ГОСТ 32113-2013 Продукция алкогольная и сырье для ее производства. Ферментативный метод определения массовой концентрации лимонной кислоты.

     ГОСТ 32113-2013

Группа Н79

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

 ПРОДУКЦИЯ АЛКОГОЛЬНАЯ И СЫРЬЕ ДЛЯ ЕЕ ПРОИЗВОДСТВА

Ферментативный метод определения массовой концентрации лимонной кислоты

Alcoholic products and raw materials for their production. Enzymatic method for determination of citric acid mass fraction*

_____________

* Измененная редакция, Изм. N 1.     

МКС 67.160.10

Дата введения 2014-01-01

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности" Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИПБиВП Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 марта 2013 г. N 55-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 5 июня 2013 г. N 145-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32113-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2014 г.

5 Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52391-2005

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

ВНЕСЕНО Изменение N 1, утвержденное и введенное в действие Приказом Росстандарта от 27.07.2015 N 998-ст c 01.01.2016

      1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на вина, виноматериалы, игристые вина (шампанское), винные напитки и сырье для их производства (далее - продукт) и устанавливает ферментативный метод определения массовой концентрации лимонной кислоты в указанных продуктах. Диапазон измерений - от 0,01 до 2,00 г/дм

.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

      2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.2.007.0-75 Система стандартов безопасности труда. Изделия электротехнические. Общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.103-83 Система стандартов безопасности труда. Одежда специальная защитная, средства индивидуальной защиты ног и рук. Классификация

ГОСТ 908-2004 Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3769-78 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4201-79 Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе

ГОСТ 4529-78 Реактивы. Цинк хлористый. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике*

________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31730-2012 Продукция винодельческая. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 32095-2013 Продукция алкогольная и сырье для ее производства. Метод определения объемной доли этилового спирта

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим выпускам ежемесячно издаваемого информационного указателя за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

      3 Требования безопасности

3.1 Требования электробезопасности при работе с приборами - по ГОСТ 12.2.007.0.

3.2 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

3.3 При выполнении анализов необходимо выполнять требования безопасности при работе с химическими реактивами согласно ГОСТ 12.4.103.

      4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

Спектрофотометр с шириной спектральной полосы не более 10 нм для измерений при длинах волн 334, или 340, или 365 нм, с пределами допускаемых значений абсолютной погрешности при измерении коэффициента пропускания ±1% (кюветы из оптического стекла или полимерных материалов с толщиной поглощающего свет слоя 1 см).

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности ±0,001 г.

рН-метр с диапазоном измерения от 1 до 10 ед. рН; погрешность измерения - не более ±0,05 ед. рН.

Секундомер с диапазоном измерения от 60 с до 30 мин; погрешность измерения - не более ±0,5 мин.

Пипетки с одной меткой 1-2-1, 1-1-1, 1-2-2, 1-1-2, 1-2-5, 1-1-5, 1-2-10, 1-1-10, 1-2-25, 1-1-25 по ГОСТ 29169.

Пипетки градуированные 1-1-1-0,5; 1-1-2-0,5; 2-1-1-0,5; 2-1-2-0,5; 2-1-1-0,5; 1-1-1-1; 1-1-2-1; 2-1-1-1; 2-1-2-1; 2-1-1-1; 1-1-1-2; 1-1-2-2; 2-1-1-2; 2-1-2-2; 2-1-1-2; 1-1-1-5; 1-1-2-5; 2-1-1-5; 2-1-2-5; 2-1-1-5 по ГОСТ 29227.

Микропипетки вместимостью 5-50, 100-1000 мкл.

Колбы мерные 1-100-2, 2-100-2, 3-100-2, 1-500-2, 2-500-2, 3-500-2 по ГОСТ 1770.

Термометр жидкостный стеклянный по ГОСТ 28498 с диапазоном измерения от 10 °С до 50 °С, цена деления 1 °С.

Гигрометр психрометрический.

Колбы Кн-1-50, Кн-2-50 по ГОСТ 25336.

Воронка В-56-80 ХС по ГОСТ 25336.

Стаканы В-1-10 ТС, Н-1-10 ТС, В-1-25 ТС, Н-1-25 ТС по ГОСТ 25336.

Цилиндры 1-50-2, 1-100-2, 1-250-2 по ГОСТ 1770.

Палочка стеклянная или пластмассовая.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.

Кислота лимонная пищевая по ГОСТ 908, экстра.

глицилглицин, препарат массовой долей не менее 99% основного вещества.

Цинк хлористый по ГОСТ 4529, х.ч.

Никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (НАДН), препарат массовой долей основного вещества не менее 90%.

L-малатдегидрогеназа (L-МДГ), ферментативная активность не менее 136 Е (ЕС 1.1.1.37).

L-лактатдегидрогеназа (L-ЛДГ), ферментативная активность не менее 280 Е (ЕС 1.1.1.27).

Цитратлиаза (ЦЛ), ферментативная активность не менее 12 Е (ЕС 4.1.3.6).

Аммоний сернокислый по ГОСТ 3769, х.ч.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Вода бидистиллированная по ГОСТ 4517.

Натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201, х.ч.

Поливинилполипирролидон (ПВПП).

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья по ГОСТ 5962.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.

Допускается применение средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также посуды, реактивов и материалов, по качеству не хуже вышеуказанных.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

      5 Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 31730.

      6 Подготовка к выполнению измерений

      6.1 Условия выполнения измерений

При выполнении измерений необходимо соблюдать следующие условия:

      6.2 Подготовка и отбор кювет

Кюветы, предназначенные для определения, моют 10%-ным раствором соляной кислоты приготовленной по ГОСТ 4517; затем трижды промывают дистиллированной водой и один раз этиловым спиртом. Не допускаются применение растворов щелочей, концентрированных кислот и механическая чистка кювет с помощью абразивных средств. Затем кюветы высушивают на фильтровальной бумаге под стеклянным стаканом при комнатной температуре.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

      6.3 Приготовление рабочих растворов

6.3.1 Приготовление раствора хлористого цинка (

) массовой концентрацией 80 мг/100 см

В мерную колбу вместимостью 100 см

переносят 80 мг хлористого цинка, добавляют 10 см

бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения. Затем объем доводят до метки бидистиллированной водой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 1 мес.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

6.3.2 Приготовление раствора натрия гидроокиси молярной концентрацией

(

)=5 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 500 см

наливают 200-250 см

бидистиллированной воды. Затем постепенно, не допуская разогрева свыше 50 °С, вносят 100 г натрия гидроокиси. Закрывают колбу пробкой и перемешивают круговыми движениями до полного растворения щелочи. Раствор охлаждают до температуры 20 °С - 25 °С, доводят до метки бидистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 3 мес.

6.3.3 Приготовление раствора сернокислого аммония молярной концентрацией

[

]=3,2 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 100 см

переносят 42,28 г сернокислого аммония, добавляют 60 см

бидистиллированной воды и перемешивают круговыми вращениями. Затем объем доводят до метки бидистиллированной водой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 3 мес.

6.3.4 Приготовление буферного раствора с рН=7,8 ед. рН

В мерную колбу вместимостью 500 см

переносят 7,13 г глицилглицина, добавляют 70 см

бидистиллированной воды и перемешивают. Затем добавляют 13 см

раствора натрия гидроокиси молярной концентрацией 5 моль/дм

, приготовленного по 6.3.2, 10 см

раствора хлористого цинка, приготовленного по 6.3.1, и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

Срок хранения раствора при температуре 4 °С - не более четырех недель. Еженедельно проверяют значение рН.

6.3.5 Приготовление раствора никотинамидадениндинуклеотида восстановленного

В стакан вместимостью 25 см

вносят 30 мг НАДН, растворяют в 6 см

бидистиллированной воды. Затем добавляют 60 мг углекислого кислого натрия и перемешивают.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

6.3.6 Приготовление раствора L-малатдегидрогеназы/L-лактатдегидрогеназы

В стакан вместимостью 10 см

вносят микропипеткой 1 см

раствора L-МДГ массовой концентрацией 5 мг/см

, 0,4 см

раствора сернокислого аммония молярной концентрацией 3,2 моль/дм

(приготовленного по 6.3.3), 0,5 см

раствора L-ЛДГ массовой концентрацией ферментного препарата 5 мг/см

и перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре минус 20 °С - не более четырех недель.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

6.3.7 Приготовление раствора цитратлиазы

В стакан вместимостью 10 см

вносят 50 мг ЦЛ. Затем добавляют 1 см

ледяной бидистиллированной воды и перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре минус 20 °С - не более четырех недель.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

6.3.8 Приготовление контрольного раствора лимонной кислоты

В мерную колбу вместимостью 100 см

вносят от 0,200 до 0,500 г лимонной кислоты и доводят до метки раствором этилового ректификованного спирта объемной долей 10%.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 6 мес.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

      6.4 Подготовка приборов

Подготовку спектрофотометра и рН-метра к измерениям осуществляют в соответствии с руководствами по эксплуатации этих приборов.

Нулевое показание по шкале оптической плотности устанавливают по воздуху.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

      7 Выполнение измерений

      7.1 Подготовка пробы

7.1.1 Удаление диоксида углерода (двуокиси углерода)

Пробы продуктов, насыщенных диоксидом углерода, предварительно дегазируют. Избыток диоксида углерода удаляют в соответствии с ГОСТ 32095 (пункт 6.1).

7.1.2 Обесцвечивание интенсивно окрашенных проб продуктов

Интенсивно окрашенные красные пробы продуктов предварительно подвергают обесцвечиванию с помощью ПВПП.

В стакан вместимостью 25 см

вносят 0,2 г ПВПП, добавляют 10-15 см

дистиллированной воды и перемешивают. Затем отстаивают в течение 15 мин и фильтруют через бумажный складчатый фильтр из фильтровальной бумаги по ГОСТ 12026. Осадок, оставшийся на фильтре, переносят в коническую колбу вместимостью 50 см

, добавляют 10 см

пробы продукта, перемешивают в течение двух-трех минут, а затем фильтруют через бумажный складчатый фильтр из фильтровальной бумаги по ГОСТ 12026. Полученный обесцвеченный фильтрат используют для дальнейших определений.

7.1.1, 7.1.2 (Измененная редакция, Изм. N 1).

7.1.3 Разбавление пробы

В зависимости от проведенной оценки значения массовой концентрации лимонной кислоты пробу разбавляют дистиллированной водой в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1

Диапазон измерений массовой концентрации лимонной кислоты, г/дм						Коэффициент разбавления
От	0,01	до	0,24	включ.		1
Св.	0,24	"	0,85	"		4
"	0,85	"	1,25	"		5
"	1,25	"	2,00	"		10

(Измененная редакция, Изм. N 1).

      7.2 Измерение оптической плотности

В кюветы с помощью пипетки и микропипетки дозируют растворы реактивов и пробу в количествах и в порядке, указанном в таблице 2.

Таблица 2

Наименование растворов	Объем, см
	Холостой раствор	Испытуемый раствор  ( )
Буферный раствор по 6.3.4	1,00	1,00
Раствор НАДН по 6.3.5	0,10	0,10
Проба	-	0,20
Бидистиллированная вода	2,00	1,80
Раствор L-МДГ/L-ЛДГ по 6.3.6	0,02	0,02

Растворы в кювете осторожно перемешивают стеклянной или пластмассовой палочкой и выдерживают в течение (5,0±0,5) мин.

Проводят измерение оптической плотности относительно воздуха контрольного (

) и испытуемого (

) растворов с записью результата измерения до третьего знака после запятой.

Затем в растворы, находящиеся в кюветах, добавляют по 0,02 см

раствора цитрат-лиазы, приготовленного по 6.3.7, перемешивают и выдерживают в течение (5,0±0,5) мин. Повторно проводят измерение оптической плотности относительно воздуха контрольного (

) и испытуемого (

) растворов с записью результата измерения до третьего десятичного знака.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

      8 Обработка результатов измерений

8.1 Массовую концентрацию лимонной кислоты

, г/дм

, вычисляют по формуле

,                                                    (1)

где

- молярная масса лимонной кислоты, равная 192,1 г/моль;

- общий объем раствора в кювете, равный 3,12 см

(см. таблицу 2);

- коэффициент предварительного разбавления пробы;

- разность значений оптических плотностей, вычисляемая по формуле

,                                (2)

где

и

- значения оптической плотности раствора с пробой продукта до и после добавления раствора МДГГ/ЛДГГ (см. 6.3.6);

и

- значения оптической плотности холостой пробы до и после добавления раствора L-МДГГ/L-ДГГ (см. 6.3.6);

-молярный коэффициент поглощения НАДН, (дм

·ммоль

·см

):

- при 340 нм - 6,30;

- при 365 нм - 3,40;

- при 334 нм - 6,18;

- толщина поглощающего свет слоя кюветы, равная 1 см;

- объем пробы продукта, равный 0,20 см

(см. таблицу 2);

1000 - коэффициент пересчета ммоль в моль.

Примечание - Если

имеет отрицательное значение, то его суммируют с

. Определенная разность значений оптических плотностей

, как правило, составляет не менее 0,100 и не более 0,800. В противном случае изменяют коэффициент разбавления по 7.1.3.

8.2 За результат определения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, абсолютное расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (сходимости)

.

Результаты измерений считают приемлемыми при условии

,                                             (3)

где

,

- результаты двух параллельных определений массовой концентрации лимонной кислоты, г/дм

;

- среднеарифметическое значение двух параллельных определений массовой концентрации лимонной кислоты, г/дм

;

- предел повторяемости (сходимости), приведенный в таблице 2а, %.

Если условие (3) не выполняется, то проводят повторные измерения и проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости) в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-6 (подраздел 4.2).

8.1, 8.2 (Измененная редакция, Изм. N 1).

8.3 Результат определений в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде

, при

0,95,

где

- среднеарифметическое значение результатов

определений, признанных приемлемыми по 8.2, г/дм

;

- границы относительной погрешности измерений (см. таблицу 2а), %.

Таблица 2а

Диапазон измерений массовой концентрации лимонной кислоты, г/дм	Предел повторяемости (сходимости) , %, при 0,95	Предел воспроизводимости , %, при 0,95	Границы относительной погрешности , %, при 0,95
От 0,01 до 2,00 включ.	5	7	5

Если содержание лимонной кислоты выходит за пределы границы диапазона измерений, приводят следующую запись в журнале: "Массовая концентрация лимонной кислоты менее 0,01 г/дм

(более 2,00 г/дм

)".

(Введен дополнительно, Изм. N 1).

      9 Контроль точности результатов

      9.1 Контроль повторяемости (сходимости)

При контроле повторяемости (сходимости) абсолютное значение разности двух результатов параллельных определений, полученных в условиях повторяемости (на одной и той же пробе, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования, в пределах короткого промежутка времени), не должно превышать абсолютного предела повторяемости (сходимости)

, т.е. с вероятностью

0,95 должно выполняться условие (3).

      9.2 Контроль воспроизводимости

При контроле воспроизводимости абсолютное значение разности двух результатов определений в одной и той же пробе, полученных в условиях воспроизводимости (в двух лабораториях, разными операторами, с использованием различного оборудования), не должно превышать предела воспроизводимости

. Значения

приведены в таблице 2а. Результаты измерений считают приемлемыми при условии

.                                                  (4)

(Измененная редакция, Изм. N 1).

      9.3 Контроль погрешности

При проведении контроля погрешности метода используют контрольный раствор лимонной кислоты лабораторного приготовления. Схема дозирования представлена в таблице 3.

Таблица 3

Наименование раствора	Объем, см
	Контрольный раствор	Проба	Контрольный раствор + проба
Буферный раствор по 6.3.4	1,00
Раствор НАДН по 6.3.5	0,10
Проба	-	0,20	0,10
Контрольный раствор	0,20	-	0,10
Бидистиллированная вода	1,80
Раствор L-МДГ/L-ЛДГ по 6.3.6	0,02

Растворы в кюветах осторожно перемешивают стеклянной или пластмассовой палочкой и выдерживают в течение (5,0±0,5) мин. Проводят измерение оптической плотности

(для контрольного, испытуемого, контрольного и контрольного + испытуемого растворов). Далее процедуру анализа продолжают в соответствии с 7.2.

Разность значений оптических плотностей вычисляют по формуле (2) и формулам

,              (5)

где

и

- значения оптической плотности смеси контрольного раствора с пробой продукта до и после добавления раствора МДГГ/ЛДГГ (см. 6.3.6);

и

- значения оптической плотности холостой пробы до и после добавления раствора L-МДГГ/L-ДГГ (см. 6.3.6).

,                        (6)

где

и

- значения оптической плотности контрольного раствора до и после добавления раствора МДГГ/ЛДГГ (см. 6.3.6).

Вычисляют степень повторного нахождения стандарта, %, по формуле

,                                    (7)

где

- значение разности оптических плотностей, найденное по формуле (5);

- значение разности оптических плотностей, найденное по формуле (6).

Степень повторного нахождения должна находиться в интервале:

95%

100%.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

(Измененная редакция, Изм. N 1).