ч.

Идентификация хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида. Готовят раствор 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида в ацетонитриле с концентрацией 0,01-0,02 мг/см

, вводят в колонку хроматографа 1-2 мм

раствора. Снимают хроматограмму в условиях хроматографического анализа и определяют время удерживания 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида.

Подготовка хроматографической колонки

Колонку устанавливают на хроматограф и подают элюирующую жидкость (ацетонитрил : вода = 1:1) со скоростью 1 см

/мин до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме от концентрации формальдегида в крови, устанавливают по пяти сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из шести растворов, готовят из растворов А и Б.

Растворы для установления градуировочной характеристики готовят в мерных колбах вместимостью 50 см

. Для этого в каждую колбу вносят раствор А (или раствор Б) в соответствии с таблицей, доводят объем до метки цельной кровью, не содержащей формальдегид, и тщательно перемешивают. Растворы готовят непосредственно перед определением.

Таблица

Растворы для установления градуировочной характеристики

при определении концентрации формальдегида в крови

Номер раствора	1	2	3	4	5	6
Объем раствора А (конц. 10 мкг/см ), см	-	-	0,25	0,50	1,00	1,50
Объем раствора Б(конц. 1 мкг/см ), см	0,25	0,50	-	-	-	-
Массовая концентрация формальдегида, мкг/см	0,05	0,10	0,50	1,00	2,00	3,00

2 см

каждого рабочего раствора помещают в делительную воронку, добавляют 40 см

дистиллированной воды, 2 см

0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2М соляной кислоте, 2 капли концентрированной соляной кислоты, 5 см

гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения гексана и крови верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 1-2 мин со скоростью 2750 об/мин, затем 1,5 см

гексана переносят в бюкс и выпаривают досуха под ИК-лампой. Высушенный остаток растворяют в 0,4 см

ацетонитрила и вводят в хроматограф аликвотную часть (10 мкл). Проводят по пять параллельных вводов обработанных экстрактов каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях:

подвижная фаза	ацетонитрил : вода = 1:1
скорость движения элюента	0,6 см /мин,
скорость диаграммной ленты	0,3 см/мин,
длина волны УФ-детектора	365 нм,
шкала детектора	2,
время удерживания:
2,4-динитрофенилгидразина	4 мин 20 с,
2,4-динитрофенилгидразона формальдегида	5 мин 50 с.

По средним для каждой точки значениям аналитического сигнала (площади пика) строят градуировочную характеристику

, где

-

площадь пика, мм

(или усл. ед.);

- концентрация градуировочного раствора, мкг/см

. По установленной градуировочной характеристике и по значению аналитического сигнала пробы определяют концентрацию формальдегида в исследуемом образце.

Отбор проб

Для отбора проб крови используют чистую посуду объемом 10 см

. Кровь отбирают из вены в количестве 2 см

. Срок хранения пробы крови в холодильнике - не более 48 ч.

 Выполнение измерений

2 см

анализируемой пробы помещают в делительную воронку, добавляют 40 см

дистиллированной воды, 2,0 см

0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2М соляной кислоте, 2 капли концентрированной соляной кислоты, 5 см

гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения жидкостей верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 1-2 мин со скоростью 2750 об/мин, затем 1,5 см

гексана переносят в бюкс и выпаривают досуха под ИК-лампой. Высушенный остаток растворяют в 0,4 см

ацетонитрила и вводят в хроматограф аликвотную часть (10 мм

). Анализ проводят при вышеуказанных условиях работы хроматографа. По установленной градуировочной характеристике и по значению аналитического сигнала пробы определяют концентрацию формальдегида в исследуемом образце.

 Вычисление результатов измерения

Вычисляют значение площади хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида по формуле:

, мм

,

где

- высота пика, мм;

- ширина пика на половине высоты, мм.

Из градуировочных характеристик по значению площади хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида находят массовую концентрацию формальдегида в крови, мкг/см

.

 Внутренний оперативный контроль

Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).

Оперативный контроль сходимости

Периодичность контроля сходимости измерений зависит от количества рабочих измерений (2 параллельные пробы). Отбирают 2 пробы крови и каждую из них анализируют в точном соответствии с прописью методики.

Результаты признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

,

где

и

- результаты анализа 1 и 2 проб;

- допустимое расхождение между двумя результатами одной и той же пробы (

=55%);

- среднее значение между двумя определениями.

Оперативный контроль точности

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50-150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы

и рабочей пробы с добавкой

.

Результаты анализа исходной рабочей пробы

и рабочей пробы с добавкой

получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

,

где

-

добавка к пробе в виде раствора с концентрацией мкг/см

;

- норматив оперативного контроля погрешности, мкг/см

.

При внешнем контроле (

=0,95) принимают

*,

где

и

- характеристики погрешностей для исходной пробы и пробы с добавкой, мкг/см

.

и

.

При внутрилабораторном контроле

(

=

0,90) принимают, что

.

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.