ГОСТ Р 50928-96
Группа С19
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРЕМИКСЫ
Методы определения витаминов A, D, Е
Premixes.
Methods for determination of vitamins A, D, E
ОКС 65.120
ОКСТУ 9209, 9709
Дата введения 1997-01-01
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН МТК 4, АООТ "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (АООТ "ВНИИКП")
2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 июля 1996 года N 487
3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
4 ПЕРЕИЗДАНИЕ
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на премиксы и устанавливает хроматографические методы определения витаминов A, D, Е в премиксах с различными наполнителями из одной навески.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия
ГОСТ 4166-76 Натрий сернокислый. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9412-93 Марля медицинская. Технические условия
ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия
ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
_________________
* С 1 июля 2002 года вводится в действие ГОСТ 24104-2001.
ГОСТ 24363-80 Калия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26573.0-85 Премиксы. Технические условия
ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
3 Определение витаминов А, Е обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией
Сущность метода заключается в экстракции витаминов А (ретинола ацетат) Е (
-токоферола ацетата) из премикса изопропиловым спиртом и последующем анализе содержания витаминов с использованием жидкостного хроматографа "Милихром".
3.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Хроматограф жидкостный микроколоночный "Милихром" по нормативному документу [1] или его последующие модификации со спектрофотометрическим детектором и спектральным диапазоном 190-360 нм.
Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы 186-1100 нм.
Колонка хроматографическая одного из указанных размеров: 2x64, 2x80, 2x120 мм с числом теоретических тарелок не менее 4 тыс., заполненная одним из следующих сорбентов: Силасорб С 18, Силасорб РНС 18, Сепарон С 18.
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Насос водоструйный по ГОСТ 25336.
Баня водяная с терморегулятором.
Колбы конические со шлифом вместимостью 25, 50 см
Пипетки 1-1-(1, 2)-1 по ГОСТ 29169.
Пипетки 1-1-1(2)-1(10) по ГОСТ 29227.
Цилиндры 1(2, 3, 4)-100, 1(2, 3, 4)-500 по ГОСТ 1770.
Колбы мерные 2-25-1(2) (исполнения 2, вместимостью 25 см
, 1-го или 2-го класса точности) по ГОСТ 1770.
Колбы мерные 2-50-1(2) по ГОСТ 1770.
Воронка ВФО-40-ПОР 16 ХС по ГОСТ 25336.
Холодильник ХПТ-1-100-18 ХС по ГОСТ 25336.
Ретинол ацетат по нормативному документу [11].
Витамин Е-ацетат по нормативному документу [12].
Спирт изопропиловый (пропанол-2), х. ч. по нормативному документу [2].
Спирт пропиловый (пропанол-1), х. ч. по нормативному документу [3].
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, х. ч. по нормативному документу [4].
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
3.2 Порядок подготовки к проведению контроля
3.2.1 Отбор проб - по ГОСТ 13496.0
3.2.2 Приготовление элюента для хроматографии
Трехкомпонентный элюент готовят смешиванием ацетонитрила, пропилового спирта и дистиллированной воды в объемном соотношении 42:50:8. Для этого в склянку вместимостью 1000 см
вносят цилиндром 500 см
пропилового спирта, 420 см
ацетонитрила и 80 см
дистиллированной воды.
Приготовленную смесь растворителей фильтруют через стеклянный фильтр и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой. Полученный раствор можно хранить в течение 1 мес.
3.2.3 Подготовка хроматографической колонки
При использовании новой колонки или колонки после длительного перерыва в работе из нее следует удалить воздух и тщательно промыть элюентом до получения стабильной нулевой линии. Для этого через колонку пропускают элюент в количестве 20-30 свободных объемов колонки, т.е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 50 мкдм
/мин, а затем 100 мкдм
/мин. Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.
После промывки колонки проводят ее насыщение витаминами А, Е, для этого выполняют 7-10 анализов наиболее концентрированных градуировочных растворов витаминов А, Е. Насыщение колонки прекращают, когда отношение разности между двумя последовательными определениями концентрации витамина А(Е) к среднему арифметическому значению этих операций не превышает 3%.
При правильной эксплуатации колонка выдерживает 500-600 анализов.
3.2.4 Приготовление растворителя для экстракции витаминов А, Е из премикса
Для экстракции витаминов используют двухкомпонентный экстрагент состава: изопропиловый спирт и дистиллированную воду в объемном соотношении 97:3. Для этого в мерную колбу вместимостью 1000 см
вносят пипеткой 30 см
дистиллированной воды и доводят до метки изопропиловым спиртом.
Хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой до полного использования экстрагента.
3.2.5 Определение активности витамина А в масляном препарате
(0,1±0,002) г препарата растворяют в абсолютном спирте в мерной колбе вместимостью 50 см
. Доводят этим же спиртом объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Отбирают 1-2 см
полученного раствора в колбу вместимостью 50 см
, заполняют ее до метки абсолютным спиртом и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной слоя 1 см. В качестве контрольного раствора применяют абсолютный спирт.
Массовую концентрацию витамина А,
, г/см
, определяют по формуле
, (1)
где
- оптическая плотность раствора;
,
- первое и второе разведения, см
;
- плотность препарата, г/см
;
- масса навески препарата, г;
- объем раствора, используемый для второго разведения, см
;
1550 - удельный показатель поглощения Е
при длине волны 326 нм для 100%-ного раствора витамина А в абсолютном спирте;
100 - коэффициент.
Содержание витамина А в 1 см
соответственно должно быть 0,0310-0,0378 г (90000-110000 ME), 0,0619-0,0757 г (180000-220000 ME), 0,0774-0,0946 г (225000-275000 ME).
Полученные результаты используют для расчета содержания витамина А в стандартном раст
воре.
3.2.6 Построение градуировочного графика для витамина А
Для приготовления стандартного раствора взвешивают навеску масляного препарата витамина А, необходимую для получения раствора с активностью 30000 ME в 50 см
или 600 МЕ/см
. Навеску помещают в мерную колбу вместимостью 50 см
, растворяют в изопропиловом спирте, перемешивают и доводят этим спиртом до метки.
Раствор хранят в холодильнике в емкости с притертой пробкой и используют в течение одной недели.
Из этого раствора готовят градуировочные (рабочие) растворы, содержащие 120, 300, 600, 1200, 3000, 6000, 12000 ME витамина А в 25 см
. Для этого берут соответственно 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0 см
основного раствора, помещают в мерные колбы вместимостью 25 см
и доводят до метки изопропиловым спиртом.
Срок годности растворов не более 1 мес при хранении в холодильнике в емкости с притертой пробкой при температуре 4-10 °С.
Полученные рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе "Милихром" при следующих условиях:
хроматографическая колонка 2x64 (2x80), (2x120) мм;
сорбент - Силасорб С
, Силасорб SPHC
, Сепарон С
;
трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;
объем пробы - 6 мкдм
;
длина волны - 328 нм;
постоянная времени - 0,2 с;
скорость подачи элюента - 150 мкдм
/мин.
Удерживаемый объем пика витамина А составляет 300-360 мкдм
(может меняться в зависимости от длины колонки).
Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 100-200 мкдм
элюента до выхода на нулевую линию.
Значения средних высот хроматографических пиков, выраженных в единицах оптической плотности (е.о.п.), откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс - значения активности витамина А в 25 см
раствора.
Градуировочный график строят также, откладывая по оси ординат средние высоты хроматографических пиков, выраженные в миллиметрах.
Построение градуировочных графиков можно заменить расчетом коэффициентов наклона
, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм, по формуле
, (2)
где
- коэффициент наклона градуировочного графика для
-го градуировочного раствора, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм;
- количество точек, по которым строится градуировочная кривая.
Значение коэффициента наклона
, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм, вычисляют по формуле
, (3)
где
- содержание витамина А в соответствующем
-м градуировочном растворе, ME;
- высота
-го хроматографического пика, е.о.п. или мм.
3.2.7 Построение градуировочного графика для витамина Е
0,02 г витамина Е-ацетата стандарта растворяют в изопропиловом спирте в колбе вместимостью 50 см
, доводят спиртом до метки и перемешивают. Получают основной раствор витамина Е с концентрацией 0,4 мг/см
.
Из полученного основного раствора готовят рабочие растворы, содержащие 7, 5, 3, 1, 0,5, 0,1 и 0,05 мг витамина Е в 25 см
раствора. Для этого соответственно 17,5; 12,5; 7,5; 2,5; 2,25; 1,25; 0,25; 0,125 см
основного раствора помещают в мерные колбы вместимостью 25 см
и объем доводят до метки изопропиловым спиртом. Рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:
хроматографическая колонка 2x64 мм (2x80 мм), (2x120 мм);
сорбент - Силасорб C
, Силасорб SPHC
, Сепарон С
;
трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;
объем пробы - 6 мкдм
;
длина волны - 286 нм;
скорость подачи элюента - 100 мкдм
/мин;
постоянная времени - 0,2 с.
Удерживаемый объем пика витамина Е составляет 540-660 мкдм
(может меняться в зависимости от длины колонки).
Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 200-250 мкдм
элюента до выхода на нулевую линию.
Значение средних высот хроматографических пиков (в единицах оптической плотности или миллиметрах) откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс - значение активности витамина Е в миллиграммах в 25 см
раствора.
Построение градуировочного графика можно заменить расчетом коэффициента наклона
п
о 3.2.6.
3.2.8 Проверка градуировочных графиков
Градуировочные графики контролируют не реже 1 раза в неделю. Для этого 1-2 рабочих растворов витаминов А, Е следует хроматографировать по 3.2.6 и 3.2.7.
Отклонение полученных результатов (высота пика, выраженная в единицах оптической плотности или миллиметрах) от измеренных в момент построения градуировочного графика
, %, определяют по формуле
, (4)
где
и
- высота хроматографического пика, определенная при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно, е.о.п. или мм.
При отклонении более 5% строят новый градуировочный график по свежеприготовленным растворам масляного препарата витамина А, витамина Е-ацетат стандарта.
3.3 Порядок проведения контроля
3.3.1 Экстракция витаминов А, Е из премиксов
Из тщательно перемешанной пробы исследуемого премикса берут навеску с погрешностью не более 0,0005 г. Затем навеску премикса помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 25 см
или 50 см
и приливают раствор для экстракции в соответствии с таблицей 1.
Таблица 1
Содержание витамина А в премиксе, МЕ/г | Содержание витамина Е в премиксе, мкг/г | Масса навески премикса, г | Объем экстрагента, см |
40-100 | 50-100 | 10 | 20 |
100-2000 | 100-500 | 5 | 15 |
2000-6000 | 500-1000 | 2 | 10 |
Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане при температуре (75±1) °С в течение 10 мин. Колбу с экстрактом премикса отсоединяют от обратного холодильника, закрывают притертой пробкой, охлаждают под струей воды до комнатной температуры и фильтруют через фильтр ПОР-16 с размером пор 10-16 мкм с использованием водоструйного вакуумного насоса. Фильтрат собирают в мерную колбу вместимостью 25 см
. Коническую колбу и осадок на фильтре тщательно промывают два-три раза небольшими порциями (2-3 см
) изопропилового спирта. Раствор в мерной колбе доводят до метки изопропиловым спиртом, тщательно перемешивают и хроматографируют.
3.3.2 Хроматографирование
Полученные экстракты хроматографируют по 3.2.6 и 3.2.7. Примеры хроматограмм экстрактов витаминов А, Е из премиксов представлены в приложении А, рисунок А.1.
При возникновении сомнений в правильности выбора пика (по объему или времени удержания), соответствующего витамину А(Е), необходимо в анализируемый экстракт внести небольшое количество одного из градуировочных растворов витамина А(Е) (объемное соотношение экстракт - раствор витамина А(Е) равно 10:2 (10:5). Увеличение высоты соответствующего пика по сравнению с высотой этого пика на хроматограмме, полученной до введения градуировочного раствора в анализируемый экстракт, свидетельствует, что этот пик соответствует витамину А(Е).
3.4 Обработка результатов контроля
Для определения содержания витаминов А, Е в премиксе проводят две экстракции и каждый экстракт хроматографируют два раза. Находят среднеарифметическое значение высоты пиков, выраженное в единицах оптической плотности или миллиметрах, и по градуировочному графику определяют содержание витаминов А, Е в международных единицах и миллиграммах соответственно.
Содержание в премиксах витаминов А
, Е
, МЕ/г или мкг/г, определяют по формуле
, (5)
где
,
- содержание витаминов А, Е, найденное по градуировочным графикам, соответственно ME, мкг;
- масса навески премикса, г.
Содержание в премиксе витамина А
или витамина Е
, МЕ/г или мкг/г, при использовании коэффициента
вычисляют по формуле
, (6)
где
- коэффициент наклона градуировочного графика для витамина А, Е соответственно МЕ/е.о.п., мкг/е.о.п.;
,
- высота хроматографического пика витамина А, Е соответственно, е.о.п;
- масса навески премикса, г.
3.5 Оформление результатов контроля
3.5.1 Результаты контроля витаминов в премиксе записывают в специальном журнале для регистрации анализов.
3.5.2 Журнал ведется работником, на которого возложено проведение анализов по определению содержания витаминов в премиксах.
В журнале регистрируют все пробы с обязательным заполнением следующих данных:
- обозначения премикса и витамина, на который проводится анализ;
- наименования предприятия-поставщика премикса;
- массы партии;
- даты отбора пробы;
- фамилии и личной подписи лица, отобравшего пробу;
- результата контроля;
- фамилии и личной подписи лица, проводившего контроль.
При необходимости в журнал могут быть включены дополнительные сведения.
3.5.3 Записи должны вестись четко, аккуратно.
3.6 Допустимая погрешность контроля
Результат контроля вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат контроля принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности
=0,95 не должны быть более 10% для витамина А и 15% для витамина Е относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности
=0,95 расхождения не должны превышать 15% для витамина А и 20% для витамина Е соответственно.
4 Определение витаминов A, D, E нормально-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией
Сущность метода заключается в омылении навески премикса водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов A, D, Е гексаном с последующим определением витаминов на жидкостном хроматографе.
Метод применим в диапазоне концентраций витамина А от 10 до 10000 международных единиц на 1 г премикса (МЕ/г), витамина D от 40 до 10000 МЕ/г, витамина Е от 10 до 10000 МЕ/г.
4.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором и систематической погрешностью измерений не выше 10% отн.: Хром-900 (ЧСФР), Ликвохром (Венгрия), Цвет (РФ) и др. жидкостные хроматографы с аналогичными характеристиками.
Колонка для хроматографии стеклянная или металлическая высотой 150 мм и диаметром 3 мм, заполненная сепароном S6X зернением 7 мкм.
Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы от 186 до 1100 нм.
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Линейка измерительная металлическая.
Секундомер механический.
Испаритель ротационный ИР-1М на 2 дм
или его аналоги.
Баня водяная, обеспечивающая нагрев до 80-100 °С.
Холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336.
Колбы конические со шлифом вместимостью 250 см
Пипетки 1-1-1(2)-1 по ГОСТ 29169.
Пипетки 1-1-1(2)-1(5) по ГОСТ 29227.
Микрошприцы МШ-10М, МШ-50М по нормативному документу [5].
Колбы мерные 2-25-1(2); 2-50-1(2); 2-100-1(2) по ГОСТ 1770.
Воронки делительные вместимостью 200, 500 см
Цилиндры 1(2, 3, 4)-50; 1(2, 3, 4)-100; 1(2, 3, 4)-250; 1(2, 3, 4)-1000 по ГОСТ 1770.
Пробирки с притертой пробкой 2-5-0,1(0,2); 2-10-0,1(0,2) по ГОСТ 1770.
Воронки стеклянные диаметром 4-6 см по ГОСТ 25336.
Склянки с притертой пробкой.
Стеклянные палочки.
Марля медицинская по ГОСТ 9412.
Колонки стеклянные диаметром 2-4 см и высотой 80 см.
Калия гидроокись по ГОСТ 24363.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652 или ГОСТ 18300.
Спирт этиловый абсолютированный для спектрофотометрии или по нормативному документу [6].
Гексан по нормативному документу [7].
Спирт изопропиловый (пропанол-2) по нормативному документу [2].
Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166.
Ретинол ацетат (витамин А) по нормативному документу [11].
Эргокальциферол кристаллический (витамин D) по нормативному документу [13].
-токоферолацетат (витамин Е) по нормативному документу [12].
Алюминия окись для хроматографии, нейтральная по нормативному документу [8].
Гидрохинон по ГОСТ 19627.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Бумага универсальная индикаторная по нормативному документу [9].
Фильтры обеззоленные (красная лента) по нормативному документу [10].
Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
4.2 Порядок подготовки к проведению контроля
4.2.1 Определение массовой концентрации масляного раствора витамина А по 3.2.5.
4.2.2 Приготовление стандартного раствора витамина А
Для приготовления стандартного раствора взвешивают (лучше на часовом стекле) навеску масляного препарата, необходимую для приготовления раствора с активностью витамина 10000 МЕ/см
, переносят ее в мерную колбу вместимостью 25 см
и растворяют в изопропиловом спирте. Раствор перемешивают и доводят до метки спиртом. Хранят холодильнике в емкости с притертой пробкой и используют в течение недели.
4.2.3 Приготовление стандартного раствора витамина D
Ампулу кристаллического эргокальциферола, содержащую 0,1000 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см
, доводят содержимое колбы до метки изопропиловым спиртом и перемешивают. Полученный раствор (1) содержит 40000 МЕ/см
витамина D
. Из него берут 1 см
раствора, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см
, доводят до метки этим же спиртом и перемешивают. Полученный раствор (2) содержит 800 МЕ/см
витамина D
. Раствор хранят в плотно закрытой стеклянной посуде в холодильник
е.
4.2.4 Приготовление стандартного раствора витамина Е
Навеску масляного препарата
-токоферолацетата массой 0,0500 г переносят в мерную колбу вместимостью 25 см
, растворяют в изопропиловом спирте, доводят им до метки и тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в емкости с притертой пробкой в течение одной недели.
4.2.5 Подготовка растворителей
Очистку растворителей, применяемых в хроматографии, проводят посредством перегонки, отбрасывая первую и последнюю фракции в количестве 1/10 от первоначального объема, или пропусканием через колонку, заполненную активированной окисью алюминия.
Окись алюминия активируют при нагревании в течении 1 ч при температуре 400-450 °С. Колонку высотой 60-80 см и диаметром 2 см заполняют 80 г активированной окиси алюминия и пропускают через нее 700 см
растворителя. Для проверки чистоты в колонку жидкостного хроматографа загружают 50 мкдм
растворителя. В случае его загрязнения на хроматограмме появляются пики, соответствующие времени удерживания витаминов A, D, E.
4.2.6 Приготовление водно-спиртового раствора гидроокиси калия с массовой долей 10%
Растворяют 20 г гидроокиси калия в смеси из 20 см
воды и 180 см
этилового спирта. Раствор готовят непосредственно перед контролем.
4.3 Порядок проведения контроля
4.3.1 Омыление и подготовка к контролю стандартных растворов витаминов A, D, E
В конические колбы вместимостью 250 см
, снабженные обратным холодильником, помещают 1 см
раствора [2] витамина D по 4.2.3, 0,25 см
ретинолацетата и 0,2 см
-токоферолацетата. Добавляют 0,1 г гидрохинона и 30 см
10%-ного водно-спиртового раствора гидроокиси калия. Подвергают омылению в течение 30 мин на водяной бане при температуре 85 °С. Содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды, добавляют 30 см
дистиллированной воды и 30 см
гексана. Полученную смесь тщательно перемешивают и сливают в делительную воронку вместимостью 200 см
.
После расслаивания нижний слой (водно-спиртовый) сливают в коническую колбу, а гексановый слой оставляют в делительной воронке. Эту операцию экстракции гексаном водно-спиртового слоя в конической колбе проводят еще дважды, каждый раз сливая в делительную воронку гексановый слой.
Гексановые вытяжки объединяют и промывают в делительной воронке дистиллированной водой порциями по 30 см
до нейтральной реакции среды (проверяют по индикаторной бумаге). Промытый экстракт переносят в сухую перегонную колбу, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сульфата натрия (40-50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают свежими порциями гексана (20-30 см
).
Все гексановые растворы объединяют и помещают в колбу роторного испарителя. Температура водяной бани роторного испарителя 70 °С. После отгонки гексана сухой остаток растворяют в 3 см
гексана и переносят в мерную предварительно откалиброванную пробирку с притертой пробкой. Раствор может храниться в темном месте при температуре 4
-8 °С.
4.3.2 Омыление и подготовка к хроматографированию образцов премиксов
Навеску премикса массой 10 г взвешивают с погрешностью не более 0,0005 г, помещают в коническую колбу вместимостью 250 см
, снабженную обратным холодильником. Добавляют антиоксидант (0,1 г гидрохинона), 50 см
водно-спиртового раствора щелочи и подвергают омылению на водяной бане при температуре 82-85
По окончании омыления содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры, добавляют 50 см
дистиллированной воды и 50 см
гексана, смесь тщательно перемешивают и дают отстояться. После расслаивания смеси гексановый слой осторожно сливают в делительную воронку вместимостью 500 см
.
Экстракцию гексаном повторяют дважды порциями по 50 см
, последнюю фракцию переносят в делительную воронку, сливая содержимое колбы через воронку с марлевым слоем. Остаток на марле слегка отжимают стеклянной палочкой и выбрасывают. Воронку обмывают дистиллированной водой (около 50 см
) в делительную воронку, в которой собраны гексановые вытяжки. Содержимое воронки промывают дистиллированной водой порциями по 50 см
до нейтральной реакции среды (по индикаторной бумаге). Промытый экстракт переносят в сухую перегонную колбу, пропуская его через обеззоленный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия (около 50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают 40 см
гексана. Отгоняют гексан на ротационном испарителе при температуре бани 70 °С. Сухой остаток растворяют в 3 см
гексана, который добавляют порциями, чтобы перенести в предварительно откалиброванную пробирку с притертой пробкой.
Полученный экстракт используют для хроматографического анал
иза.
4.3.3 Подготовка жидкостного хроматографа к работе
Подготовка хроматографа осуществляется в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
Перед началом измерений хроматограф прогревают в течение 15 мин. Сначала проводят заполнение насоса элюентом. В качестве подвижной фазы используют смесь гексана с этанолом в объемном отношении 99,5:0,5. Устанавливают скорость элюирования, соответствующую эффективности колонки для конкретных премиксов от 0,5 до 2 см
/мин. При определении витаминов А, Е устанавливают светофильтр длиной волны 289 нм, для определения витамина D - светофильтр длиной волны 254 нм. Скорость движения диаграммной ленты регистратора устанавливают равной 0,3-0,6 см/мин.
После промывания колонки элюентом регистрирующий прибор должен показывать нулевую линию без дрейфа нуля. С целью повышения чувствительности и точности измерений для каждого хроматографа подбирают оптимальные условия хроматографирования.
4.3.4 Проведение хроматографических измерений
Для хроматографических измерений используют метод сравнения со стандартом. Сравнивают высоты хроматографических пиков для анализируемой пробы и пробы стандарта.
В колонку последовательно вводят от 3 до 20 мкдм
исследуемого раствора, стандартного раствора витамина А и стандартного раствора витамина Е. Получают соответствующие хроматограммы при длине волны фотометрического детектора 289 нм, приложение Б, рисунок Б.1. После этого меняют светофильтр, устанавливая рабочую длину волны 254 нм, и при этих условиях снимают хроматограммы для растворов анализируемой пробы и стандарта витамина D, приложение Б, рисунок Б.2.
Высоты пиков, соответствующие времени удерживания витаминов A, D, E, измеряют металлической линейкой, как расстояние от вершины пика до линии, проведенной в основании пика. Значения высот пиков (в миллиметрах) используют для вычисления содержания витаминов A, D, Е в анализируемом образце.
4.4 Обработка результатов контроля
Содержание витамина А
, МЕ/г, рассчитывают по формуле
, (7)
где
- содержание витамина А в стандартном растворе, ME;
- объем стандартного раствора витамина А, взятый на омыление, см
;
- объем мерной колбы с исходным стандартным раствором витамина А, см
;
,
- объемы загрузки в колонку растворов пробы и стандарта, полученные после омыления, мкдм
;
,
- объемы экстрактов пробы и стандарта после проведения подготовительных операций (омыление и т.д.), см
;
- высота пика витамина А на хроматограмме премикса, мм;
- высота пика на хроматограмме для стандарта витамина А, мм;
- масса навески премикса, г.
Содержание витамина D
, МЕ/г, рассчитывают по формуле
, (8)
где
- содержание витамина D
в стандартном препарате, ME;
- объем стандартного раствора витамина D
, взятый для последующего разбавления, см
;
- объем колбы со стандартным раствором витамина D
, см
;
- объем стандартного раствора витамина D
, взятый на омыление, см
;
- объем колбы со стандартным раствором витамина D
после первого разведения, см
;
,
- объемы загрузки в колонку омыленных растворов стандарта и пробы, мкдм
;
,
- окончательные объемы растворов пробы и стандарта, подготовленные для хроматографии, см
;
,
- соответствующие высоты пиков витамина D
на хроматограммах стандарта и премикса, мм;
- масса навески премикса, г.
Примечание - При обогащении премиксов витамином D
в числитель формулы следует вводить коэффициент 0,97 (отношение коэффициентов экстинций витамина D
к D
).
Содержание витамина Е
, мкг/г, рассчитывают по формуле
, (9)
где
- масса навески
-токоферола-стандарта, мкг;
- объем стандартного раствора витамина Е, взятый на омыление, см
;
- объем мерной колбы со стандартным раствором витамина Е, см
;
,
- объемы загрузки растворов пробы и стандарта в хроматографическую колонку, мкдм
;
,
- окончательные объемы растворов пробы и стандарта, подготовленные для хроматографии, см
;
,
- высоты пиков витамина Е на хроматограммах стандарта и премикса, мм;
- масса навески премикса, г.
Результат контроля вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение двух или более параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности
=0,95 не должны превышать 10% относительно среднеарифметического значения.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности
=0,95 не должно превышать 20% по отношению к среднеарифметическому значению результатов измерений.
ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)
Хроматограммы экстрактов витаминов А, Е
Рисунок А.1 - Хроматограммы экстрактов витаминов А, Е из премикса
ПРИЛОЖЕНИЕ Б
(справочное)
Хроматограммы экстрактов витаминов A, D, Е
Рисунок Б.1 - Хроматограммы экстрактов витаминов А, Е из премикса при длине волны 289 нм
Рисунок Б.2 - Хроматограммы экстрактов стандарта витамина D из премикса при длине волны 254 нм
ПРИЛОЖЕНИЕ В
(справочное)
Библиография
[1] ТУ 25-05.2830-83 Жидкостный хроматограф "Милихром"
[2] ТУ 6.09-402-87 2-пропанол (изопропиловый спирт химически чистый)
[3] ТУ 6-09-6628-70 Пропиловый спирт (пропанол-1)
[4] ТУ 6-09-06-1092-83 Ацетонитрил. Технические условия
[5] ТУ 2.833.104-85 Микрошприцы
[6] ТУ 84-11-99-89 Этиловый абсолютированный спирт
[7] ТУ 6-09-3375-78 Гексан
[8] ТУ 6-09-3916-85 Окись алюминия для хроматографии
[9] ТУ 6-09-1181-89 Бумага индикаторная универсальная для определения рН 1-10 и 7-14
[10] ТУ 6-09-1678-86 Фильтры обеззоленные (белая, красная, синяя ленты)
[11] ГФ СССР-X ст. 579 Раствор ретинола ацетата 3,44; 6,88 или 8,60% в масле
[12] ГФ СССР-X ст. 695 Токоферола ацетат (витамина Е ацетат)
[13] ГФ СССР-X ст. 627 Эргокальциферол кристаллический (витамин D
)
