ГОСТ Р 52831-2007 Молоко и сухое молоко. Определение содержания афлатоксина М(1). Очистка с помощью иммуноаффинной хроматографии и определение с помощью тонкослойной хроматографии.

     ГОСТ Р 52831-2007

(ИСО 14674:2005)

Группа Н09

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО И СУХОЕ МОЛОКО

Определение содержания афлатоксина M

Очистка с помощью иммуноаффинной хроматографии

и определение с помощью тонкослойной хроматографии

Milk and milk powder. Determination of aflatoxin M

content.

Clean-up by immunoaffinity chromatography

and determination by thin-layer chromatography

ОКС 67.100.01

ОКСТУ 9109

Дата введения 2009-01-01

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") на основе русской версии стандарта, указанного в пункте 4, который выполнен ФГУП "СТАНДАРТИНФОРМ"

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 декабря 2007 г. N 458-ст

4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 14674:2005 "Молоко и сухое молоко. Определение содержания афлатоксина M

. Очистка с помощью иммуноаффинной хроматографии и определение с помощью тонкослойной хроматографии" (ISO 14674:2005 "Milk and milk powder - Determination of aflatoxin M

content - Clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by thin-layer chromatography"). При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены курсивом.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам Российский Федерации, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок, указанные в дополнительном приложении В

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

      1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на молоко и сухое молоко и устанавливает метод определения содержания афлатоксина М

с помощью тонкослойной хроматографии с предварительной очисткой с использованием иммуноаффинной хроматографии.

Минимально определяемое количество афлатоксина М

составляет 2 нг, что соответствует около 0,10 мкг/дм

для молока или разбавленного сухого молока.

      2 Нормативные ссылки*   

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ Р 52501-2005 Вода для лабораторного анализа. Технические условия

ГОСТ Р 52738-2007 Молоко и продукты переработки молока. Термины и определения

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия

ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 22300-76 Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При использовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

      3 Термины и определения

В настоящем стандарте применяют термины по ГОСТ Р 52738, а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1

содержание афлатоксина М

:

Массовая концентрация

афлатоксина М

,

выраженная в мкг/дм

, - для молока или массовая доля афлатоксина М

,

выраженная в мкг/кг, - для сухого молока

, определенная методом, установленным в настоящем стандарте.

3.2 аналитический выход (recovery): Отношение массы, массовой доли или массовой концентрации определяемого компонента, найденное данным методом, к действительному значению соответствующей величины в исходном образце.

      4 Сущность метода *  

Афлатоксин М

экстрагируют, пропуская пробу через иммуноаффинную колонку, содержащую специфические антитела, связанные с твердым материалом субстрата. Когда проба проходит через колонку, антитела селективно связываются с любым присутствующим афлатоксином М

(антигеном) и образуют комплекс антитело-антиген

. Все другие компоненты основного состава пробы вымываются из колонки водой. Затем афлатоксин М

элюируют из колонки смесью ацетонитрил/метанол. В соответствии с концентрацией элюата количество афлатоксина М

определяют методом однонаправленной тонкослойной хроматографии. В случае возникновения помех проводят двунаправленную тонкослойную хроматографию, чтобы отделить афлатоксин М

от примесей.

      5 Реактивы

При отсутствии специальных указаний используют реактивы только признанных аналитических марок.

Вода должна соответствовать требованиям квалификации не ниже 3-й степени чистоты согласно ГОСТ Р 52501. Вода не должна содержать органические примеси.

5.1 Чистые растворители

5.1.1 Хлороформ по ГОСТ 20015.

5.1.2 Ацетонитрил [1].

5.1.3 Диэтиловый эфир по ГОСТ 22300.

5.1.4 Метанол по ГОСТ 6995.

5.1.5 Толуол по ГОСТ 5789.

5.1.6 Ацетон по ГОСТ 2603.

5.1.7 Изопропанол [2].

5.2 Смесь ацетонитрил/метанол, в объемном соотношении 3:2

Смесь приготовляют, добавляя 30 см

ацетонитрила

(см. 5.1.2) к 20 см

метанола (см. 5.1.4), и перемешивают.

5.3 Смесь толуол/ацетонитрил, в объемном соотношении 9:1

Смесь приготовляют, добавляя 9 см

толуола

(см. 5.1.5) к 1 см

ацетонитрила (см. 5.1.2), и перемешивают. Этот раствор используют для повторного суспендирования

стандартных

растворов афлатоксина М

(см. 5.5) и выпаренного элюата перед

проведением анализа методом тонкослойной хроматографии.

5.4 Растворители для проведения тонкослойной хроматографии

5.4.1 Раствор для однонаправленной тонкослойной хроматографии

Приготовляют 100 см

раствора для однонаправленной

тонкослойной хроматографии

путем добавления 4 см

метанола (см. 5.1.4) и 1 см

воды к 95 см

диэтилового эфира (см. 5.1.3) и тщательно перемешивают (объемное отношение 95:4:1).

5.4.2 Раствор для двунаправленной тонкослойной хроматографии

Приготовляют 100 см

раствора для двунаправленной тонкослойной хроматографии путем добавления 10 см

ацетона (см. 5.1.6) и 3 см

изопропанола (см. 5.1.7) к 87 см

хлороформа (см. 5.1.1) и тщательно перемешивают (объемное отношение 87:10:3).

5.5

Стандартный

раствор афлатоксина М

5.5.1

Основной стандартный

раствор афлатоксина М

Приготовляют

основной стандартный

раствор афлатоксина М

с номинальной концентрацией афлатоксина М

10 мкг/см

(см. 5.1.1) путем повторного суспендирования 10 мкг лиофилизированной пленки афлатоксина М

в 1 см

хлороформа.

Согласно протоколу АОАС [3] концентрацию основного стандартного раствора афлатоксина М

определяют путем измерения его

оптической плотности при длине волны максимального поглощения в диапазоне длин волн 200-400 нм относительно хлороформа (см. 5.1.1), применяемого в качестве образца сравнения.

Контролируют чистоту афлатоксина М

, регистрируя спектр в интервале 200-400 нм. Измеряют

оптическую плотность

(

) при длине волны максимума поглощения (

), близкой к 365 нм.

Вычисляют массовую концентрацию

, мкг/см

, по формуле

,                                                           (1)

где

- числовое значение

оптической плотности

, измеренной при

;

- числовое значение молярной массы афлатоксина М

, г/моль (

=328 г/моль);

- числовое значение

молярного

коэффициента поглощения афлатоксина М

в хлороформе, м

/моль (

=1995 м

/моль).

Основной стандартный

раствор афлатоксина М

хранят

в хорошо закупоренном пузырьке

из темного стекла

, защищенном от света при температуре ниже 0

°

С.

Срок хранения основного стандартного раствора афлатоксина М

- один год

.

5.5.2

Рабочий стандартный

раствор афлатоксина М

5.5.2.1 Рабочий раствор А

Используют мерную пипетку или микрошприц типа Гамильтон* (см. 6.2) для помещения 50 мм

рабочего стандартного раствора афлатоксина М

(см. 5.5.1) в пузырек.

Раствор упаривают досуха

. Повторно суспендируют

сухой остаток

с 500 мм

смеси

толуол/ацетонитрил (см. 5.3), чтобы получить

рабочий стандартный

раствор афлатоксина М

с концентрацией 1 мкг/см

(рабочий раствор А). Раствор А используют для нанесения его на пластинки

для

тонкослойной хроматографии при исследовании проб

с высоким уровнем загрязнения или когда

массовая концентрация афлатоксина М

близка к

0,50 мкг/дм

.

_________________

* Шприцы типа Гамильтон являются примером коммерчески доступной продукции. Данная информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой этой продукции.

5.5.2.2 Рабочий раствор В

Помещают 100 мм

раствора А в пузырек. Добавляют 900 мм

смеси толуол/ацетонитрил (см. 5.3), чтобы получить рабочий стандартный раствор афлатоксина М

с концентрацией 0,1 мкг/см

(рабочий раствор В). Раствор В используют для нанесения его на пластинки тонкослойной хроматографии при исследовании проб с низким уровнем загрязнения или когда

массовая концентрация афлатоксина М

близка

к 0,10 мкг/ дм

.

      6 Средства измерений и оборудование *  

Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности:

6.1 Мерные пипетки требуемой вместимости по ГОСТ 29227.

6.2 Микрошприцы типа Гамильтон*.

_________________

* Шприцы типа Гамильтон являются примером коммерчески доступной продукции. Данная информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой этой продукции.

6.3 Лабораторную стеклянную посуду: стеклянные колбы и воронки соответствующей вместимости по ГОСТ 25336.

6.4 Колбу мерную с одной меткой

вместимостью

200 см

по

ГОСТ 1770.

6.5 Цилиндр

мерный

вместимостью

100 см

по ГОСТ 1770.

6.6 Одноразовые шприцы

вместимостью

10 и 100 см

.

6.7 Стеклянную

пробирку с коническим дном вместимостью

5 см

для сбора экстракта после этапа очистки

по

ГОСТ 1770.

6.8 Испарительную систему, испаритель роторный или оборудование, позволяющее получать слабый поток азота.

6.9 Спектрометр с диапазоном измерения, позволяющим проводить исследования при длинах волн от 200 до 400 нм, снабженный кварцевыми кюветами с длиной оптического пути 10 мм.

6.10 Термостат водяной, поддерживающий температуру от 35 °С до 37 °С.

6.11 Центрифугу, обеспечивающую радиальное ускорение не менее 2000 g и охлаждение до 4 °С.

6.12 Бумага фильтровальная (ватман N 4* или аналогичная) по ГОСТ 12026.

_________________

* Ватман N 4 является примером коммерчески доступной продукции. Данная информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой этой продукции.

6.13 Иммуноаффинные колонки

Иммуноаффинные колонки должны содержать антитела относительно афлатоксина М

. Максимальная емкость колонок должна быть не менее 100 нг афлатоксина М

(что соответствует 1 мкг/дм

или 10 мкг/кг, когда используют 100 см

пробы для анализа). Они должны давать

выход афлатоксина М

не менее 80% для массы

4 нг токсина (что соответствует 0,04 мкг/ дм

или 0,40 мкг/кг на 100 см

пробы для анализа). Допускается использовать любую иммуноаффинную колонку, удовлетворяющую

вышеуказанным

рабочим характеристикам.

6.14 Весы лабораторные с точностью взвешивания до 0,1 г по ГОСТ 24104.

6.15 Магнитная мешалка.

6.16 Мешалка вихревого типа.

6.17 Вакуумная система для иммуноаффинного картриджа.

6.18 Шкаф сушильный (термостат), обеспечивающий поддержание температуры 50 °С.

6.19 Камера для тонкослойной хроматографии.

6.20 Пластинки для тонкослойной хроматографии, размером 10

10 см или 20

20 см, с силикагелем 60, сделанные из стекла или алюминия.

6.21 Ультрафиолетовая лампа, излучающая при длине волны 365 нм.

6.22 Денситометр.

      7 Отбор проб*  

7.1 Отбор проб - по ГОСТ 26809 и ИСО 707 [4].

В лабораторию направляют представительные пробы, которые не были повреждены в процессе хранения и транспортирования.

      8 Подготовка проб*    

      8.1 Молоко

Пробу нагревают в термостате (см. 6.10) до (35±2) °С, чтобы растворить слой жира для получения хорошей гомогенизации пробы для анализа при умеренном перемешивании.

Гомогенизированную пробу для анализа центрифугируют (см. 6.11) при радиальном ускорении 2000 g не менее 15 мин. Пробу охлаждают для лучшего отделения жира и верхний тонкий слой жира удаляют.

При необходимости

проводят фильтрование через один или более листов фильтровальной бумаги (см. 6.12). Собирают

не менее

100 см

приготовленной таким образом пробы для анализа.

      8.2 Сухое молоко

20,0 г навески пробы с точностью до 0,1 г помещают в мерную колбу вместимостью 250 см

и растворяют со 150 см

воды, предварительно нагретой при

температуре от

50

°

С

до

60

°

С. Полученный раствор перемешивают магнитной мешалкой (см. 6.15) в течение 10 мин.

Испытуемый раствор оставляют охлаждаться до комнатной температуры

. Затем осторожно

переносят

весь раствор в мерную колбу вместимостью 200 см

(см. 6.4). Разбавляют до метки водой. Закрывают колбу и встряхивают ее содержимое для получения хорошо гомогенизированного раствора.

Центрифугируют (см. 6.11)

испытуемый

раствор при радиальном ускорении 2000 g

не менее

15 мин. Раствор охлаждают для лучшего отделения жира и удаляют верхний тонкий слой жира.

При необходимости

проводят фильтрование через один или более листов фильтровальной бумаги (см. 6.12). Собирают

не менее

100 см

приготовленной пробы для испытания.

      8.3 Иммуноаффинная очистка

Иммуноаффинной колонке (см. 6.13) дают достигнуть комнатной температуры. Присоединяют шприц к верхней части иммуноаффинного картриджа. Отбирают 100 см

приготовленного испытуемого раствора (см. 8.1 или 8.2), используя

мерный цилиндр вместимостью

100 см

(см. 6.5) или пипетку.

Переводят анализируемую пробу в шприц и пропускают через иммуноаффинную колонку с

постоянной медленной скоростью потока

около 2-3 см

/мин. Используют гравитационную или вакуумную систему (см. 6.17) для контроля скорости потока. Не следует допускать

высыхания

колонки. Промывают колонку, используя 40 см

воды при постоянной медленной скорости потока. После промывки колонку продувают

досуха

, промывочный раствор выбрасывают.

Устанавливают другой сухой чистый шприц на картридж. Медленно элюируют афлатоксин М

из колонки, пропуская 2,5 см

смеси

ацетонитрил/метанол (см. 5.2) и затем 2,5 см

чистого метанола (5.1.4). Дают этим растворам контактировать с колонкой не менее 1 мин при соблюдении постоянной медленной скорости потока. Затем продувают колонку

досуха

.

Собирают элюат в

пробирку с коническим дном

и выпаривают

до

минимального объема

(1-2 капли)

, используя роторный испаритель (см. 6.8) при температуре

40

°

С или используя слабый поток азота. Не следует испарять элюат до полной сухости, это позволит достичь хорошего повторного суспендирования афлатоксина М

, присутствующего в остатке пробы.

Добавляют 200 мм

чистого ацетонитрила (см. 5.1.2) к остатку пробы. Закрывают

пробирку

и интенсивно перемешивают, используя мешалку вихревого типа (см. 6.16), в течение 1 мин. Испаряют снова до

минимального объема (1-2 капли),

используя роторный испаритель (см. 6.8) при температуре

40

°

С или слабый поток азота.

Примечание - Предыдущий этап необходим, чтобы избежать образования эмульсии и получить хорошее повторное суспендирование при добавлении смеси толуол/ацетонитрил.

Открывают пробирку и добавляют 100 мм

смеси

толуол/ацетонитрил (см. 5.3) к остатку пробы. Закрывают пробирку и снова интенсивно перемешивают, используя мешалку вихревого типа (см. 5.16), в течение 1 мин. Очищенную таким образом пробу для анализа хранят до начала процедуры.

      9 Проведение определения *  

      9.1 Однонаправленная тонкослойная хроматография

На пластинку тонкослойной хроматографии

(см. 6.20)

наносят

10-20 мм

очищенной пробы по 8.3. Добавляют аликвоты, например, по 5, 10, 20 мм

соответствующего

рабочего стандартного

раствора афлатоксина М

, приготовленного по 5.5.2 (раствор А или В).

Пластинку помещают в камеру для тонкослойной хроматографии (см. 6.19), содержащую раствор для однонаправленной тонкослойной хроматографии (см. 5.4.1). Хроматографию проводят до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет высоты примерно 10 см.

Удаляют пластинку из

камеры

и оставляют ее сохнуть на воздухе. Считывают полученные пятна, используя ультрафиолетовую лампу (см. 6.21) или денситометр (см. 6.22) при 365 нм. Сравнивают интенсивность флуоресценции пятна на

хроматограмме пробы

с интенсивностями, полученными для

рабочих стандартных

растворов афлатоксина М

.

Вычисляют содержание афлатоксина М

в анализируемой пробе, как описано в разделе 10.

Если

интенсивность флуоресценции

пятна на

хроматограмме пробы

выше по сравнению с рабочим стандартным раствором афлатоксина М

самой высокой

интенсивности флуоресценции, то

оценивают уровень загрязнений. Исходя из этого уровня, разбавляют очищенную пробу для анализа (см. 8.3) подходящим объемом

смеси

толуол/ацетонитрил (см. 5.3).

Повторяют процедуру с разбавленной очищенной пробой, описанную в настоящем подразделе.

      9.2 Двунаправленная тонкослойная хроматография

При появлении на хроматограмме помех вблизи флуоресцирующих пятен

проводят двунаправленную тонкослойную хроматографию.

Наносят

на пластинку

для тонкослойной хроматографии

(см. 6.20) 20 мм

очищенной пробы для анализа (см. 8.3). Добавляют по 5, 10, 20 мм

рабочего стандартного

раствора афлатоксина М

, приготовленного, как описано в 5.5.2, чтобы пропустить его в направлении 1, и по 5, 10, 20 мм

того же самого

рабочего стандартного

раствора афлатоксина М

(см. 5.5.2), чтобы пропустить его в направлении 2 (см. рисунок 1).

ось х - направление 2; ось у - направление 1

Рисунок 1 - Двунаправленная тонкослойная хроматография

Помещают пластинку в камеру тонкослойной хроматографии (см. 6.19), содержащую раствор для однонаправленной тонкослойной хроматографии (см. 5.4.1). Хроматографируют (элюируют) пластинку в первом направлении до тех пор, пока фронт подвижной фазы не достигнет высоты примерно 7 см. Удаляют пластинку из камеры и оставляют ее сохнуть на воздухе.

Нагревают сухую пластину в сушильном шкафу (термостате) (см. 6.18) при температуре 50 °С в течение 5 мин. Охлаждают пластинку и помещают ее в другую камеру для тонкослойной хроматографии для элюирования в направлении 2. Хроматографируют (элюируют) пластинку во втором направлении до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет высоты около 7 см.

Удаляют пластинку из

камеры

и оставляют ее сохнуть на воздухе. Считывают полученные пятна, используя ультрафиолетовую лампу (см. 6.21) или денситометр (см. 6.22) при 365 нм. Сравнивают интенсивность флуоресценции пятна на испытательном образце с интенсивностями, полученными для

рабочих стандартных

растворов афлатоксина M

.

Вычисляют содержание афлатоксина М

в анализируемой пробе, как описано в разделе 10.

Если интенсивность флуоресценции пятна на

хроматограмме пробы

выше по сравнению с

рабочим стандартным

раствором афлатоксина М

самой высокой

интенсивности флуоресценции

,

то

повторяют процедуру с очищенной пробой меньшего объема (см. 8.3), как описано в настоящем подразделе.

После анализа методом тонкослойной хроматографии оставшуюся очищенную пробу для анализа хранят в закрытом пузырьке или морозильной камере для дальнейшего количественного анализа или подтверждения идентичности.

      10 Обработка результатов*   

      10.1 Вычисление

Вычисляют массовую концентрацию или массовую долю афлатоксина М

в пробе (см. 8.1 или 8.2), мкг/дм

или мкг/кг, используя следующее уравнение:     

,                                                        (2)

где

- численное значение объема рабочего стандартного раствора А или В (см. 5.5.2), сравнимое с объемом анализируемой пробы (см. 9.1 или 9.2) и используемое в вычислении, мм

;

- массовая концентрация афлатоксина М

используемого рабочего стандартного раствора А или В (см. 5.5.2), сравнимая с объемом анализируемой пробы (см. 9.1 или 9.2) и используемая в вычислении, нг/мм

;     

- объем растворенного остатка, мм

(

=100 мм

);

- объем (см. 9.1 или 9.2) очищенной анализируемой пробы, сопоставимый с объемом рабочего стандартного раствора А или В (см. 5.5.2) и используемый в вычислении, мм

;

       

- объем (см. 8.1) или масса (см. 8.2) пробы, см

или г.

     10.2 Оценка результатов*  

За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений, округленное до двух значащих цифр.

      11 Прецизионность

      11.1 Межлабораторные испытания

Подробная информация о межлабораторных испытаниях

для определения прецизионности метода приведена в приложении А.

Применение результатов межлабораторных испытаний возможно только для указанных в таблице А. 1 уровней загрязнения афлатоксином М

проб молока, сырого и сухого молока.

      11.2 Пределы повторяемости и воспроизводимости*  

Значения пределов повторяемости (абсолютной разности между двумя независимыми результатами единичных испытаний, полученных одним и тем же оператором при использовании одного и того же оборудования в пределах короткого интервала времени) и воспроизводимости (абсолютной разности между двумя результатами испытаний, полученных одним и тем же методом на идентичном испытуемом материале в разных лабораториях) для доверительной вероятности 0,95 приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Значения пределов повторяемости и воспроизводимости (в мкг/дм

для жидких проб и мкг/кг для твердых проб)

Уровни загрязнений, для которых приведены пределы повторяемости и воспроизводимости	Предел повторяемости r		Предел воспроизводимости R
	А	В	А	В
Жидкие пробы
Низкий (L1)	0,17	0,10	0,18	0,14
Высокий (L2)	0,63	0,96	0,84	0,96
Твердые пробы (сухое молоко)
Низкий (Р1)	0,73	1,04	1,01	1,25
Высокий (Р2)	3,04	5,79	5,06	8,63
Примечание - А - нескорректированные данные; В - данные, скорректированные с учетом выхода афлатоксина М ; условные обозначения уровней загрязнения - по приложению А.

      12 Протокол испытания

В протоколе испытания должны быть указаны:

a) вся информация, необходимая для полной идентификации пробы;

b) метод отбора проб (если известен);

c) используемый метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

d) все рабочие подробности, не установленные в этом стандарте или рассматриваемые как факультативные, с особенностями, которые могли повлиять на окончательный(е) результат(ы) испытания;

e) полученные результаты или, в случае проверки повторяемости, конечный объявленный результат.

Приложение А

(справочное)

Результаты межлабораторных испытаний

В международных испытаниях проб жидкого молока участвовало девять лабораторий, проб сухого молока - одиннадцать лабораторий, испытания проводились на параллельных пробах. Пробы жидкого молока для анализа имели два уровня загрязнения: 0,13 мкг/дм

(L1) и 0,68 мкг/дм

(L2). Пробы сухого молока для анализа имели также два уровня загрязнения: 1,17 мкг/кг (Р1) и 5,49 мкг/кг (Р2). Статистический анализ проводился по нескорректированным результатам и по результатам, которые были скорректированы для

аналитического выхода

.

Испытания были организованы AFSSA-LERHQA (Франция). Содержание афлатоксина М

в

пробах загрязненного молока, разосланных участникам

, определяли с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, описанного в ИСО 14501 [5].

Для нахождения данных по прецизионности, приведенных в таблице А.1, полученные результаты подвергали статистическому анализу согласно ГОСТ Р ИСО 5725-1 и ГОСТ Р ИСО 5725-2.

Таблица А.1 - Результаты межлабораторных испытаний

Наименование показателя	Партии
	L1		L2		Р1		Р2
	А	В	А	В	А	В	А	В
Ожидаемые значения, мкг/дм или мкг/кг	0,13	0,13	0,68	0,68	1,17	1,17	5,49	5,49
Число участвующих лабораторий	9	8	11	11	9	10	11	10
Общее среднее значение, мкг/дм или мкг/кг	0,13	0,14	0,46	0,63	0,65	0,93	3,36	5,74
Стандартное отклонение для   повторяемости , мкг/дм или мкг/кг	0,06	0,04	0,22	0,34	0,26	0,37	1,08	2,04
Относительное стандартное   отклонение для повторяемости, %	45,10	25,90	48,70	54,10	40,10	39,30	32,00	35,60
Предел повторяемости при 95% , мкг/дм или мкг/кг	0,17	0,10	0,63	0,96	0,73	1,04	3,04	5,79
Стандартное отклонение для воспроизводимости , мкг/дм или мкг/кг	0,06	0,05	0,25	0,30	0,36	0,44	1,79	3,05
Относительное стандартное   отклонение для воспроизводимости, %	49,00	33,70	55,10	46,90	55,40	47,50	53,30	53,10
Предел воспроизводимости при 95% , мкг/дм или мкг/кг	0,18	0,14	0,72	0,84	1,01	1,25	5,06	8,63
А - нескорректированные данные.   В - данные, скорректированные для выхода афлатоксина М .   По тесту Кохрана из дальнейшей обработки были исключены результаты семи лабораторий для партии Р1 .   По тесту Кохрана из дальнейшей обработки были исключены результаты четырех лабораторий партии Р1. Несмотря на то, что по тесту Кохрана следовало исключить данные из шести лабораторий для партии Р2, их результаты были использованы в дальнейшей обработке .   Примечание - L - жидкие пробы, Р - порошковые пробы.

Приложение В

(справочное)

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов

национальным стандартам Российской Федерации,

использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок

Таблица В.1

Библиография

[1]	ТУ 6-09-3534-74	Ацетонитрил
[2]	ТУ 6-09-402-87	Спирт изопропиловый
[3]	АОАС 1995 49.3.02 (980.21 Method)
[4]	ИСО 707:1997	Молоко и молочные продукты. Руководящие указания по отбору проб
[5]	ИСО 14501:2007	Молоко и сухое молоко. Определение содержания афлатоксина М . Очистка с помощью иммуноаффинной хроматографии и определение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии