ГОСТ Р 50928-96 Премиксы. Методы определения витаминов А, D, Е.

ГОСТ Р 50928-96

Группа С19

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 ПРЕМИКСЫ

 Методы определения витаминов A, D, Е

 Premixes.

Methods for determination of vitamins A, D, E

ОКС 65.120

ОКСТУ 9209, 9709

Дата введения 1997-01-01

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН МТК 4, АООТ "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (АООТ "ВНИИКП")

2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 июля 1996 года N 487

3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4 ПЕРЕИЗДАНИЕ

      1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на премиксы и устанавливает хроматографические методы определения витаминов A, D, Е в премиксах с различными наполнителями из одной навески.

      2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 4166-76 Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9412-93 Марля медицинская. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия

ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

_________________

* С 1 июля 2002 года вводится в действие ГОСТ 24104-2001.

ГОСТ 24363-80 Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26573.0-85 Премиксы. Технические условия

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

      3 Определение витаминов А, Е обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией

Сущность метода заключается в экстракции витаминов А (ретинола ацетат) Е (

-токоферола ацетата) из премикса изопропиловым спиртом и последующем анализе содержания витаминов с использованием жидкостного хроматографа "Милихром".

3.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Хроматограф жидкостный микроколоночный "Милихром" по нормативному документу [1] или его последующие модификации со спектрофотометрическим детектором и спектральным диапазоном 190-360 нм.

Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы 186-1100 нм.

Колонка хроматографическая одного из указанных размеров: 2x64, 2x80, 2x120 мм с числом теоретических тарелок не менее 4 тыс., заполненная одним из следующих сорбентов: Силасорб С 18, Силасорб РНС 18, Сепарон С 18.

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Насос водоструйный по ГОСТ 25336.

Баня водяная с терморегулятором.

Колбы конические со шлифом вместимостью 25, 50 см

, КН-2-25-18МХС по ГОСТ 25336.

Пипетки 1-1-(1, 2)-1 по ГОСТ 29169.

Пипетки 1-1-1(2)-1(10) по ГОСТ 29227.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-100, 1(2, 3, 4)-500 по ГОСТ 1770.

Колбы мерные 2-25-1(2) (исполнения 2, вместимостью 25 см

, 1-го или 2-го класса точности) по ГОСТ 1770.

Колбы мерные 2-50-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронка ВФО-40-ПОР 16 ХС по ГОСТ 25336.

Холодильник ХПТ-1-100-18 ХС по ГОСТ 25336.

Ретинол ацетат по нормативному документу [11].

Витамин Е-ацетат по нормативному документу [12].

Спирт изопропиловый (пропанол-2), х. ч. по нормативному документу [2].

Спирт пропиловый (пропанол-1), х. ч. по нормативному документу [3].

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, х. ч. по нормативному документу [4].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

3.2 Порядок подготовки к проведению контроля

3.2.1 Отбор проб - по ГОСТ 13496.0

3.2.2 Приготовление элюента для хроматографии

Трехкомпонентный элюент готовят смешиванием ацетонитрила, пропилового спирта и дистиллированной воды в объемном соотношении 42:50:8. Для этого в склянку вместимостью 1000 см

вносят цилиндром 500 см

пропилового спирта, 420 см

ацетонитрила и 80 см

дистиллированной воды.

Приготовленную смесь растворителей фильтруют через стеклянный фильтр и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой. Полученный раствор можно хранить в течение 1 мес.

3.2.3 Подготовка хроматографической колонки

При использовании новой колонки или колонки после длительного перерыва в работе из нее следует удалить воздух и тщательно промыть элюентом до получения стабильной нулевой линии. Для этого через колонку пропускают элюент в количестве 20-30 свободных объемов колонки, т.е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 50 мкдм

/мин, а затем 100 мкдм

/мин. Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.

После промывки колонки проводят ее насыщение витаминами А, Е, для этого выполняют 7-10 анализов наиболее концентрированных градуировочных растворов витаминов А, Е. Насыщение колонки прекращают, когда отношение разности между двумя последовательными определениями концентрации витамина А(Е) к среднему арифметическому значению этих операций не превышает 3%.

При правильной эксплуатации колонка выдерживает 500-600 анализов.

3.2.4 Приготовление растворителя для экстракции витаминов А, Е из премикса

Для экстракции витаминов используют двухкомпонентный экстрагент состава: изопропиловый спирт и дистиллированную воду в объемном соотношении 97:3. Для этого в мерную колбу вместимостью 1000 см

вносят пипеткой 30 см

дистиллированной воды и доводят до метки изопропиловым спиртом.

Хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой до полного использования экстрагента.

3.2.5 Определение активности витамина А в масляном препарате

(0,1

±0,002)

г препарата растворяют в абсолютном спирте в мерной колбе вместимостью 50 см

. Доводят этим же спиртом объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Отбирают 1-2 см

полученного раствора в колбу вместимостью 50 см

, заполняют ее до метки абсолютным спиртом и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной слоя 1 см. В качестве контрольного раствора применяют абсолютный спирт.

Массовую концентрацию витамина А,

, г/см

, определяют по формуле

,                                                 (1)

где

- оптическая плотность раствора;

,

- первое и второе разведения, см

;

- плотность препарата, г/см

;

- масса навески препарата, г;

- объем раствора, используемый для второго разведения, см

;

1550 - удельный показатель поглощения Е

при длине волны 326 нм для 100%-ного раствора витамина А в абсолютном спирте;

100 - коэффициент.

Содержание витамина А в 1 см

соответственно должно быть 0,0310-0,0378 г (90000-110000 ME), 0,0619-0,0757 г (180000-220000 ME), 0,0774-0,0946 г (225000-275000 ME).

Полученные результаты используют для расчета содержания витамина А в стандартном раст

воре.

3.2.6 Построение градуировочного графика для витамина А

Для приготовления стандартного раствора взвешивают навеску масляного препарата витамина А, необходимую для получения раствора с активностью 30000 ME в 50 см

или 600 МЕ/см

. Навеску помещают в мерную колбу вместимостью 50 см

, растворяют в изопропиловом спирте, перемешивают и доводят этим спиртом до метки.

Раствор хранят в холодильнике в емкости с притертой пробкой и используют в течение одной недели.

Из этого раствора готовят градуировочные (рабочие) растворы, содержащие 120, 300, 600, 1200, 3000, 6000, 12000 ME витамина А в 25 см

. Для этого берут соответственно 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0 см

основного раствора, помещают в мерные колбы вместимостью 25 см

и доводят до метки изопропиловым спиртом.

Срок годности растворов не более 1 мес при хранении в холодильнике в емкости с притертой пробкой при температуре 4-10 °С.

Полученные рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе "Милихром" при следующих условиях:

хроматографическая колонка 2x64 (2x80), (2x120) мм;

сорбент - Силасорб С

, Силасорб SPHC

, Сепарон С

;

трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;

объем пробы - 6 мкдм

;

длина волны - 328 нм;

постоянная времени - 0,2 с;

скорость подачи элюента - 150 мкдм

/мин.

Удерживаемый объем пика витамина А составляет 300-360 мкдм

(может меняться в зависимости от длины колонки).

Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 100-200 мкдм

элюента до выхода на нулевую линию.

Значения средних высот хроматографических пиков, выраженных в единицах оптической плотности (е.о.п.), откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс - значения активности витамина А в 25 см

раствора.

Градуировочный график строят также, откладывая по оси ординат средние высоты хроматографических пиков, выраженные в миллиметрах.

Построение градуировочных графиков можно заменить расчетом коэффициентов наклона

, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм, по формуле

,                                                                  (2)

где

- коэффициент наклона градуировочного графика для

-го градуировочного раствора, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм;

- количество точек, по которым строится градуировочная кривая.

Значение коэффициента наклона

, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм, вычисляют по формуле

,                                                           (3)

где

- содержание витамина А в соответствующем

-м градуировочном растворе, ME;

- высота

-го хроматографического пика, е.о.п. или мм.

3.2.7 Построение градуировочного графика для витамина Е

0,02 г витамина Е-ацетата стандарта растворяют в изопропиловом спирте в колбе вместимостью 50 см

, доводят спиртом до метки и перемешивают. Получают основной раствор витамина Е с концентрацией 0,4 мг/см

.

Из полученного основного раствора готовят рабочие растворы, содержащие 7, 5, 3, 1, 0,5, 0,1 и 0,05 мг витамина Е в 25 см

раствора. Для этого соответственно 17,5; 12,5; 7,5; 2,5; 2,25; 1,25; 0,25; 0,125 см

основного раствора помещают в мерные колбы вместимостью 25 см

и объем доводят до метки изопропиловым спиртом. Рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:

хроматографическая колонка 2x64 мм (2x80 мм), (2x120 мм);

сорбент - Силасорб C

, Силасорб SPHC

, Сепарон С

;

трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;

объем пробы - 6 мкдм

;

длина волны - 286 нм;

скорость подачи элюента - 100 мкдм

/мин;

постоянная времени - 0,2 с.

Удерживаемый объем пика витамина Е составляет 540-660 мкдм

(может меняться в зависимости от длины колонки).

Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 200-250 мкдм

элюента до выхода на нулевую линию.

Значение средних высот хроматографических пиков (в единицах оптической плотности или миллиметрах) откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс - значение активности витамина Е в миллиграммах в 25 см

раствора.