Методические указания по методам контроля МУК 4.1.3135-13 Определение остаточных количеств флоникамида в воде, почве, яблоках и яблочном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

МУК 4.1.3135-13

Группа О60

Методические указания

 4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 Определение остаточных количеств флоникамида в воде, почве, яблоках и яблочном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

1. РАЗРАБОТАНЫ сотрудниками ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии (В.И.Долженко, И.А.Цибульская, А.С.Комарова, Т.Д.Черменская, В.В.Человечкова).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 октября 2013 г. N 3).

3. УТВЕРЖДЕНЫ врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю.Поповой 12 ноября 2013 г.

4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.143/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флоникамида в воде в диапазоне концентраций 0,001-0,01 мг/дм

, в почве в диапазоне концентраций 0,02-0,2 мг/кг, яблоках и яблочном соке в диапазоне концентраций 0,05-0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: флоникамид.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 4-трифторметил-N-цианометилникотинамид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула:

.

Молекулярная масса: 229,2.

Химически чистое вещество представляет собой белый кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления: 157,5°С.

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода

=0,3.

Растворимость в воде (г/дм

, 20

°

С) - 5,2.

Растворимость в органических растворителях (г/дм

, 20

°

С): ацетон - 163,5, толуол - 0,55, этилацетат - 34,2, дихлорметан - 4,5.

Краткая токсикологическая характеристика

: острая пероральная ЛД

=884; 1768 мг/кг массы тела для самцов и самок крыс соответственно. Острая дермальная для крыс ЛД

>5000 мг/кг. Не ирритант для кожи и глаз кроликов. Острая токсичность: рыбы ЛК

>100 мг/л, дафнии ЭК

>100 мг/л, зеленые водоросли ЭК

>100 мг/л. Не токсичен для энтомофагов.

Область применения: селективный, системный инсектицид для сосущих насекомых, повреждающих плодовые, зерновые, овощные культуры.

В России для флоникамида гигиенические нормативы не установлены.

 1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности

=0,95 не превышает значений, приведенных в табл.1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/дм )	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель внутрилабо- раторной прецизион- ности, , %	Показатель воспроизво- димости, , %	Показатель точности* (границы относи-тельной погрешности), ± , %
Вода	0,001-0,01	9	11	12	24
Почва	0,02-0,2	8	9	11	22
Яблоки	0,05-0,5	9	11	12	24
Яблочный сок	0,05-0,5	9	11	12	24
* Соответствует расширенной неопределенности при коэффициенте охвата =2

Таблица 2

Полнота извлечения флоникамида, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для

=20,

=0,95

Анализируемый объект	Предел обнаружения, мг/кг (мг/дм )	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/дм )	Полнота извлечения, %	Стандартное отклонение,	Доверительный интервал среднего результата, ±%
Вода	0,001	0,001-0,01	84,1	4,93	2,46
Почва	0,02	0,02-0,2	83,4	1,98	0,99
Яблоки	0,05	0,05-0,5	88,0	2,25	1,13
Яблочный сок	0,05	0,05-0,5	81,4	3,00	1,50

 2. Метод измерений

Методика основана на определении флоникамида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем и последующей очистки на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация флоникамида проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

 3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки
Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0,2 мг	ГОСТ 24104-2001
Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0,1 г	ГОСТ 24104-2001
Колбы мерные на 10, 100 и 1000 см	ГОСТ 23932-90
Микродозаторы одноканальные переменного объема от 200 до 1000 мм и от 1 до 5 см
Цилиндры мерные на 50 и 100 см	ГОСТ 23932-90
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, (100х2,1) мм, 1,7 мкм
Аппарат для встряхивания проб	ТУ 64-1-1081-73
Воронки делительные, вместимостью 250 см	ГОСТ 25336-82
Воронки химические конусные	ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 25, 50 и 100 см	ГОСТ 9737-93
Колбы плоскодонные конические вместимостью 100 см	ГОСТ 25336-82
Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, 0,4 г	ТУ 4215-002-0545-931-94
Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 см
Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар
Стаканы химические вместимостью 150 см	ГОСТ 25336-82
Фильтры бумажные быстрой фильтрации	ТУ 6.091678-86
Центрифуга с максимальной рабочей частотой вращения 4000 об./мин
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

 4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009*, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

 5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п.13.

 6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20±5)°С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

 7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1-0,2 см

/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции

Патрон промывают 2 см

этилацетата, затем 3 см

смеси N 1 (гексан:этилацетат).

7.3. Приготовление растворов

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты

: (0,5

±0,01)

г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм

, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления 0,1 М фосфатного буфера

взвешивают 11,4 г калия фосфорно-кислого двузамещенного 3-водного и 6,8 г калия дигидрофосфата, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см

, растворяют в воде и доводят объем до метки водой.

7.3.3. Смесь ацетонитрила с водой в соотношении 20:80 готовят по объёму, используя мерные цилиндры.

7.3.4. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 13:87 по объёму, используя мерные цилиндры.

7.4. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см

: точную навеску флоникамида (50

±0,5)

мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см

, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями флоникамида 0,1, 0,5, 1,0, 5,0 и 10,0 мкг/см

готовят методом последовательного разбавления по объему, используя смесь ацетонитрила и воды в соотношении 20:80.

7.4.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 10,0 мкг/см

: в мерную колбу вместимостью 100 см

вносят 2,0 см

основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 5,0 мкг/см

: в мерную колбу вместимостью 100 см

помещают 1,0 см

основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 1,0 мкг/см

: в мерную колбу вместимостью 10 см

помещают 1 см

раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,5 мкг/см

: в мерную колбу вместимостью 10 см

помещают 1 см

раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,1 мкг/см

: в мерную колбу вместимостью 10 см

помещают 1 см

раствора N 3 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - 2 дней.

При изучении полноты определения флоникамида в воде, почве, яблоках и яблочном соке используют ацетоновые растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетоном.

7.5. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация флоникамида в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм

градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации флоникамида в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (

) в уравнении линейной регрессии:

, где

- площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

, где

- аттестованное значение массовой концентрации флоникамида в градуировочном растворе,

- результат контрольного измерения массовой концентрации флоникамида в градуировочном растворе,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, %. (

=10% при

=0,95).

7.6. Проверка хроматографического поведения флоникамида на патроне

В круглодонную колбу емкостью 10 см

отбирают 1 см

стандартного раствора флоникамида с концентрацией 1 мкг/см

. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см

смеси N 1 и переносят на подготовленный патрон (п.7.2). Колбу обмывают 1 см

смеси N 1 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 5 см

смеси N 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют флоникамид этилацетатом со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см

, упаривают досуха, растворяют в 1 см

смеси ацетонитрил-вода, 20:80 и анализируют по п.9.4.

Фракции, содержащие флоникамид, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание: Проверку хроматографического поведения флоникамида следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

 8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб". Отбор проб яблок производят в соответствии с ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки".

Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы фруктов хранят до анализа в герметичной полиэтиленовой упаковке в морозильной камере при -18°С. Перед анализом фрукты, не размораживая, измельчают на терке или в гомогенизаторе.

 9. Проведение определения

9.1. Экстракция флоникамида из воды

Пробу воды 100 см

помещают в делительную воронку вместимостью 250 см

, добавляют 30 см

этилацетата и интенсивно встряхивают 2-3 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой собирают, к водному добавляют 30 см

этилацетата и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, и собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см

. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40

°

С. Сухой остаток растворяют в 1 см

смеси ацетонитрил-вода 20:80, и 10 мм

вводят в хроматограф.

9.2. Экстракция флоникамида из почвы

Навеску почвы 20 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см

и добавляют 20 см

ацетона. Пробирку плотно закрывают и помещают в аппарат для встряхивания на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4000 об./мин. От верхнего слоя отбирают аликвоту 10 см

, соответствующую 10 г пробы, переносят в круглодонную колбу вместимостью 50 см

. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40

°

С, остаток растворяют в 1 см

смеси ацетонитрил-вода 20:80 и 10 мм

вводят в хроматограф.

9.3. Экстракция флоникамида из яблок

Навеску измельченных плодов яблок 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 100 см

, добавляют 30 см

0,1 М фосфатного буфера и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Экстракт декантируют в делительную воронку вместимостью 250 см

пропуская через бумажный фильтр, к остатку в колбе добавляют 30 см

буфера и повторяют экстракцию. К объединенному экстракту в делительной воронке добавляют 30 см

этилацетата и интенсивно встряхивают 2-3 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см

этилацетата и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см

и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40

°

С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п.9.5.

9.4. Экстракция флоникамида из яблочного сока

Навеску сока 20 г помещают в стакан вместимостью 100 см

, доводят объем до 50 см

0,1 М фосфатным буфером и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см

, добавляют 30 см

этилацетата и интенсивно встряхивают 2-3 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см

этилацетата и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см

и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40

°

С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п.9.5.

9.5. Очистка на патроне для твердофазной экстракции

Сухой остаток, полученный по п.9.3 или 9.4, растворяют в 1 см

смеси N 1, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п.7.2), колбу ополаскивают 1 см

смеси N 1 и также наносят на патрон. Патрон промывают 5 см

смеси N 1, элюат отбрасывают. Флоникамид элюируют 6 см

этилацетата, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 1 см

смеси ацетонитрил-вода 20:80 и 10 мм

вводят в хроматограф.

9.6. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18 - (2,1х100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30

±1)°

С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 13:87. Скорость потока элюента: 0,2 см

/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 265 нм. Объем вводимой пробы 10 мм

.

 10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание флоникамида в пробе (

, мг/кг) вычисляют по формуле:

, где

- площадь пика флоникамида на хроматограмме испытуемого образца, мм

(AU);

- градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

- объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см

;

- навеска анализируемого образца, г;

- полнота извлечения флоникамида, приведенная в табл.2, %.

Содержание остаточных количеств флоникамида в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флоникамида с концентрацией 10,0 мкг/см

, разбавляют смесью ацетонитрил-вода в соотношении 20:80.

 11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

, где                                                      (1)

,

- результаты параллельных определений, мг/кг;

- значение предела повторяемости (

).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

 12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности

=0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

, где

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,05 мг/кг*, где * - 0,05 мг/кг - предел обнаружения флоникамида в яблоках).

 13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки

должна удовлетворять условию:

, где

(

) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

, где

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры

рассчитывают по формуле:

, где

,

,

- среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п.11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля

рассчитывают по формуле:

                                                        (2)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (

) с нормативом контроля (

).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

,                                                                   (3)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (

):

, где                                                   (4)

,

- результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

- предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.