ГОСТ Р 54755-2011 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.

ГОСТ Р 54755-2011

Группа Н09

 НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

 Методы выявления и определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa

 Food products. Methods for detection and quantity determination of Pseudomonas aeruginosa bacteria

ОКС 07.100.30

ОКСТУ 9109

Дата введения 2013-01-01

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытания агропромышленной продукции на безопасность"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 944-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

      1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления бактерий вида Pseudomonas aeruginosa и методы определения их количества:

- метод наиболее вероятного числа (НВЧ);

- метод посева на агаризованные селективно-диагностические среды - подсчет колоний.

Метод определения НВЧ предусмотрен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта не более 1500 или в 1 см

жидкого продукта не более 150 клеток бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.

Метод определения количества посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта не менее 1500 или в 1 см

жидкого продукта не менее 150 КОЕ бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.

      2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 7218-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ Р ИСО 11133-1-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории

ГОСТ Р ИСО 11133-2-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 54004-2010 Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29228-91 (ИСО 835-2-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим, ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

      3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 бактерии вида Pseudomonas aeruginosa: Аэробные грамотрицательные бактерии, которые образуют типичные колонии на агаризованных селективно-диагностических средах за счет образования пигментов (пиоционина и флюоресцина), дают положительную реакцию на оксидазу, типичные по биохимическим признакам, если испытания проводятся в соответствии с методами, установленными в настоящем стандарте.

3.2 выявление бактерий вида Pseudomonas aeruginosa: Определение присутствия или отсутствия бактерий вида Pseudomonas aeruginosa в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом.

3.3 определение количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa:

3.3.1 Количество бактерий, содержащееся в 1 см

или 1 г продукта, определенное путем посева продукта и (или) его разведений на агаризованную селективно-диагностическую среду, подсчете после инкубирования при температуре 37 °С типичных колоний и подтверждении по отношению к окраске по Граму, присутствию оксидазы, образованию пигментов и по биохимическим признакам принадлежности бактерий из этих колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa. Подтверждение проводят по методам, приведенным в настоящем стандарте.

3.3.2 Количество бактерий, содержащееся в 1 см

или 1 г продукта, определенное по методу НВЧ, указанному в настоящем стандарте.

      4 Метод выявления и определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa по методу НВЧ

Сущность методов

Метод выявления и определения НВЧ бактерий вида Pseudomonas aeruginosa основан на высеве определенного количества продукта и (или) разведений пробы продукта в жидкую неселективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды для подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa.

      4.1 Метод выявления бактерий вида Pseudomonas aeruginosa

4.1.1 Предварительное обогащение в неселективной среде

В триптон-соевый бульон, приготовленный по 6.1, или сердечно-мозговой бульон, приготовленный по 6.2, высевают анализируемую пробу, затем посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.

4.1.2 Выделение типичных колоний

На поверхность агаризованной селективно-диагностической среды высевают культуру, полученную по 4.1.1, посевы инкубируют при температуре (37±1) °С.

Посевы просматривают через (24±2) ч для определения присутствия колоний, типичных для бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.

4.1.3 Подтверждение принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa

Типичные колонии, полученные по 4.1.2, пересевают на поверхность питательного агара для дальнейшего подтверждения принадлежности выделенных культур к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa.

4.1.4 Схема выявления бактерий вида Pseudomonas aeruginosa приведена в приложении А.

      4.2 Определение количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa

4.2.1 Предварительное обогащение в неселективной среде

В каждую из трех колб с 90 см

одной из неселективных сред по 4.1.1 вносят по 10 см

продукта, если продукт жидкий, или вносят по 10 см

исходного разведения продукта, приготовленного по ГОСТ 26669, в случае, если анализируемый продукт другой консистенции.

В каждую из трех пробирок с 9 см

одной из неселективных сред по 4.1.1 вносят по 1 см

продукта, если исходный продукт жидкий, или вносят по 1 см

исходного разведения (указанного выше) продукта в случае, если анализируемый продукт другой консистенции.

В каждую из трех пробирок с 9 см

одной из неселективных сред по 4.1.1 вносят по 1 см

первого десятикратного разведения продукта, если исходный продукт жидкий, или вносят по 1 см

первого десятикратного исходного разведения продукта в случае, если анализируемый продукт другой консистенции.

Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.

Выбор объема пробы для анализа или ее разведения зависит от предполагаемой обсемененности продукта или от нормативных значений.

4.2.2 Выделение типичных колоний, подтверждение принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa

Выделение типичных колоний, подтверждение принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa проводят по 4.1.2 и 4.1.3.

4.2.3 Схема определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa по методу НВЧ приведена в приложении А.

4.2.4 Наиболее вероятное число бактерий вида Pseudomonas aeruginosa в 1 см

или 1 г пробы продукта (НВЧ) рассчитывают исходя из числа посевов, в которых подтверждено присутствие этих бактерий. Определение наиболее вероятного числа бактерий вида Pseudomonas aeruginosa проводят в соответствии с приложением Б (таблица Б.1).

      5 Метод определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa посевом на агаризованные селективно-диагностические среды - подсчет колоний

Сущность метода

Метод определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa посевом на агаризованные селективно-диагностические среды основан на высеве определенного количества продукта и/или его разведений на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, инкубировании посевов, подсчете типичных колоний, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa.

Разновидностью метода посева на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды является посев методом мембранной фильтрации.

      5.1 Метод посева на агаризованные селективно-диагностические среды

5.1.1 На подсушенную поверхность агаризованной селективно-диагностической среды двух чашек Петри наносят 0,1-0,2 см

продукта, если продукт жидкий, или исходной суспензии в случае, если анализируемый продукт другой консистенции.

Две другие чашки Петри используют для исходной суспензии и/или десятикратных разведений продукта.

Внесенный в чашки Петри продукт или его исходные разведения распределяют по поверхности селективно-диагностической агаризованной питательной среды стерильным шпателем.

Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.

5.1.2 После инкубирования посевов отбирают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 типичных колоний. Подсчитывают на отобранных чашках Петри количество выросших типичных колоний.

При посеве методом мембранной фильтрации на них подсчитывают колонии даже в том случае, если их менее 15.

Выбирают по пять типичных колоний каждого типа для пересева на поверхность питательного агара для дальнейшего подтверждения принадлежности выросших культур к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa. Если число выросших колоний менее 5, то отбирают все выросшие колонии.

5.1.3 Число колоний на 1 см

или на 1 г продукта рассчитывают по ГОСТ 26670, исходя из числа подтвержденных типичных колоний, выросших на чашках Петри.

      6 Питательные среды и реактивы

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред и реактивов, должны быть аналитического качества, а вода дистиллированной.

6.1 Среда для неселективного обогащения: Триптон-соевый бульон

6.1.1 Состав

Гидролизат казеина, г	17,0
Папаиновый перевар соевой муки, г	3,0
Натрий хлористый, г	5,0
Калия гидрофосфат, г	2,5
Глюкоза, г	2,5
Вода, см	1000

6.1.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Нагревают среду на слабом огне до кипения, кипятят до полного растворения компонентов. Устанавливают рН так, чтобы он составлял (7,3±0,2) ед. рН при температуре 25 °С. Разливают среду по колбам или пробиркам и стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при температуре (121±1) °С.

6.2 Среда для неселективного обогащения: Сердечно-мозговой бульон

6.2.1 Состав

Настой мозга теленка, г	200,0
Настой мясной (из говядины), г	250,0
Протеозопептон, г	10,0
Натрий хлористый, г	5,0
Натрия гидрофосфат, г	2,5
Глюкоза, г	2,0
Вода, см	550

6.2.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Нагревают среду на слабом огне до полного растворения компонентов. Устанавливают рН так, чтобы он составлял (7,3±0,2) ед. рН при температуре 25 °С. Разливают среду по колбам или пробиркам и стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при температуре (121±1) °С.

6.3 Основа агара с цетримидом

6.3.1 Состав

Перевар панкреатический желатина, г	20,0
Магния хлорид, г	1,4
Калия сульфат, г	10,0
Цетримид*, г	0,3
Агар, г	15,0
Вода, см	1000
_______________ * Цетримид - четвертичное аммониевое соединение, обладающее антимикробной активностью.

6.3.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде, содержащей 10 см

глицерина. Нагревают среду на слабом огне до полного растворения компонентов, охлаждают до температуры (45-55) °С. Устанавливают рН так, чтобы он составлял (7,2±0,2) ед. рН при температуре 25 °С, после чего среду стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при температуре (121±1) °С.

6.4 Агар для выделения псевдомонад

6.4.1 Состав

Перевар панкреатический желатина, г	20,0
Магния хлорид, г	1,4
Калия сульфат, г	10,0
Иргасан (триклозан)*, г	0,025
Агар, г	13,6
Вода, см	1000
_______________ * Триклозан - хлорсодержащее средство производное фенола.

6.4.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде, содержащей 10 см

глицерина. Нагревают среду на слабом огне до полного растворения компонентов, охлаждают до температуры (45-55) °С. Устанавливают рН так, чтобы он составлял (7,2±0,2) ед. рН при температуре 25 °С, после чего среду стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при температуре (121±1) °С.