ГОСТ ИСО 21569-2009 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Методы качественного обнаружения на основе анализа нуклеиновых кислот (с Изменением N 1).
ГОСТ ИСО 21569-2009
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Методы качественного обнаружения на основе анализа нуклеиновых кислот
Foodstuffs
Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Qualitative nucleic acid based methods
МКС 67.050
Дата введения*
Предисловие
Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации (ЕАСС) представляет собой региональное объединение национальных органов по стандартизации государств, входящих в Содружество Независимых Государств. В дальнейшем возможно вступление в ЕАСС национальных органов по стандартизации других государств.
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Порядок разработки, принятия, применения, обновления и отмены".
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт метрологии" (БелГИМ) на основе собственного аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Евразийским советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 36-2009 от 11 ноября 2009 г.)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения | AM | Минэкономики Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Казахстан | KZ | Госстандарт Республики Казахстан |
Кыргызстан | KG | Кыргызстандарт |
Молдова | MD | Молдова-Стандарт |
Таджикистан | TJ | Таджикстандарт |
Узбекистан | UZ | Узстандарт |
4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 21569:2005* Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Qualitative nucleic acid based methods (Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Методы качественного обнаружения на основе анализа нуклеиновых кислот).
Международный стандарт разработан CEN/TC 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы" Европейского комитета по стандартизации (CEN) совместно с ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO) в соответствии с Соглашением о техническом сотрудничестве между ISO и CEN (Венским соглашением).
Перевод с английского языка (en).
В разделе "Нормативные ссылки" и тексте стандарта ссылки на международные стандарты актуализированы.
Сведения о соответствии межгосударственного стандарта ссылочному международному стандарту приведены в дополнительном приложении Д.А.
Степень соответствия - идентичная (IDT)
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных (государственных) стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация также будет опубликована в сети Интернет на сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"
Зарегистрирован N 6007 7 сентября 2010 г.
ВНЕСЕНО Изменение N 1, принятое Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 116-П от 28.02.2019)*
Введение
Обнаружение генетически модифицированных источников в ингредиентах пищевых продуктов выполняется посредством описанных далее действий, выполняемых последовательно или одновременно. После отбора пробы из анализируемой порции проводят выделение нуклеиновых кислот. Выделенные нуклеиновые кислоты могут быть дополнительно очищены, одновременно с процессом выделения или после него. Дальнейшими действиями являются определение их концентрации (при необходимости), разведение (при необходимости) и использование в аналитических процедурах (например, в анализе ПЦР). Проведение этих действий подробно описано в настоящем стандарте, а также в группе международных стандартов, объединенных общим заголовком: "Пищевые продукты. Методы анализа для определения генетически модифицированных организмов и содержащих их продуктов":
- "Методы количественного определения на основе анализа нуклеиновых кислот" (ISO 21570);
- "Выделение нуклеиновых кислот" (ISO 21571).
Дополнительная информация об общих требованиях и определениях, включая описанные выше шаги, приводится в международном стандарте ISO 24276.
Качественное определение целевых последовательностей ДНК выполняется с целью получения ответа "да" или "нет" на вопрос о содержании или отсутствии целевой последовательности ДНК с учетом соответствующих контрольных проб в пределах обнаружения используемого метода анализа и для анализируемой части образца.
Специфичность методов, в соответствии с описаниями в приложениях А-D, варьируется от скрининга (определение типичных последовательностей ДНК, характерных для ГМО) до специфической идентификации генетической конструкции или специфического события генетической трансформации.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
1 Область применения
Настоящий стандарт содержит описание процедур качественного определения генетически модифицированных организмов (ГМО) и содержащих их продуктов путем анализа нуклеиновых кислот, выделяемых из исследуемого образца. Основное внимание уделено методам анализа на основе амплификации нуклеиновых кислот с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В настоящем стандарте приводятся общие требования к специфическому определению и идентификации целевых последовательностей нуклеиновой кислоты (ДНК) и к подтверждению идентичности амплифицированной последовательности ДНК.
Руководства, минимальные требования и критерии выполнения, установленные в настоящем стандарте, предназначены для обеспечения получения сопоставимых, точных и воспроизводимых результатов в различных лабораториях.
Настоящий стандарт был разработан для матриц пищевых продуктов, однако может быть также применен для анализа других матриц (например, корма для животных, образцы растений из окружающей среды).
Примеры конкретных методов приводятся в приложениях A-D.
2 Нормативные ссылки
Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные документы*. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного документа, для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного документа.
ISO 21571:2005 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и их производных. Извлечение нуклеиновой кислоты
ISO 24276:2006 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения, установленные в ISO 24276.
4 Принцип метода
4.1 Общие положения
Качественный анализ представляет собой специфическое определение целевых последовательностей нуклеиновой кислоты в анализируемых образцах. Каждый метод должен быть специфичен для целевой последовательности.
Качественный анализ должен четко показывать наличие или отсутствие исследуемого генетического элемента с учетом соответствующих контролей.
Примечание - Пределы обнаружения используемого метода анализа и размер анализируемой части образца представляют собой критические аспекты метода.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.2 ПЦР-амплификация
Амплификация целевой последовательности ДНК производится in vitro посредством реакции, катализируемой ДНК-полимеразой, в присутствии олигонуклеотидов-праймеров и дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в заданном реакционном буфере [1], [2]. Необходимым условием для проведения амплификации целевой последовательности является отсутствие ингибиторов полимеразы в реакционной смеси. Амплификация ДНК - это циклический процесс, состоящий из следующих этапов:
- денатурация двухнитевой ДНК в однонитевую нуклеиновую кислоту посредством нагрева;
- отжиг (специфическая гибридизация) праймеров к целевой последовательности при соответствующей температуре и
- элонгация праймеров, связанных с обеими одинарными спиралями, ДНК-полимеразой, применимой в ПЦР, при соответствующей температуре.
4.3 Обнаружение и подтверждение продуктов ПЦР
Обнаружение продуктов ПЦР производится с помощью электрофореза в агарозном геле или при необходимости альтернативными доступными методами после изоляции посредством соответствующей процедуры разделения.
Идентификация любой обнаруженной целевой последовательности может быть подтверждена соответствующей методикой (например, с помощью рестрикционного анализа ферментами рестрикции, гибридизации или анализа последовательности ДНК).
В случае использования анализа ПЦР в реальном времени амплификация и детектирование происходят одновременно.
5 Реактивы
Если это не оговаривается особо, растворы реактивов, используемых для анализа, обычно хранят приблизительно при минус 20°С.
Целесообразно разделить используемые для аналитического метода растворы реактивов на малые порции, это позволит избежать многократного повторения циклов размораживания/замораживания, а также снизить риск перекрестной контаминации.
5.1 Целевая ДНК/Контроль
5.2 Вода
5.3 Раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP), содержащий dATP, dCTP, dGTP и dTTP или dUTP.
Примечание - Использование dUTP может отрицательно повлиять на дальнейшее проведение анализа продуктов амплификации ПЦР с помощью рестрикционного анализа.
5.4 Буферный раствор для ПЦР
5.5 Термостабильная ДНК-полимераза
5.6 Прямой праймер
5.7 Обратный праймер
6 Инструменты и оборудование
Подробная информация по инструментам и оборудованию приводится в ISO 24276 и приложениях А-D.
7 Процедура анализа
7.1 Качество, целостность и амплифицируемость выделенной нуклеиновой кислоты
Раствор нуклеиновой кислоты должен быть достаточно чистым для последующего анализа [3]. Качество и количество выделенной с помощью заданного метода из определенного материала образца нуклеиновой кислоты должны быть повторяемы и воспроизводимы.
Примечание - Качество, целостность и количество образца ДНК влияет на выход ПЦР и, следовательно, на получаемые результаты анализа. Предел обнаружения конкретного метода может, таким образом, зависеть от того, был ли анализируемый материал обработан или очищен, а также от степени деградации (разрушения) ДНК в нем.
Нуклеиновые кислоты, используемые в ПЦР, не должны содержать ингибиторы ПЦР [4]. Необходимо использовать контроли ингибирования ПЦР, описанные в ISO 24276.
7.2 Критерии выполнения анализа
Общие критерии выполнения анализа описаны в ISO 24276.
Значения характеристик выполнения анализа приводятся для каждого метода и указаны в приложениях А-D; при этом следует учитывать размер генома, см. [5].
В оптимальной реакции требуется менее 40 циклов для амплификации 10 и более целевых молекул и получения продукта, который может быть легко обнаружен стандартными методами. По мере увеличения числа циклов возможно накопление неспецифических продуктов реакции. Оптимизированная ПЦР должна позволять получить за 40 циклов из чистого образца стандартного состава, в котором содержатся 100 копий матрицы ДНК, достаточное для обнаружения количество копий продукта ПЦР. Следует строго придерживаться заданных количества циклов, профиля кривой "температура - время" для каждой системы праймеров и реакционной смеси, учитывая используемое оборудование.
В целом следует максимально возможно увеличивать специфичность реакции (например, используя ПЦР с "горячим стартом"). ПЦР с "горячим стартом" рекомендуется как средство снижения побочных реакций (например, амплификация нецелевых последовательностей фоновой ДНК (ошибочная посадка праймеров) или олигомеризация праймеров) и, таким образом, увеличения специфичности метода.
Значения, полученные в ходе метрологической аттестации, могут быть не применимы к диапазонам концентраций анализируемого вещества и материалам образцов, отличающихся от перечисленных в соответствующих приложениях.
7.3 Аспекты подбора параметров ПЦР
7.3.1 Общие положения
Так как выполнение каждой индивидуальной ПЦР должно быть сопоставимо с другими специфическими ПЦР, следует учитывать приведенные далее аспекты подбора параметров ПЦР.
7.3.2 Размер ПЦР-продуктов
Размер целевой последовательности следует выбирать таким образом, чтобы он попадал в диапазон молекулярных масс, имеющихся в выделенной из анализируемого образца ДНК.
Пример - Для сильно деградировавшей ДНК из продуктов, прошедших термическую обработку, оптимальный размер ПЦР-продукта должен быть в диапазоне от 60 до 150 пар нуклеотидов (п.н.). Для сырья можно использовать более широкий диапазон, например вполне допустимо значение 250 п.н.
Однако, если в результате предварительно проведенных экспериментальных исследований по оценке соответствия наборов праймеров получены ПЦР-продукты различного размера, эти праймеры могут быть использованы для анализа образцов, материал которых был аттестован в таких исследованиях.
7.3.3 Праймеры
7.3.3.1 Общие положения
Информация о последовательности праймеров приводится в приложениях A-D.
7.3.3.2 Подбор праймеров
Последовательности праймеров должны по возможности иметь следующие характеристики:
- длина каждого праймера - от 18 до 30 нуклеотидов;
- по возможности соотношение GC:AT=50:50 или как можно ближе к этому соотношению;
- высокая внутренняя стабильность (не допускается концентрация нуклеотидов G и С в коротких сегментах праймеров);
- минимальная 3’-концевая комплементарность для предотвращения образования димеров праймеров;
- минимальная вторичная структура;
- минимальное образование димеров со специфическими зондами для детектирования, разработанными для ПЦР.
Для облегчения подбора праймеров разработаны специализированные программы.
7.3.3.3 Метрологическая аттестация праймеров
7.3.3.3.1 Общие положения
Следует подтвердить способность праймеров обнаруживать целевую последовательность.
Аттестацию праймеров следует проводить в два этапа: первый этап заключается в теоретической оценке, а второй - в экспериментальных испытаниях.
7.3.3.3.2 Теоретическая оценка специфичности
7.3.3.3.3 Экспериментальная оценка специфичности
Вне зависимости от использованных критериев подбора праймеров их специфичность обязательно должна быть установлена экспериментальным путем. Такая оценка должна подтвердить способность праймеров различать целевую и нецелевую, но схожую последовательности.
Следует подтвердить, что праймеры, подобранные для обнаружения целевых последовательностей, специфичных к таксону, способны достоверно обнаруживать эти последовательности в соответствующем количестве различных членов таксона.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
7.4 Описание целей ПЦР
Для качественного обнаружения и идентификации ГМО можно провести различные ПЦР-исследования, зависящие от типа материалов исследуемых образцов и/или от требований к анализу. Эти исследования могут быть направлены на последовательности, специфичные для целевых таксонов, генетических конструкций и трансформационных событий, а также для элементов, пригодных для задач скрининга.
7.5 Контроли
Из-за существования риска получения ложноположительных и/или ложноотрицательных результатов в каждое исследование ПЦР следует включить соответствующие контроли (см. ISO 24276).
При условии наличия на рынке соответствующих сертифицированных образцов стандартного состава (референсные образцы стандартного состава) их следует использовать в качестве положительных и отрицательных контрольных проб.
7.6 Проведение ПЦР, обнаружение и подтверждение продуктов ПЦР
В приложениях А-D приводится подробное описание конкретных этапов последовательности ПЦР-анализа.
Примечание - Если для обнаружения продуктов ПЦР используется электрофорез в агарозном геле, размер продуктов ПЦР может быть оценен с помощью соответствующих маркеров длины ДНК, которые следует запустить параллельно с исследуемыми ПЦР-продуктами.
В некоторых случаях желательно подтвердить положительный или отрицательный результат для определенной генетической модификации. Такое подтверждение может быть проведено с помощью применения праймеров к альтернативной целевой последовательности; этот способ бывает особенно полезен при подтверждении результатов скрининга.
Положительная идентификация специфической последовательности целевой ДНК может быть подтверждена соответствующим методом (но не определением размера ПЦР-продукта), например:
- путем гибридизации ПЦР-продукта со специфичными зондами, или
- путем проведения рестрикционного анализа ПЦР-продуктов; длина полученных фрагментов должна соответствовать ожидаемой длине целевой последовательности ДНК после рестрикции, или
- путем секвенирования (определения последовательности) ПЦР-продукта, или
- другим эквивалентным методом подтверждения.
Если используемые праймеры подобраны для обнаружения последовательностей, полученных из инфекционных организмов (встречающиеся в природе генетически немодифицированные организмы, например вирусы или бактерии), рекомендуется убедиться в том, что обнаруженная ДНК действительно происходит из ГМО. Такое подтверждение может быть выполнено путем проверки отсутствия другой ДНК, произошедшей из инфекционного организма.
Пример - 35S-промотор, полученный из вируса мозаики цветной капусты (CaMV); соответственно, обнаружение этого промотора может быть обусловлено наличием ДНК, произошедшей из ГМО или из CaMV [6]. Проверив наличие другой ДНК из вируса мозаики цветной капусты, можно удостовериться в происхождении 35S-промотора и последовательности ГМО (если не обнаружена другая последовательность ДНК из CaMV).
8 Интерпретация результатов
8.1 Общие положения
Результат ПЦР может быть:
a) положительным, если обнаружен специфический ПЦР-продукт, а все контрольные пробы дают результаты в соответствии с ISO 24276:2006, таблица 2, или
b) отрицательным, если не обнаружен специфический ПЦР-продукт, а все контрольные пробы дают результаты в соответствии с ISO 24276:2006, таблица 2.
Примечание - Специфичные для трансформационных событий целевые последовательности иногда обнаруживаются вместе с другими специфичными последовательностями трансформационных событий в одном ГМО (например, из-за наложения генов [7]).
Если получен неопределенный (позволяющий проводить двоякую интерпретацию) результат, анализ следует повторить, см. ISO 24276.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
8.2 Подтверждение
Подтверждение положительных или отрицательных результатов может быть выполнено в соответствии с 7.6.
9 Представление результатов и контроль качества
9.1 Общие положения
Результаты должны быть представлены определенно, т.е. не в виде "±".
Отрицательный результат никогда не следует предоставлять в виде "ГМО отсутствует".
В идеале в протоколе должен быть указан предел обнаружения, определенный по соответствующему исследуемому образцу. Однако это требует определенных материалов, ДНК исключительно высокого качества и/или использования сложного лабораторного оборудования, которое имеется не у всех лабораторий. Такой анализ может стать очень трудоемким и/или дорогостоящим, а следовательно, не может быть применен в обычных лабораторных условиях.
В протоколе следует указать по крайней мере предел обнаружения, определенный для образца стандартного состава, и относительное значение для конкретного материала образца (предпочтительно заданное количество раствора геномной ДНК, например 100 нг 0,01% ДНК GTS 40-3-2).
9.2 Представление отрицательного результата
В протоколе испытаний должен присутствовать следующий текст:
"Целевая последовательность Y не обнаружена в образце X.
Предел обнаружения метода x % определен по ABC (укажите референсный образец стандартного состава)".
Если невозможно доказать, что количество целевой ДНК, использованное в ПЦР, было достаточным для применения предела обнаружения, в протокол следует добавить следующее предложение:
"Однако количество целевой ДНК, выделенной из образца X, может быть/было недостаточным для применения предела обнаружения в этом образце".
Примечание - Предел обнаружения в образце определяется по количеству ДНК вида, использованному в аналитической реакции (число копий), и соотношению к абсолютному пределу обнаружения целевой генетической модификации (число копий) [7].
9.3 Представление положительного результата
В протоколе испытаний должен присутствовать следующий текст:
"В образце X обнаружена целевая последовательность Y".
Можно также указать ГМО, если доступна такая информация.
9.4 Требования к контролю качества
Результаты, полученные для одной и той же анализируемой части образца, должны быть непротиворечивыми. В случае +/- результатов для двух повторений необходимо повторить две ПЦР для соответствующей анализируемой части образца. Если результаты двух новых повторных испытаний дают +/- или -/-, анализируемой части образца приписывается отрицательный результат.
Результаты испытаний всех анализируемых частей образца должны соответствовать друг другу. Если как минимум одна анализируемая часть образца дает положительный результат и еще как минимум одна анализируемая часть дает отрицательный результат, анализ следует повторить.
В случае если как минимум одно повторение процедуры, начиная с экстрагирования нуклеиновых кислот, дает неоднозначные результаты, например один - положительный и один - отрицательный, результат для образца в протоколе должен быть обозначен как отрицательный на пределе обнаружения (LOD).
(Измененная редакция, Изм. N 1).
10 Протокол испытаний
Протокол испытаний должен быть оформлен в соответствии с требованиями ISO 24276 и должен содержать по крайней мере следующую дополнительную информацию:
- предел обнаружения и материал образца, использованный для определения предела обнаружения;
- специфичность аналитического метода (специфичность к трансформационным событиям, специфичность к генетической конструкции либо метод скрининга);
- результат, представленный в соответствии с требованиями раздела 9.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
Приложение А
(справочное)
Методы, специфичные к целевым таксонам
А.1 Метод, специфичный к целевому таксону, для определения компонентов, полученных из соевых бобов
А.1.1 Общие положения
Описана стандартная процедура определения видоспецифичного однокопийного гена, встречающегося в соевых бобах (Glycine max).
Этот метод используется для оценки амплифицируемости ДНК-продуктов, в состав которых входят соевые бобы.
А.1.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
А.1.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод был метрологически аттестован в совместных сличительных испытаниях [8], [9], организованных рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV) в соответствии со статьей 35 Федерального закона Германии о пищевых продуктах. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3 (однако вес анализируемой части образца составлял 100 мг).
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице А.1.
Таблица А.1 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1997 [8] | 1998/1999 [9] |
Количество лабораторий | 25 | 27 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 22 | 20 |
Количество образцов на лабораторию | 10 | 3 |
Количество принятых результатов | 220 | 60 |
Количество образцов, содержащих соевые бобы | 220 | 50 |
Ложноположительные результаты | 0 | 1 (2%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 | 1 (2%) |
А.1.2.2 Молекулярная специфичность
А.1.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
_______________
А.1.2.2.2 Теоретическая часть
В качестве целевой последовательности из баз данных генов был выбран ген соевого лектина Le1 [10].
_______________
Количество копий целевой последовательности не определяли, однако предполагалось, что это однокопийный ген.
А.1.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из других сельскохозяйственных растений (бобовых, зерновых и овощных культур), а также из говядины и свинины, не наблюдали амплификацию. Метод ПЦР для соевых бобов показал свою высокую специфичность к ДНК соевых бобов [10], [11].
А.1.2.3 Предел обнаружения
Не был определен абсолютный предел обнаружения, однако с помощью флуорометрического анализа было показано, что метод способен обнаруживать по меньшей мере 0,1 нг ДНК соевых бобов.
А.1.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
А.1.4 Принцип
Принцип метода заключается в амплификации фрагмента ДНК из соевых бобов длиной 118 п.н. с использованием ПЦР и разделении с помощью электрофореза в агарозном геле.
А.1.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
А.1.5.1 Вода
_______________
А.1.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
А.1.5.5 Олигонуклеотиды
А.1.5.5.1 Прямой праймер
Ген лектина соевых бобов (позиция базы данных GenBank® N K00821).
Праймер GM03: 5’-gCC СТС ТАС ТСС АСС ССС АТС С-3’.
А.1.5.5.2 Обратный праймер
Ген лектина соевых бобов (позиция базы данных GenBank® N К00821).
Праймер GM04: 5’-gCC CAT CTg САА gCC ТТТ TTg Tg-3’.
А.1.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
А.1.5.7 Зонд для гибридизации (GM)
5’-ggT AgC gTT gCC AgC ТТС g-3’.
Пятикратный буферный раствор SSC - это раствор, содержащий 0,75 моль/л NaCI и 0,075 моль/л цитрата натрия.
А.1.5.9 Прегибридизационный раствор
_______________
А.1.5.10 Раствор для гибридизации
Содержит 10 пмоль зонда для гибридизации в 2,5 мл прегибридизационного раствора (А.1.5.9). Температура гибридизации - 50°С. Дополнительная информация по условиям гибридизации приводится в ссылке [12].
А.1.6 Оборудование
А.1.6.1 Амплификатор
А.1.6.2 Камера для электрофореза, с источником питания.
А.1.7 Процедура анализа
А.1.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице А.2. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице А.2.
Таблица А.2 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 1 |
Вода |
| 15,9 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор  , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,8 ммоль/л | 2 |
Праймер GM03, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
Праймер GM04, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 0,5 IU | 0,1 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 1,5 ммоль/л. | ||
А.1.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава GTS 40-3-2, производимые Институтом референсных материалов и измерений (IRMM), Гиль, Бельгия (IRMM-410).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
А.1.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица А.3 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 30 с/95°С |
| 30 с/60°С |
| 60 с/72°С |
Количество циклов | 35 |
Завершающая полимеризация | 3 мин/72°С |
А.1.8 Специфичность продукта ПЦР
Так как представленный метод может рассматриваться исключительно как контрольный метод для определения качества выделенной ДНК, проверка специфичности основывается только на размере продукта ПЦР.
Если метод используется в целях, отличающихся от упомянутых выше, проверка специфичности продукта амплификации может быть выполнена с помощью гибридизации по Саузерну с использованием олигонуклеотидного зонда GM, меченного дигоксигенином (А.1.5.7-А.1.5.10), или путем секвенирования (определения последовательности) продукта ПЦР и сравнения результатов с данными базы данных GenBank®, перечисленными в А.1.5.5.
А.1.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных образцов стандартного состава, приготовленных из сои линии GTS 40-3-2 (например, серия стандартов IRMM-410 производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в А.1.8.
Обнаружение фрагментов с размером 118 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК, происходящую из соевых бобов, в пределах установленных параметров специфичности, описанных в А.1.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
А.2 Метод, специфичный к целевому таксону, для определения многокопийных последовательностей ДНК, обычно присутствующих в хлоропластах растений
А.2.1 Общие положения
Описана стандартная процедура определения многокопийных последовательностей ДНК, обычно присутствующих в хлоропластах растений (интронгенахлоропластов trnL).
Этот метод пригоден для проверки успешности выделения ДНК из образца пищевого продукта, а также для оценки наличия амплифицируемой растительной ДНК. При анализе образцов продуктов, прошедших обработку, применение этого метода зависит от степени деградации ДНК.
Растительная клетка обычно содержит много копий этой последовательности ДНК, а размер целевой последовательности значительно превышает размеры последовательностей ДНК, используемых для обнаружения определенных генетических модификаций. Поэтому этот метод не может использоваться в качестве контроля при количественном определении.
Количество копий в клетке может быть различным у разных видов и тканей растений.
А.2.2 Порядок метрологической аттестации и критерии выполнения
А.2.2.1 Совместное сличительное испытание
Этот метод был метрологически аттестован в совместном сличительном испытании [13], организованном рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV) в соответствии со статьей 35 Федерального закона Германии о пищевых продуктах. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3 (однако вес анализируемой части образца составлял 100 мг).
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице А.4.
Таблица А.4 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1995 |
Количество лабораторий | 18 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 18 |
Количество образцов на лабораторию | 10 |
Общее количество образцов | 180 |
Количество принятых результатов | 180 |
Количество образцов, содержащих картофель B33-INV | 71 |
Количество образцов, содержащих генетически немодифицированный картофель | 109 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
А.2.2.2 Молекулярная специфичность
А.2.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевых последовательностей, описанных в [14], например доступы базы данных GenBank® N Z00044, S54304, Х15901.
А.2.2.2.2 Теоретическая часть
При поиске в базах данных (поиск NCBI BlastN®, база данных EMBL, по состоянию на 28 сентября 2001 г.) не была обнаружена значимая схожесть с последовательностями ДНК нерастительного происхождения.
Были разработаны праймеры, предназначенные для амплификации уникальной последовательности ДНК хлоропластов (интрон, входящий в состав последовательности гена trnL); показано отсутствие схожести с нецелевыми последовательностями.
А.2.2.2.3 Экспериментальная часть
При использовании в ПЦР ДНК, выделенной из животных, грибов или бактерий, амплификация не была обнаружена [14].
Была показана амплификация ДНК, выделенной из водорослей, цианобактерий, мхов, птеридофитов, покрытосеменных и голосеменных растений [14].
Целевая последовательность была многокопийна и количество копий зависело от вида и типа тканей растений.
А.2.2.3 Предел обнаружения
Не был определен абсолютный предел обнаружения, однако с помощью флуорометрического анализа было показано, что метод способен обнаруживать по меньшей мере 0,1 нг ДНК соевых бобов.
А.2.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
А.2.4 Принцип
Принцип метода заключается в амплификации находящегося в гене тРНК хлоропластов фрагмента [14] длиной от 500 до 600 п.н. с использованием ПЦР и разделении с помощью электрофореза в агарозном геле.
А.2.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
А.2.5.1 Вода
А.2.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
А.2.5.5 Олигонуклеотиды
А.2.5.5.1 Прямой праймер
Ген тРНК хлоропластов (позиция базы данных GenBank® N Z00044, Х15901).
Праймер с [14]: 5’-CgA ААТ Cgg TAg ACg СТА Cg-3’.
А.2.5.5.2 Обратный праймер
Ген тРНК хлоропластов (позиция базы данных GenBank® N Z00044, Х15901).
Праймер d [14]: 5’-ggg gAT AgA ggg ACT TgA AC-3’.
A.2.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза, 5 IU/мкл.
A.2.6 Оборудование
В соответствии с А.1.6.
А.2.7 Процедура анализа
А.2.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице А.5. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице А.5.
Таблица А.5 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 1 |
Вода |
| 13,9 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,8 ммоль/л | 2 |
Праймер с, 10 мкмоль/л | 0,8 мкмоль/л | 2 |
Праймер d, 10 мкмоль/л | 0,8 мкмоль/л | 2 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 0,5 IU | 0,1 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 1,5 ммоль/л. | ||
А.2.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава GTS 40-3-2, производимые Институтом референсных материалов и измерений (IRMM), Гиль, Бельгия (IRMM-410).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно ISO 24276.
А.2.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица А.6 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 4 мин/94°С |
Амплификация | 30 с/95°С |
| 30 с/55°С |
| 120 с/72°С |
Количество циклов | 35 |
Завершающая полимеризация | 5 мин/72°С |
А.2.8 Специфичность продукта ПЦР
Так как представленный метод может рассматриваться исключительно как контрольный метод для определения качества выделенной ДНК, точный размер фрагмента не играет большой роли. Таким образом, проверка специфичности основывается только на размере продукта ПЦР в пределах ожидаемого диапазона: от 500 до 600 п.н.
А.2.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных образцов стандартного состава, приготовленных из сои линии GTS 40-3-2 (например, серия стандартов IRMM-410 производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в А.2.8.
Обнаружение фрагментов с размером 500-600 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК растительного происхождения в пределах установленных параметров специфичности, описанных в А.2.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
А.3 Метод, специфичный к целевому таксону, и метод скрининга ГМО для обнаружения ДНК, полученной из томатов и/или генетически модифицированных томатов Zeneca®
А.3.1 Общие положения
Описана стандартная процедура определения видоспецифичной однокопийной последовательности ДНК, встречающейся в томатах (Lycopersicon esculentum Mill).
Метод может быть также использован в качестве метода скрининга для обнаружения генетически модифицированных томатов с замедленным созреванием (Zeneca; Lycopersicon esculentum Mill, сорт Alisa Craig, линия Nema 282F).
He описан способ проверки идентичности ПЦР-продукта. Поэтому этот метод не может рассматриваться как метод идентификации. Он может быть использован для оценки амплифицируемости ДНК, выделенной из томатов.
А.3.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
А.3.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод был метрологически аттестован в совместных сличительных испытаниях [15], организованных рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV) в соответствии со статьей 35 Федерального закона Германии о пищевых продуктах. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3.
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице А.7.
Таблица А.7 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1998 |
Количество лабораторий | 19 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 18 |
Количество образцов на лабораторию | 5 |
Количество принятых результатов | 90 |
Количество образцов, содержащих Lycopersicon esculentum Mill, сорт Alisa Craig, линия Nema 282F (Zeneca) | 43 |
Количество образцов, содержащих Lycopersicon esculentum Mill, сорт Alisa Craig, линия Nema 282C (немодифицированный сорт) | 47 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
Кроме того, в рамках европейского проекта SMT4-CT96-2072 Немецким федеральным институтом защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV) было проведено еще одно совместное сличительное испытание, соответствующее критериям, заданным в ISO 5275-2. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3 (однако вес анализируемой части образца составлял 100 мг).
Таблица А.8 - Результаты второго совместного сличительного испытания
Год проведения испытаний | 1998 |
Количество лабораторий | 21 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 19 |
Количество образцов на лабораторию | 10 |
Количество принятых результатов | 190 |
Количество образцов, содержащих Lycopersicon esculentum Mill, сорт Alisa Craig, линия Nema 282F (Zeneca) | 88 |
Количество образцов, содержащих Lycopersicon esculentum Mill, сорт Alisa Craig, линия Nema 282C (немодифицированный сорт) | 102 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
А.3.2.2 Молекулярная специфичность
А.3.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевых последовательностей, описанных, например, в базе данных GenBank®, доступ N Х04583.
А.3.2.2.2 Теоретическая часть
При поиске по базам данных (NCBI BlastN®, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), по состоянию на 28 сентября 2001 г.) не было обнаружено сходство с последовательностями ДНК других видов растений. Оба праймера на 100% совпадали со следующими пунктами базы данных: Х14074 (ген томатов, кодирующий полигалактуроназу, разрушающую клеточную стенку), Х05656 (мРНК полигалактуроназы томатов), М37304 [ген полигалактуроназы томатов (PG)], Х04583 (мРНК полигалактуроназы-2а томатов), А24194 (клон полигалактуроназы L. esculentum), А15981 (мРНК полигалактуроназы-2а L. esculentum), I01809 (последовательность нуклеотидов 1 из патента US4801540) и АХ062336 (последовательность 1 из патента WO0078982).
А.3.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из других сельскохозяйственных растений, амплификация не была обнаружена [16].
Количество копий целевой последовательности не определяли, однако предполагалось, что это однокопийный ген.
А.3.2.3 Предел обнаружения
Не был определен абсолютный предел обнаружения, однако была показана возможность амплификации фрагмента ДНК по крайней мере из 0,1 нг ДНК, выделенной из свежих помидоров (значение определено флуорометрическим методом).
А.3.3 Адаптация
Анализ образцов, прошедших глубокую переработку, может дать отрицательный результат в связи с возможным отсутствием целевых фрагментов ДНК длиной не менее 383 п.н.
Обнаружение фрагментов длиной 383 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК томатов, в то время как обнаружение фрагментов длиной 180 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК генетически модифицированных томатов (Zeneca; Lycopersicon esculentum Mill, сорт Alisa Craig, линия Nema 282F).
A.3.4 Принцип
Ген полигалактуроназы (ген PG) кодирует фермент полигалактуроназу, связанный с созреванием. Этот метод основан на амплификации эндогенного гена (гена дикого типа) PG [17] с размером фрагмента 383 п.н. В генетически модифицированных томатах Zeneca с этой же парой праймеров будет амплифицироваться второй фрагмент длиной 180 п.н., так как эти томаты трансформировались к ДНК гена PG [18], [19].
А.3.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
А.3.5.1 Вода
А.3.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
А.3.5.5 Олигонуклеотиды
А.3.5.5.1 Прямой праймер
Ген PG (позиция базы данных GenBank® N Х04583).
Праймер PG34L: 5’-ggA ТСС ТТА gAA gCA ТСТ AgT-3’.
А.3.5.5.2 Обратный праймер
Ген PG (позиция базы данных GenBank® N Х04583).
Праймер PG34R: 5’-CgT Tgg TgC АТС ССТ gCA Tgg-3’.
А.3.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
А.3.6 Оборудование
В соответствии с А.1.6.
А.3.7 Процедура анализа
А.3.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице А.9. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице А.9.
Таблица А.9 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 1 |
Вода |
| 16,8 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,4 ммоль/л | 1 |
Праймер PG34L, 10 мкмоль/л | 0,4 мкмоль/л | 1 |
Праймер PG34R, 10 мкмоль/л | 0,4 мкмоль/л | 1 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 1 IU | 0,2 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 1,5 ммоль/л. | ||
А.3.7.2 Контроли ПЦР
_______________
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
А.3.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица А.10 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 30 с/94°С |
| 60 с/60°С |
| 60 с/72°С |
Количество циклов | 35 |
Завершающая полимеризация | 6 мин/72°С |
А.3.8 Специфичность продукта ПЦР
К настоящему моменту проверка специфичности основывается только на размере продукта ПЦР.
А.3.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из образцов стандартного состава, приготовленных из томатов.
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в А.3.8.
Обнаружение фрагментов с размером 383 п.н. и 180 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК, происходящую соответственно из томатов и генетически модифицированных томатов Zeneca, в пределах установленных параметров специфичности, описанных в А.3.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
А.4 Метод, специфичный к целевому таксону, для определения компонентов, полученных из кукурузы
А.4.1 Общие положения
Описана стандартная процедура определения видоспецифичного однокопийного гена инвертазы, встречающегося в кукурузе (Zea mays).
Не описан способ проверки идентичности ПЦР-продукта. Поэтому этот метод не может рассматриваться как метод идентификации. Он может быть использован для оценки амплифицируемости ДНК, выделенной из кукурузы.
А.4.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
А.4.2.1 Совместные сличительные испытания
_______________
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице А.11.
Таблица А.11 - Результаты совместных сличительных испытаний [20]
Год проведения испытаний | 1999 |
Количество лабораторий | 18 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 16 |
Количество образцов на лабораторию | 6 |
Количество принятых результатов | 96 |
Количество образцов, содержащих кукурузу Bt-176 | 32 |
Количество образцов, содержащих кукурузу Bt-11 | 32 |
Количество образцов, содержащих немодифицированную кукурузу | 32 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
А.4.2.2 Молекулярная специфичность
А.4.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевой последовательности, описанной в базе данных GenBank®, доступ N U16123.
А.4.2.2.2 Теоретическая часть
В качестве целевой последовательности из базы данных последовательностей ДНК был выбран ген инвертазы кукурузы.
При поиске по базам данных (NCBI BlastN®, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), по состоянию на 28 сентября 2001 г.) была обнаружена некоторая гомология с последовательностями ДНК других сельскохозяйственных культур (бобовые, зерновые культуры, овощи) и ДНК человека и насекомых.
Результаты поиска гомологии по праймеру IVR1-F:
- AF171874 - растворимая кислая инвертаза IVR1 Zea mays (100%-ное совпадение);
- АХ033517 - последовательность 25 из патента DE19906169 (совпадение по 21 смежному нуклеотиду);
- АХ033514 - последовательность 22 из патента DE19906169 (совпадение по 21 смежному нуклеотиду).
Результаты поиска гомологии по праймеру IVR1-R:
- AF171874 - растворимая кислая инвертаза IVR1 Zea mays (100%-ное совпадение);
- АХ150234 - последовательность 30 из патента WO0132919 (100%-ное совпадение);
- AJ224681 - мРНК бета-фруктозидазы Triticum aestivum (совпадение по 20 смежным нуклеотидам);
- AF062735 - растворимая кислая инвертаза Saccharum officinarum (совпадение по 19 смежным нуклеотидам);
- AF062734 - растворимая кислая инвертаза Saccharum robustum (совпадение по 19 смежным нуклеотидам).
Количество копий целевой последовательности не определяли, однако предполагалось, что это однокопийный ген.
А.4.2.2.3 Экспериментальная часть
Метод ПЦР для кукурузы показал свою высокую специфичность к ДНК кукурузы [21].
А.4.2.3 Предел обнаружения
А.4.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
А.4.4 Принцип
Ген инвертазы кукурузы кодирует фермент метаболизма углеводов.
Принцип метода заключается в амплификации фрагмента ДНК длиной 226 п.н. от гена инвертазы кукурузы с использованием ПЦР и разделении с помощью электрофореза в агарозном геле.
А.4.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
А.4.5.1 Вода
А.4.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
А.4.5.5 Олигонуклеотиды
А.4.5.5.1 Прямой праймер
Ген инвертазы кукурузы (позиция базы данных GenBank® N U16123).
Праймер IVR1-F: 5’-CCg CTg ТАТ САС AAG ggC Tgg ТАС С-3’.
А.4.5.5.2 Обратный праймер
Ген инвертазы кукурузы (позиция базы данных GenBank® N U16123).
Праймер IVR1-R: 5’-ggA gCC CgT gTA gAg CAT gAC gAT С-3’.
А.4.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
А.4.6 Оборудование
В соответствии с А.1.6.
А.4.7 Процедура анализа
А.4.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице А.12. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице А.12.
Таблица А.12 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 2 |
Вода |
| 15,3 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,4 ммоль/л | 1 |
Праймер IVR1-F, 10 мкмоль/л | 0,5 мкмоль/л | 1,25 |
Праймер IVR1-R, 10 мкмоль/л | 0,5 мкмоль/л | 1,25 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 1 IU | 0,2 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 1,5 ммоль/л. | ||
А.4.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава, например кукуруза Bt 11 (IRMM-412) или кукуруза Event 176 (Bt 176) (IRMM-411).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
А.4.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица А.13 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 12 мин/95°С |
Амплификация | 30 с/95°С |
| 30 с/64°С |
| 60 с/72°С |
Количество циклов | 35 |
Завершающая полимеризация | 10 мин/72°С |
А.4.8 Специфичность продукта ПЦР
К настоящему моменту проверка специфичности основывается только на размере продукта ПЦР.
А.4.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных образцов стандартного состава, приготовленных из кукурузы (например, IRMM-412 (кукуруза Bt 11) или IRMM-411 (кукуруза Event 176), производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в А.4.8.
Обнаружение фрагментов с размером 226 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК, происходящую из кукурузы, в пределах установленных параметров специфичности, описанных в А.4.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
А.5 Метод, специфичный к целевому таксону, для определения ДНК, выделенной из риса
А.5.1 Назначение, важность и научное обоснование
Лабораторией по выявлению ГМО при Шанхайском университете Джао Тонг (GMDL-SJTU) были организованы совместные сличительные испытания, посвященные оценке применимости метода, специфичного к целевому таксону, с использованием рисового гена сахарозо-фосфат-синтазы (SPS) в качестве эндогена для качественного анализа генетически модифицированного (ГМ) или генетически не модифицированного риса. В указанном исследовании приняли участие 12 лабораторий из Испании, Кореи, Литвы, Словении, Японии, Италии и Китая.
Рабочий процесс совместных сличительных испытаний включал в себя следующие этапы:
- ПЦР, проводимую качественным методом для подтверждения гетерогенности гена SPS у селекционных сортов риса, различных по своему географическому и филогенетическому происхождению;
- ПЦР, проводимую качественным методом для подтверждения видовой специфичности гена SPS для риса;
- ПЦР, проводимую качественным методом для оценки предела обнаружения осуществляемого качественным методом ПЦР-анализа SPS.
Совместные сличительные испытания проводились в соответствии с [44].
Результаты совместных сличительных испытаний и соответствующий протокол представлены в А.5.3.
А.5.2 Принцип
Метод был оптимизирован для использования с семенами риса, а также с переработанными продуктами, такими как рисовая мука. Применимость гена SPS в рамках данных совместных сличительных испытаний оценивалась с использованием образцов ДНК, полученных из семян риса и других растительных материалов.
Организатор совместных сличительных испытаний предоставил остальным участникам специфичные к методу реактивы (праймеры, зонды, исходную реакционную смесь) и образцы ДНК для исследования, выделенные из рисовых продуктов.
А.5.3 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
А.5.3.1 Робастность метода
Робастность проверялась на системе ПЦР для качественного анализа гена SPS при трех различных значениях температуры отжига (56°С, 58°С и 60°С), с тремя различными образцами ДНК, содержащими известные количества ДНК риса (10; 1; 0,1 нг образцов ДНК генома риса), из расчета три повторения на каждый образец. Системы ПЦР для качественного анализа продемонстрировали ожидаемый уровень робастности и хорошо показали себя при всех трех температурах отжига и трех концентрациях образцов ДНК риса.
_______________
А.5.3.2 Внутрилабораторные испытания
Ген SPS риса был описан как пригодный к использованию в качестве референсного эндогена при идентификации и количественном определении риса (см. [44]). Данные технического характера были уточнены и откорректированы в соответствии с информацией, приведенной в [44].
В процессе пробоподготовки при проведении совместных сличительных испытаний все образцы ДНК были получены GMDL-SJTU по методу СТАВ, описанному в ISO 21571:2005 (раздел А.3). Спектрофотометрическое количественное определение выделенных ДНК осуществлялось в соответствии с методом, описанным в ISO 21571:2005 (раздел В.1). По завершении количественной оценки ДНК проводилась ПЦР с применением качественной системы ПЦР на основе гена 18S (см. [45]) с целью получения данных о возможном ингибировании ПЦР.
Испытания системы ПЦР для анализа гена SPS с применением ДНК генома риса проводились силами трех специалистов GMDL-SJTU. Были получены удовлетворительные результаты; в частности, при проведении ПЦР качественным методом было показано, что ген SPS является специфичным для риса, а значение предела обнаружения составляет приблизительно 0,1%.
А.5.3.3 Выполнение совместных сличительных испытаний
Для целей совместных сличительных испытаний каждому участнику было передано 12 образцов ДНК риса для исследований на гетерогенность, 10 образцов ДНК растений, отличных от риса, для исследований на видовую специфичность и 10 последовательно разведенных рисовых образцов для оценки предела обнаружения. Предусмотрены были также положительные и отрицательные контроли.
Гетерогенность гена SPS у селекционных сортов риса оценивалась на примере 12 возделываемых в Китае сортов этой культуры, различных по географическому и филогенетическому происхождению, таких как Najing14, Taibei309, Shengnong265, Jinyinbao, Minghui78, Huke3, Guangluai4, Zhe733, Hejiang19, Baizhehu, Xiangwanxian9 и Nipponbare. Данные, представленные 12 лабораториями, свидетельствуют, что из всех 144 (12х12) образцов ДНК риса, исследованных с применением системы ПЦР для анализа гена SPS, 143 дали положительные результаты. Это означает, что доля ложноотрицательных заключений при использовании системы ПЦР для анализа гена SPS составляет 0,69% (1/144) (см. таблицу А.14). Отсюда следует сделать вывод, что в целевом регионе ген SPS имеет низкую гетерогенность.
Видовая специфичность гена SPS подтверждалась путем сравнения образца ДНК генома риса (Guangluai4) и ДНК 10 других видов, полученной из плодовых частей растений, эволюционно близких к рису, распространенных сельскохозяйственных культур или модельных растений, таких как бамбук (род Phyllostachys), щетинник зеленый (Setaria viridis (L.) Beauv.), ячмень (Hordeum vulgare), пшеница (Triticum aestivum), просо итальянское (Setaria italica), рапс (Brassica napus), томаты (Lycopersicon esculentum), картофель (Solanum tuberosum), соя (Glycine max) и резуховидка Таля (Arabidopsis thaliana). Данные, представленные 12 лабораториями, свидетельствуют, что из всех 120 (10х12) образцов ДНК растений, отличных от риса, исследованных с применением системы ПЦР для анализа гена SPS, 118 дали отрицательные результаты. Это означает, что доля ложноположительных заключений при использовании системы ПЦР для анализа гена SPS на материале 10 других видов растений составила 1,67% (2/120) (см. таблицу А.14). Отсюда следует сделать вывод, что ген SPS является видоспецифичным для определения риса.
Таблица А.14 - Результаты испытаний на гетерогенность и специфичность с применением качественного метода ПЦР
Параметр (сличительные испытания 2007 г.) | Значение |
Количество лабораторий | 12 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 12 |
Количество образцов на лабораторию | 22 |
Количество принятых результатов | 264 |
Количество образцов, содержащих рис | 144 |
Количество образцов, не содержащих рис | 120 |
Ложноположительные результаты | 2 (1,67%) |
Ложноотрицательные результаты | 1 (0,69%) |
Предел обнаружения системы ПЦР для анализа гена SPS был подтвержден с использованием смесовой муки, в которой содержались кукуруза и различные количества риса, определяемые на основе качественного метода ПЦР: все 12 лабораторий смогли выявить ген SPS в образце ДНК, выделенном из смесовой муки с содержанием риса 0,1% или более высоким, и лишь двум лабораториям из 12 удалось выявить его в смесовой муке с массовым содержанием риса 0,01%. Эти данные указывают на то, что предел обнаружения системы ПЦР, предназначенной для анализа гена SPS, следует принять равным 0,1% массовой доли продукта (см. таблицу А.15).
Таблица А.15 - Результаты контроля предела обнаружения для качественного метода ПЦР
Параметр (сличительные испытания 2007 г.) | Массовое отношение риса и кукурузы  | ||||
| 10% | 1% | 0,1% | 0,05% | 0,01% |
Количество лабораторий | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Количество образцов из расчета на лабораторию | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
Количество лабораторий с принятыми результатами | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Положительные результаты | 12 (100%) | 12 (100%) | 12 (100%) | 4 (33,33%) | 2 (16,67%) |
А.5.3.4 Молекулярная селективность
А.5.3.4.1 Общие положения
Для подтверждения специфичности гена SPS для риса качественным методом был выбран фрагмент консервативного участка гена SPS размером 279 п.н., амплицифированный с применением соответствующих праймеров.
А.5.3.4.2 Экспериментальная часть
Образцы ДНК, выделенные из 11 различных растительных продуктов (включая рис), подверглись исследованию с применением системы ПЦР для анализа гена SPS в установленном порядке (см. [44]). Положительные результаты в группе из 11 образцов были получены только для образца риса. Остальные 10 образцов (см. А.5.3.3) дали отрицательные результаты.
Образцы ДНК, выделенные из 12 различных селекционных сортов риса, подверглись исследованию с применением системы ПЦР для анализа гена SPS, как описано в [44]. Все 12 образцов дали положительные результаты.
А.5.3.4.3 Теоретическая часть
Теоретическая специфичность праймера гена SPS оценивалась путем поиска гомологических последовательностей с использованием программы BLASTN 2.0MP-WashU (см. [82], дата поиска: 2010-01-09). Искомая последовательность размером 279 п.н. представлена в базе данных NCBI как часть последовательности с идентификатором U33175 (нуклеотиды 1055-1333). Результаты применения программы BLAST (basic local alignment search tool - средство поиска основного локального выравнивания) показали полную идентичность искомой последовательности и последовательности SPS-гена риса, а также отсутствие гомологии с другими генами и видами.
А.5.4 Принцип и выводы
Данный метод представляет собой процедуру ПЦР-анализа с целью определения пригодности гена SPS для использования в качестве эндогена при качественном выявлении генетически модифицированного или генетически не модифицированного риса. Гетерогенность и видовая специфичность гена SPS, а также соответствующий предел обнаружения были подвергнуты оценке в рамках метрологической аттестации метода. Визуализация продукта ПЦР размером 279 п.н. осуществлялась путем электрофореза в агарозном геле.
А.5.5 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения согласно ISO 5725-1 [40] и ISO 24276.
А.5.6 Типы и количество образцов
Далее в качестве примера представлены данные сличительных испытаний по типам образцов и их количеству, достаточному для реализации описываемого метода.
Образцы ДНК, использовавшиеся в ходе сличительных испытаний, были выделены из семян 12 селекционных сортов риса, из 10 других растительных материалов (см. А.5.3.3), а также из смесовой муки, содержащей различные массовые доли риса и кукурузы.
Участники получили в свое распоряжение следующие образцы:
- 12 образцов ДНК, выделенных из 12 различных селекционных сортов риса, широко возделываемых в различных регионах Китая (Najing14, Taibei309, Shengnong265, Jinyinbao, Minghui78, Huke3, Guangluai4, Zhe733, Hejiang19, Baizhehu, Xiangwanxian9, и Nipponbare), концентрацией 20 нг/мкл, объемом 50 мкл каждый. Эти образцы ДНК были предназначены для подтверждения гетерогенности гена SPS у селекционных сортов риса;
- 11 образцов ДНК риса (Guangluai4) и 10 образцов ДНК других растительных материалов, родственных рису (т.е. бамбука, щетинника зеленого, ячменя, пшеницы, проса итальянского), распространенных генетически модифицированных культур (т.е. рапса, томатов, картофеля и сои) или модельных растений (т.е. резуховидки Таля) концентрацией 20 нг/мкл, объемом 50 мкл каждый. Эти образцы ДНК были предназначены для подтверждения видовой специфичности SPS-гена риса;
- 10 образцов ДНК из смесовой муки, содержащей кукурузу и различные массовые доли риса, концентрацией 20 нг/мкл, объемом 50 мкл каждый. Эти образцы ДНК представляли собой двойные слепые репликации серии из пяти концентраций риса и служили для контроля предела обнаружения системы ПЦР, предназначенной для анализа SPS-гена;
- отрицательная контрольная проба для целевой ДНК (обозначается как N): ДНК из молок лососевых рыб (20 нг/мкл);
- положительная контрольная проба для целевой ДНК (обозначается как Р): ДНК генома риса (Guangluai4) (20 нг/мкл). Все образцы ДНК были подвергнуты очистке в соответствии с методом СТАВ, применяемым GMDL-SJTU. Отрицательные и положительные результаты контроля использовались для каждого ПЦР-планшета;
- реактивы, праймеры, применяемые в системе ПЦР для анализа гена SPS, а именно:
- пара праймеров для стандартной ПЦР: SPS-F/SPS-R;
- разбавляющий раствор для ДНК (0,1x трис-ЭДТА, 1,2 мл).
А.5.7 Предел обнаружения и диапазон применения
ДНК выделялась из пяти образцов смесовой муки, содержащих разное количество риса. Эти образцы исследовались при помощи описанной системы ПЦР для анализа гена SPS (см. [44]). Положительные результаты были получены на образцах, содержащих по массе 10%, 1% и 0,1% риса соответственно. Два других образца (с массовой долей 0,05% и 0,01%) дали отрицательные результаты.
Таким образом, для разработанного метода относительный предел обнаружения при использовании качественного метода ПЦР соответствует массовой доле 0,1%. Система ПЦР для анализа гена SPS может быть использована для специфичного выявления и идентификации рисовых примесей в других растительных материалах.
А.5.8 Расчет неопределенности измерения
Оценка воспроизводимости метода дается исходя из результатов сличительных испытаний (см. А.5.3.3).
А.5.9 Помехи
В ходе проведенных исследований не было получено дополнительной информации о возможных помехах.
А.5.10 Физические условия и условия окружающей среды
Подробнее см. в ISO 24276. В частности:
- должно обеспечиваться строгое разделение рабочих зон для подготовки ДНК, проведения ПЦР, амплификации и электрофореза;
- перед повторным использованием оборудования с него должны удаляться все остаточные следы ДНК;
- во избежание загрязнения для пипеток должны использоваться аэрозольустойчивые наконечники с фильтром;
- должны использоваться неопудренные перчатки и должна обеспечиваться их частая смена.
А.5.11 Инструменты и оборудование
А.5.11.1 Микроцентрифуга.
А.5.11.2 Морозильник, обеспечивающий температуру минус 20°С, и холодильник, обеспечивающий температуру 4°С.
А.5.11.3 Микропипетки.
А.5.11.4 Мешалка, например вихревая.
А.5.11.5 Пробирки для микроцентрифуги вместимостью 0,2; 1,5 и 2,0 мл.
А.5.11.6 Наконечники, в том числе с защитой от аэрозолей, для микропипеток.
А.5.11.7 Штатив для реакционных пробирок.
А.5.11.8 Перчатки, ПВХ или латексные.
А.5.11.9 Оборудование для амплификации ДНК (термоблок или аналогичное устройство).
А.5.11.10 Оборудование для электрофореза с блоком питания.
А.5.11.11 Система визуализации для гелевого анализа.
А.5.11.12 Микроволновая печь (не обязательно).
А.5.12 Реактивы и материалы
А.5.12.1 Общие положения
Если не указано иное, использовались только реактивы, отвечающие требованиям ISO 24276, и только вода категории "для молекулярной биологии" или сопоставимой степени чистоты.
А.5.12.2 Качественный метод ПЦР
А.5.12.2.3 Раствор dNTP, 2,5 ммоль/л.
А.5.12.2.4 Праймер (см. таблицу А.16).
А.5.12.2.5 Полимераза ДНК термостабильная.
А.5.12.3 Электрофорез
Подробнее см. в ISO 21571:2005 (раздел В.1).
А.5.12.3.1 Загрузочный буфер (10 г/л натрия додецил сульфата, 500 г/л глицерина, 0,5 г/л бромфенолового синего), 10x.
А.5.12.3.2 Размерный стандарт ДНК.
А.5.13 Отбор, транспортировка, консервация и хранение образцов
Растворы ДНК могут храниться при температуре 4°С в течение не более чем 1 нед или при температуре минус 20°С в течение более длительного времени.
А.5.14 Подготовка испытуемого образца
Репрезентативность испытуемого образца по отношению к лабораторному образцу может обеспечиваться, например, путем размола или гомогенизации. Порядок выполнения измерений и пошаговые процедуры, которым необходимо следовать, описаны в ISO 21571 и ISO 24276.
А.5.15 Калибровка приборов
Используемые приборы, например амплификаторы и пипетки, должны калиброваться, как указано в ISO/IEC 17025 [41].
А.5.16 Этапы проведения анализа
А.5.16.1 Подготовка ДНК для проведения ПЦР качественным методом
ДНК выделяют из образцов в соответствии с подходящим методом экстрагирования, например методом СТАВ, описанным в ISO 21571:2005 (раздел А.3). Перед проведением ПЦР образцы ДНК оттаивают, осторожно перемешивают и обрабатывают в центрифуге. Размороженные реактивы сохраняют на льду при температуре от 1°С до 4°С.
А.5.16.2 Реактивы для ПЦР
А.5.16.2.1 Реакционная смесь для стандартной ПЦР
А.5.16.2.2 Праймеры
См. таблицу А.16.
Таблица А.16 - Олигонуклеотидные последовательности праймеров для проведения ПЦР качественным методом
Название | Олигонуклеотидные последовательности ДНК (5’-3’) |
Последовательности праймеров для проведения ПЦР качественным методом | |
SPS-праймер F | TTg CgC CTg AAc ggA TAT |
SPS-праймер R | ggA gAA gCA CTg gAC gAgg |
А.5.16.3 Процедура анализа
А.5.16.3.1 Общие положения
Качественный метод ПЦР для гена SPS риса рассчитан на общий объем смеси 30 мкл из расчета на одну реакцию. Рекомендуется использовать 100 нг матричной ДНК на каждую реакционную лунку.
Перед проведением ПЦР исходную реакционную смесь оттаивают, осторожно перемешивают и обрабатывают в центрифуге. Размороженные реактивы сохраняют на льду при температуре от 1°С до 4°С.
Осторожно перемешивают содержимое пробирок для ПЦР и обрабатывают их в микроцентрифуге при 1000g в течение 10 с.
Устанавливают планшет в амплификатор.
Запускают программу ПЦР в режиме качественного анализа.
А.5.16.4 Контроли ПЦР
См. 7.5 и ISO 24276.
А.5.16.5 Программа "температура - время"
_______________
Таблица А.17 - Программа для проведения ПЦР качественным методом
Шаг | Этап | Температура, °С | Время | Количество циклов | |
1 | Активация и начальная денатурация | 94 | 900 | 1х | |
2a | Амплификация | Денатурация | 94 | 30 | 35x |
2b |
| Отжиг | 58 | 30 |
|
2c |
| Элонгация | 72 | 30 |
|
3 | Окончательная элонгация | 72 | 420 | 1х | |
А.5.16.6 Обнаружение
По завершении программы ПЦР помещают по 3 мкл 10x загрузочного буфера в каждую реакционную пробирку и смешивают с продуктами ПЦР.
Наносят по 10 мкл каждого продукта ПЦР на гель для электрофореза (20 г/л агарозы, 0,5 мкг/мл бромистого этидия).
Обрабатывают гель в оборудовании для электрофореза при 5 В/см в течение 20 мин.
Фиксируют результаты разделения в геле с помощью средств УФ-визуализации или аналогичной системы.
Искомым продуктом является фрагмент размером 279 п.н.; все остальные полосы, наблюдаемые при электрофорезе в агарозном геле, относятся к побочным продуктам.
А.5.16.7 Критерии приемки или отбраковки
Для оценки результатов сличительных испытаний применяются следующие требования к эффективности метода.
Фрагмент размером 279 п.н. должен быть выявлен в положительной контрольной пробе для риса (образец Р), при этом целевой фрагмент не должен обнаруживаться в отрицательной контрольной пробе (образец N) и холостой пробе. Выявление фрагментов размером 279 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК SPS, таким образом, результат признается положительным, в противном случае результат признается отрицательным.
А.5.17 Идентификация образцов
Все образцы должны быть четко идентифицированы.
А.5.18 Интерпретация и расчет результатов
Ожидаемая длина ампликона SPS составляет 279 п.н.
Фрагмент размером 279 п.н. должен быть выявлен в контрольной пробе для риса (образец Р), при этом целевой фрагмент не должен обнаруживаться в отрицательной контрольной пробе (образец N) и холостой пробе. Выявление фрагментов размером 279 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК SPS, таким образом, результат признается положительным, в противном случае результат признается отрицательным.
А.6 Метод, специфичный к целевому таксону, для определения ДНК, полученных из томатов
А.6.1 Назначение, важность и научное обоснование
Ген LAT52 кодирует устойчивый к нагреванию гликозилированный цистеин-богатый белок, необходимый для образования пыльцы у томатов. Доказано, что система обнаружения LAT52 в качестве видоспецифичного гена может быть использована для идентификации и количественного определения генетически модифицированных томатов (см. [46]). Лабораторией по выявлению ГМО при Шанхайском университете Джао Тонг (GMDL-SJTU) были организованы совместные сличительные испытания, посвященные оценке применимости гена томатов LAT52 как видоспецифичного для качественного анализа генетически модифицированных (ГМ) или генетически не модифицированных томатов. В указанном исследовании приняли участие 13 лабораторий из США, Сингапура, Кореи, Литвы, Словении, Норвегии, Италии и Китая (см. [47]). Результаты представлены в таблицах А.18 и А.19.
Рабочий процесс совместных сличительных испытаний включал в себя следующие этапы:
a) ПЦР, проводимую качественным методом для подтверждения гетерогенности гена LAT52 у селекционных сортов томатов, различных по своему географическому и филогенетическому происхождению;
b) ПЦР, проводимую качественным методом для подтверждения видоспецифичности гена LAT52 для томатов;
c) ПЦР, проводимую качественным методом для оценки предела обнаружения осуществляемого качественным методом ПЦР-анализа LAT52.
Совместные сличительные испытания проводились в соответствии со следующими признаваемыми международными руководствами:
ISO 5725-2 [39], в особенности что касается требований к мере прецизионности (т.е. повторяемости и воспроизводимости) и правильности;
протоколом IUPAC, посвященным планированию, проведению и интерпретации результатов исследований с целью оценки эффективности метода (см. [48]).
А.6.2 Принцип
Данный метод описывает порядок обнаружения ДНК томатов средствами качественной ПЦР.
Метод был оптимизирован для использования с семенами томатов, плодами томатов, томатным кетчупом, томатным соком и другими переработанными продуктами, получаемыми из томатов.
Применимость гена LAT52 в рамках данных совместных сличительных испытаний оценивалась с использованием образцов ДНК, выделенных из семян томатов и других растительных материалов.
А.6.3 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
А.6.3.1 Робастность метода
Робастность проверялась разработчиком метода на системе ПЦР для качественного анализа гена LAT52 при трех различных значениях температуры отжига (56°С, 58°С и 60°С), с тремя различными образцами ДНК, содержащими известные количества ДНК из семян томатов (10; 1; 0,1 нг образцов ДНК генома томатов, из расчета три повторения на каждый образец). Системы ПЦР для качественного анализа продемонстрировали ожидаемый уровень робастности и показали себя удовлетворительно при всех трех температурах отжига и трех концентрациях образцов ДНК томатов.
_______________
А.6.3.2 Внутрилабораторные испытания
Ген томатов LAT52 был признан пригодным к использованию в качестве видоспецифичного гена при идентификации и количественном определении генетически модифицированных томатов (см. [46]). Данные технического характера были уточнены и откорректированы в соответствии с информацией в документе по ссылке [46].
В процессе пробоподготовки в целях метрологической аттестации образцы ДНК выделялись GMDL-SJTU по методу СТАВ, описанному в ISO 21571:2005 (раздел А.3). Спектрометрическое определение общего количества выделенной ДНК осуществлялось по методу, описанному в ISO 21571:2005 (раздел В.1). По завершении количественной оценки ДНК выполнялась ПЦР с применением качественного метода ПЦР на основе гена 18S с целью получения данных о возможном ингибировании ПЦР.
Система ПЦР для анализа гена LAT52 была испытана в GMDL-SJTU при участии трех операторов с использованием ДНК генома томатов и обеспечила получение удовлетворительных и непротиворечивых результатов; в частности, для ПЦР, выполняемой качественным методом, результаты показали, что ген LAT52 является специфическим для томатов и что относительный предел обнаружения соответствует массовой доле, не превышающей 0,1%.
А.6.3.3 Совместные сличительные испытания
Гетерогенность гена LAT52 у селекционных сортов томатов оценивалась на примере 12 возделываемых в Китае сортов этой культуры, таких как Shengnong2, Jifan4, Zhongsu5, Yashu6, Jiafen1, Shenfeng2, Hongza9, R144, Nongyou30, Dongnong704, Lichun и Zaokui. Данные, представленные 13 лабораториями, свидетельствуют, что из всех 156 (12х13) образцов ДНК томатов, исследованных с применением системы ПЦР для анализа гена LAT52, 155 дали положительные результаты. Это означает, что доля ложноотрицательных заключений при использовании системы ПЦР для анализа гена LAT52 составляет 0,64% (1/156) (см. таблицу А.18). Отсюда следует сделать вывод, что ген LAT52 имеет низкую гетерогенность у селекционных сортов томатов, возделываемых в Китае.
Видовая специфичность гена LAT52 подтверждалась путем сравнения образца ДНК генома томатов (Jiafen1) и ДНК 10 других видов, полученной из плодовых частей растений, эволюционно близких к томатам, распространенных генетически модифицированных сельскохозяйственных культур или модельных растений, таких как баклажан (Solanum melongena), картофель (Solanum tuberosum), сладкий перец (Capsicum annuum), кукуруза (Zea mays), соевые бобы (Glycine max), рапс (Brassica rapa), рис (Oryza sativa), а также из листьев петунии (Petunia hybrida), табака (Nicotiana tabacum) и резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana). Данные, представленные 13 лабораториями, свидетельствуют, что из всех 130 (10x13, без учета томатов) образцов ДНК различных растений, исследованных с применением системы ПЦР для анализа гена LAT52, 126 дали положительные результаты. Это означает, что доля ложноположительных заключений при использовании системы ПЦР для анализа гена LAT52 составила 3,08% (4/130) (см. таблицу А.14). Отсюда следует сделать вывод, что ген LAT52 является видоспецифичным для определения томатов.
Таблица А.18 - Результаты проведения ПЦР качественным методом
Параметр (сличительные испытания в 2007 г.) | Значение |
Количество лабораторий | 13 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 13 |
Количество образцов из расчета на лабораторию | 22 |
Количество принятых результатов | 286 |
Количество образцов, содержащих томаты | 156 |
Количество образцов, не содержащих томаты | 130 |
Ложноположительные результаты | 4 (3,08%) |
Ложноотрицательные результаты | 1 (0,64%) |
Предел обнаружения системы ПЦР для анализа гена SPS был подтвержден с использованием смесовой муки, в которой содержались кукуруза и семена томатов, присутствие которых определялось на основе качественного метода ПЦР: все 13 лабораторий справились с выявлением образца ДНК, выделенной из смесовой муки с массовой долей томатов 0,1% или более высокой. Эти данные указывают на то, что предел обнаружения системы ПЦР для анализа гена LAT52 следует принять равным 0,1% массовой доли продукта (см. таблицу А.19).
Таблица А.19 - Результаты контроля предела обнаружения для качественного метода ПЦР
Параметр (сличительные испытания в 2007 г.) | Массовое отношение томатов и кукурузы  | ||||
| 2% | 0,5% | 0,1% | 0,05% | 0,01% |
Количество лабораторий | 13 | 13 | 13 | 13 | 13 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 13 | 13 | 13 | 13 | 13 |
Количество образцов из расчета на лабораторию | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
Количество образцов | 26 | 26 | 26 | 26 | 26 |
Положительные результаты | 25 (96,2%) | 25 (96,2%) | 26 (100%) | 0 (0%) | 2 (15,4%) |
А.6.3.4 Молекулярная селективность
А.6.3.4.1 Общие положения
Метод LAT52 ориентирован на определение гена LAT52, который постоянно присутствует в количестве одной копии на каждый гаплоидный геном в различных селекционных сортах томатов. Специфические праймеры (см. таблицу А.20) амплифицируют фрагмент длиной 92 п.н.
А.6.3.4.2 Экспериментальная часть
Образцы ДНК, выделенные из 11 различных растительных продуктов (включая томаты), были исследованы разработчиком метода с применением соответствующей системы ПЦР для анализа гена LAT52. Из всех 11 образцов только для ДНК томатов были получены положительные результаты. Остальные 10 образцов (см. А.6.3.3) дали отрицательные результаты.
Образцы ДНК, выделенные из 12 различных селекционных сортов томатов, были исследованы разработчиком метода с применением соответствующей системы ПЦР для анализа гена LAT52 (см. А.6.6). Все образцы дали положительные результаты.
А.6.3.4.3 Теоретическая часть
Теоретическая специфичность праймеров LAT52 оценивалась путем поиска гомологических последовательностей с использованием программы BLASTN 2,0MP-WashU (см. [82], дата поиска: 2010-01-20). Искомая последовательность размером 92 п.н. представлена в базе данных NCBI как часть последовательности с идентификатором Х15855 (нуклеотиды 1385-1476). Результаты применения программы BLAST показали полную идентичность искомой последовательности и специфичной для пыльников томатов последовательности гена LAT52, а также отсутствие гомологии данной последовательности с другими генами и видами.
А.6.4 Принцип и выводы
Данный метод представляет собой процедуру ПЦР-анализа, выполняемого качественным методом с целью определения пригодности гена LAT52 для использования в качестве видоспецифичного для томатов гена при качественном выявлении генетически модифицированных или немодифицированных томатов. Обнаружение продукта ПЦР длиной 92 п.н. осуществлялось путем электрофореза в агарозном геле.
А.6.5 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения согласно ISO 5725-1 [40] и ISO 24276.
А.6.6 Типы и количество образцов
Для сличительных испытаний использовались следующие образцы:
- 12 образцов ДНК, выделенных из 12 различных селекционных сортов томатов, широко возделываемых в различных регионах Китая (Shengnong2, Jifan4, Zhongsu5, Yashu6, Jiafen1, Shenfeng2, Hongza9, Nongyou30, R144, Dongnong704, Lichun, и Zaokui), концентрацией 20 нг/мкл, объемом 50 мкл каждый. Эти образцы ДНК служили для подтверждения гетерогенности целевой последовательности LAT52 у селекционных сортов томатов;
- 11 образцов ДНК семян томатов (Jiafen1) и листьев 10 других растительных материалов, родственных томатам (т.е. баклажана, картофеля, петунии и стручкового перца), а также относящихся к широко распространенным генетически модифицированным сельскохозяйственным растениям (т.е. кукурузы, сои, рапса и риса) либо модельным растениям (т.е. табака и кресс-салата), концентрацией 20 нг/мкл, объемом 50 мкл каждый. Эти образцы ДНК служили для подтверждения специфичности метода LAT52;
- 10 образцов ДНК из смесовой муки, содержащей кукурузу и различное количество томатов, концентрацией 20 нг/мкл, объемом 50 мкл каждый. Эти образцы ДНК представляли собой двойные слепые репликации серии из пяти концентраций томатов и служили для контроля предела обнаружения системы ПЦР, предназначенной для анализа гена LAT52.
А.6.7 Предел обнаружения и диапазон применения
Предел обнаружения метода соответствовал приблизительно 0,1% массовой доли томатных продуктов. Метод, основанный на выявлении LAT52, может использоваться для специфичного обнаружения и определения томатных продуктов в образце.
Образцы ДНК, выделенные из пяти разновидностей смесовой муки с различными массовыми долями продуктов из семян томатов, были исследованы с применением системы ПЦР для анализа гена LAT52. Положительные результаты были получены только на образцах муки, содержащих по массе 0,1% томатов или более (т.е. 2%, 0,5% и 0,1% соответственно). Два других образца (с массовой долей 0,05% и 0,01%) дали отрицательные результаты.
А.6.8 Расчет неопределенности измерения
Общая неопределенность метода оценивается исходя из результатов совместных сличительных испытаний (см. А.6.3.3).
А.6.9 Помехи
В ходе проведенных исследований не было представлено дополнительной информации о наблюдаемых помехах.
А.6.10 Физические условия и условия окружающей среды
Подробнее см. в ISO 24276.
А.6.11 Инструменты и оборудование
А.6.11.1 Оборудование для амплификации ДНК (термоблок или аналогичное устройство).
А.6.11.2 Оборудование для электрофореза с блоком питания.
А.6.11.3 Система документирования для гелевого анализа.
А.6.11.4 Микроволновая печь (не обязательно).
А.6.12 Реактивы и материалы
Если не указано иное, использовались только реактивы, отвечающие требованиям ISO 24276, и только вода категории "для молекулярной биологии" или сопоставимой степени чистоты.
А.6.11.3 Реакционная смесь для стандартной ПЦР (см. А.6.16.2).
А.6.12.2 Олигонуклеотиды (см. таблицу А.20).
А.6.12.3 Загрузочный буфер.
А.6.12.4 Электрофорезный буфер.
А.6.12.5 Агароза.
А.6.12.6 Размерный стандарт ДНК.
А.6.13 Отбор, транспортировка, консервация и хранение образцов
Растворы ДНК могут храниться при температуре 4°С в течение не более чем 1 нед или при температуре минус 20°С в течение более длительного времени.
А.6.14 Подготовка испытуемого образца
Репрезентативность испытуемого образца по отношению к лабораторному образцу может обеспечиваться, например, путем размола или гомогенизации. Порядок выполнения измерений и пошаговые процедуры, которым необходимо следовать, описаны в ISO 21571.
Образцы ДНК выделялись GMDL-SJTU по методу СТАВ в соответствии с ISO 21571:2005 (раздел А.3).
А.6.15 Калибровка приборов
Используемые приборы, например амплификаторы и пипетки, подлежат калибровке, в частности, согласно ISO/IEC 17025 [41].
А.6.16 Этапы проведения анализа
А.6.16.1 Подготовка ДНК для проведения ПЦР качественным методом
При выделении ДНК из испытуемого образца должны соблюдаться общие инструкции и меры, описанные в ISO 21571. Рекомендуется выбирать для выделения ДНК методы, представленные в ISO 21571:2005 (приложение А).
А.6.16.2 Реакционная смесь для стандартной ПЦР
Таблица А.20 - Олигонуклеотидные последовательности праймеров для проведения ПЦР качественным методом
Название | Олигонуклеотидные последовательности ДНК (5’-3’) |
LAT52-праймер F | A gAC CAC gAg AAC gAT ATT TgC |
LAT52-праймер R | TT CTT gCC TTT TCA TAT CCAg ACA |
А.6.16.3 Процедура анализа
Данный способ проведения ПЦР рассчитан на общий объем смеси 30 мкл на реакцию. Рекомендуется использовать 100 нг матричной ДНК на реакционную лунку.
Перед проведением стандартной ПЦР исходную реакционную смесь оттаивают, осторожно перемешивают и обрабатывают в центрифуге. Размороженные реактивы сохраняют на льду при температуре от 1°С до 4°С.
Осторожно перемешивают содержимое пробирок для ПЦР и в течение непродолжительного времени обрабатывают их в микроцентрифуге для объединения всех имеющихся капель раствора.
Устанавливают планшет в прибор.
Запускают программу ПЦР для качественного анализа с параметрами, описанными в А.6.16.5.
А.6.16.4 Контроли ПЦР
Положительные и отрицательные контроли должны использоваться в соответствии с ISO 24276.
А.6.16.5 Программа "температура - время"
_______________
Таблица А.21 - Программа для проведения ПЦР качественным методом
Шаг | Этап | Температура, °С | Время | Количество циклов | |
1 | Активация и начальная денатурация | 94 | 900 | 1х | |
2a | Амплификация | Денатурация | 94 | 30 | 35x |
2b |
| Отжиг | 56 | 30 |
|
2c |
| Элонгация | 72 | 30 |
|
3 | Окончательная элонгация | 72 | 420 | 1х | |
А.6.16.6 Обнаружение
По окончании ПЦР помещают по 2 мкл загрузочного буфера в каждую реакционную пробирку и смешивают с продуктами ПЦР.
Наносят по 10 мкл каждого продукта ПЦР на гель для электрофореза (30 г/л агарозы, 0,5 мкг/мл бромистого этидия).
Обрабатывают гель в оборудовании для электрофореза при 5 В/см в течение 20 мин.
Визуализация и фиксация результатов осуществляются с применением соответствующей системы визуализации для гелевого анализа.
Ввиду малой длины ампликона в качестве электрофорезного буфера должна использоваться ТБЭ.
Фрагмент 92 п.н. должен представлять собой специфический продукт; присутствие других фрагментов ДНК свидетельствует о неспецифической амплификации.
А.6.16.7 Критерии приемки или отбраковки
Фрагмент размером 92 п.н. должен быть выявлен в положительной контрольной пробе для томатов (образец Р), при этом продукты ПЦР не должны обнаруживаться в отрицательной контрольной пробе (образец N) и холостой пробе. Выявление фрагментов размером 92 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК LAT52, таким образом, результат признается положительным, в противном случае результат признается отрицательным.
А.6.17 Идентификация образцов
Образцы должны четко идентифицироваться по признаку "обнаружено - не обнаружено".
А.6.18 Интерпретация и расчет результатов
Выявление фрагментов размером 92 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК LAT52, таким образом, результат записывается как "обнаружено", в противном случае результат записывается как "не обнаружено".
Наличие продукта ПЦР длиной 92 п.н. может быть проверено аналитически путем секвенирования ДНК.
Разделы А.5, А.6 (Введены дополнительно, Изм. N 1).
Приложение В
(справочное)
Методы скрининга
В.1 Метод скрининга для обнаружения ДНК генетически модифицированных растений (промотор 35S вируса мозаики цветной капусты)
В.1.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения различного количества копий последовательности ДНК промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Так как промотор 35S присутствует во многих генетически модифицированных растениях, этот метод может быть использован для скрининга наличия ДНК из генетически модифицированного растения [22], [23].
В.1.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.1.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод был метрологически аттестован в нескольких совместных сличительных испытаниях с использованием различных материалов пищевых продуктов (как сырье, так и переработанные продукты) [24], [25].
Этот метод был метрологически аттестован в совместном сличительном испытании [24], проведенном под руководством рабочей группы "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV). Количество участников, а также количество образцов устанавливали в соответствии с критериями ISO 5725-2. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3 (однако вес анализируемой части образца составлял 100 мг).
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице В.1.
Таблица В.1 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1999 |
Количество лабораторий | 27 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 23 |
Количество образцов на лабораторию | 5 |
Количество принятых результатов | 115 |
Количество образцов, содержащих сою линии GTS 40-3-2 | 59 |
Количество образцов, содержащих немодифицированную сою | 56 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
В.1.2.2 Молекулярная специфичность
В.1.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевой последовательности, описанной, например, в базе данных GenBank®, доступ N V00141.
Список генетически модифицированных растений, содержащих промотор 35S CaMV, приводится в приложении к ссылке [24].
Не исключается возможность получения ложноположительных результатов из-за того, что амплифицируемая последовательность получена из вируса мозаики цветной капусты, поражающего цветную капусту, а также другие растения семейств Brassicaceae (Cruciferae), а также Resedaceae и Solanaceае [26], [27].
В связи с этим следует с особенной тщательностью рассматривать положительные результаты, полученные при анализе образцов из растений семейств Brassicaceae, Resedaceae и Solanaceae.
Положительные результаты могут означать наличие продукта, полученного из генетически модифицированных растений, однако не могут быть интерпретированы как доказательство наличия генетически модифицированного продукта без дополнительного подтверждения.
Для того чтобы различить инфицирование вирусом и генетическую модификацию, можно использовать методы обнаружения вируса мозаики цветной капусты [6].
В.1.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (NCBI BlastN®, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), по состоянию на 28 сентября 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированными сельскохозяйственными растениями. Однако оба праймера совпадали с одним доступом базы данных, не относящимся ни к вирусу мозаики цветной капусты, ни к рекомбинантным векторам или патентам: S70105 ср (белок оболочки) вируса мозаики огурцов. Кроме того, праймеры соответствовали более чем 100 позициям базы данных, относящимся к вирусу мозаики цветной капусты и рекомбинантным векторам и патентам.
В.1.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированных сельскохозяйственных растений в отсутствие вируса мозаики цветной капусты, не наблюдали амплификации [22], [24], [25], [28].
Успешная амплификация была обнаружена при проведении ПЦР на ДНК, выделенной из различных генетически модифицированных растений, например GTS-40-3-2 (соевые бобы RoundUp Ready®), линий кукурузы Event 176 (Bt 176), Bt 11, MON 810, MON 809, а также томатов с замедленным созреванием (Zeneca) [22], [24], [25], [28].
Количество копий последовательности ДНК может варьироваться.
В.1.2.3 Предел обнаружения
Не был определен абсолютный предел обнаружения. Был показан относительный предел обнаружения, составляющий 0,1% генетически модифицированной сои в соевой муке IRMM-410 и 0,1% генетически модифицированной кукурузы Event 176 (Bt 176) IRMM-411 в кукурузной муке (массовая фракция) (сертифицированные образцы стандартного состава) [25].
В.1.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
В.1.4 Принцип
Принцип метода заключается в амплификации фрагмента ДНК длиной 195 пн из промотора 35S вируса мозаики цветной капусты с использованием ПЦР и обнаружением после разделения с помощью электрофореза в агарозном геле. Для проверки специфичности продукта ПЦР следует выполнить этап подтверждения.
Промоторы - это последовательности распознавания или связывающие последовательности для РНК-полимераз, которые отвечают за экспрессию генов. Промотор 35S из вируса мозаики цветной капусты наиболее часто используется при генетической модификации растений [24].
В.1.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
В.1.5.1 Вода
В.1.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
В.1.5.5 Олигонуклеотиды
В.1.5.5.1 Прямой праймер
Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, 35s-1: [24], [28] 5’-gCT ССТ АСА ААТ gCC АТС А-3’.
Подобран вместе с соответствующим обратным праймером для амплификации последовательностей, описанных, например, в позиции N V00141.
В.1.5.5.2 Обратный праймер
Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, 35s-2: [24], [28] 5’-gAT AgT ggg ATT gTg CgT CA-3’.
Подобран вместе с соответствующим прямым праймером для амплификации последовательностей, описанных, например, в позиции N V00141.
В.1.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
В.1.5.7 Рестриктаза: Xmn I (= Asp 700).
В.1.6 Оборудование
В.1.6.1 Амплификатор
В.1.6.2 Камера для электрофореза, с источником питания.
В.1.7 Процедура анализа (проведение ПЦР)
В.1.7.1 Общие положения
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице В.2. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице В.2.
Таблица В.2 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 1 |
Вода |
| 15,9 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,8 ммоль/л | 2 |
Праймер 35s-1, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
Праймер 35s-2, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 0,5 IU | 0,1 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 1,5 ммоль/л. | ||
В.1.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава GTS 40-3-2 (материал, содержащий 0,1% компонентов генетически модифицированных растений), производимые Институтом референсных материалов и измерений (IRMM), Гиль, Бельгия (IRMM-410).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли, согласно описанию в ISO 24276.
В.1.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица В.3 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 20 с/ 94°С |
| 40 с/ 54°С |
| 60 с/ 72°С |
Количество циклов | 40 |
Завершающая полимеризация | 3 мин/72°С |
В.1.8 Специфичность продукта ПЦР
Проверка специфичности продукта ПЦР может быть выполнена с помощью его рестрикционного анализа рестриктазой Xmn I. В результате такой рестрикции ожидается получение двух фрагментов (длиной 115 и 80 п.н.) [22], [24].
В.1.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных образцов стандартного состава (приготовленных, например, из серии стандартов IRMM-410 (соя линии GTS 40-3-2) производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в В.1.8.
Обнаружение фрагментов с размером 195 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК из вируса мозаики цветной капусты или из генетически модифицированного растения в пределах установленных параметров специфичности, описанных в В.1.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
В.2 Альтернативный метод скрининга для обнаружения ДНК генетически модифицированных растений (промотор 35S вируса мозаики цветной капусты)
В.2.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения различного количества копий последовательности ДНК промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) в образцах продуктов, прошедших переработку. Так как промотор 35S присутствует во многих генетически модифицированных растениях, этот метод может быть использован для скрининга наличия ДНК из генетически модифицированного растения [22], [23], [29].
Не описан способ проверки специфичности ПЦР-продукта. Поэтому этот метод не может рассматриваться как метод идентификации. Он может быть использован для оценки амплифицируемости ДНК, содержащей целевую последовательность.
В.2.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.2.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод прошел метрологическую аттестацию в соответствии с критериями, заданными ISO 5725-2. В совместных сличительных испытаниях, координируемых объединенным центром исследований ЕС JRC, участвовали 23 европейские лаборатории [29], [30]. Оценивали способность метода обнаруживать ГМО в различных материалах образцов переработанной пищевой продукции (готовые продукты из кукурузы, детское питание, печенье, продукты из квашеных соевых бобов), каждый из которых содержал 0%, 2% и 100% (для печенья использовали 10% вместо 100%) сои линии GTS-40-3-2 или кукурузы Event 176. Каждый участник получал 4 контрольных образца и 30 образцов неизвестного состава в независимых повторностях, из которых 10 содержали 0% ГМО, а 20 - ингредиенты с различным процентом содержания генетических модификаций. Все участники получили подробное описание метода выделения ДНК с помощью методики ЦТАБ или коммерчески доступного набора для выделения. Однако лаборатории имели право использовать их собственные методы выделения ДНК; в то же время условия ПЦР должны были быть оптимизированы индивидуально для имеющегося у участников оборудования. От лабораторий требовали провести анализ каждого образца один раз и определить, содержит ли образец ГМО или нет. Так как большинство лабораторий предоставили правильные результаты (результаты 14 лабораторий попали в диапазон от 90% до 100% от истинного значения; результаты 3 лабораторий - от 80% до 90% от истинного значения) и ни одна лаборатория не предоставила правильные результаты в диапазоне от 70% до 80%, было установлено значение среза правильных результатов, равное 80%. Вследствие этого результаты 5 лабораторий были исключены из дальнейшей статистической обработки. Для не содержащих ГМО образцов было определено среднее значение правильных результатов, составившее 96,1% (3,9% ложноположительных результатов); для образцов, содержащих ГМО, было определено среднее значение правильных результатов, равное 98,1% (1,9% ложноотрицательных результатов) [30].
Результаты совместных сличительных испытаний приводятся в таблице В.4.
Таблица В.4 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1999 |
Количество лабораторий | 30 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 18 |
Количество образцов на лабораторию | 12 |
Общее количество образцов | 360 |
Количество принятых результатов | 540 |
Ложноположительные результаты | 3,9% |
Ложноотрицательные результаты | 1,9% |
В.2.2.2 Молекулярная специфичность
В.2.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевой последовательности, описанной, например, в базе данных GenBank®, доступ N V00141. Список генетически модифицированных растений, содержащих промотор 35S CaMV, приводится в ссылках [23] и [24].
Не исключается возможность получения ложноположительных результатов из-за того, что амплифицируемая последовательность получена из вируса мозаики цветной капусты, поражающего цветную капусту, а также другие растения семейств Brassicaceae (Cruciferae), а также Resedaceae и Solanaceае [26], [27].
В связи с этим следует с особенной тщательностью рассматривать положительные результаты, полученные при анализе образцов из растений семейств Brassicaceae, Resedaceae и Solanaceae. Положительные результаты могут означать наличие продукта, полученного из генетически модифицированных растений, однако не могут быть интерпретированы как доказательство наличия генетически модифицированного продукта без дополнительного подтверждения.
Для того чтобы различить инфицирование вирусом и генетическую модификацию, можно использовать методы обнаружения вируса мозаики цветной капусты [6].
В.2.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (NCBI BlastN®, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), по состоянию на 28 сентября 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированными сельскохозяйственными растениями. Праймеры соответствовали значительному количеству позиций базы данных, относящихся к вирусу мозаики цветной капусты и рекомбинантным векторам и патентам.
В.2.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированных соевых бобов в ходе предварительных совместных сличительных исследований, не наблюдали амплификации [29].
В.2.2.3 Предел обнаружения
Для этого метода не был определен абсолютный предел обнаружения, однако была показана способность обнаружения по крайней мере 50 копий ДНК сои линии GTS 40-3-2 [29].
Также не был определен и относительный предел обнаружения, но в ходе совместных сличительных испытаний [28] была показана возможность обнаружения 2% ГМО GTS 40-3-2 (соевые бобы RoundUp Ready®) и/или кукурузы Event 176 (кукуруза Bt 176) в печенье, детском питании и квашеных соевых бобах с 100% правильных результатов [30].
В.2.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
В.2.4 Принцип
Принцип метода заключается в амплификации фрагмента ДНК длиной 123 п.н. из промотора 35S вируса мозаики цветной капусты с использованием ПЦР и обнаружении с помощью электрофореза в агарозном геле. Для проверки специфичности продукта ПЦР можно, например, использовать секвенирование ДНК. Однако ни одна из процедур подтверждения идентичности не прошла метрологической аттестации.
Промоторы - это последовательности распознавания или связывающие последовательности для РНК-полимераз, которые отвечают за экспрессию генов. Промотор 35S из вируса мозаики цветной капусты наиболее часто используется при генетической модификации растений [22].
В.2.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
В.2.5.1 Вода
В.2.5.3 Раствор dNTP, концентрация dNTP=4 ммоль/л (каждого).
В.2.5.4 Олигонуклеотиды
В.2.5.4.1 Прямой праймер
Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, 35s-cf3: 5’-ССА CgT СТТ САА AgC AAg Tgg-3’.
Подобран для амплификации промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, например позиция N V00141.
В.2.5.4.2 Обратный праймер
Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, 35s-cr4: 5’-ТСС ТСТ ССА ААТ gAA ATg ААС ТТС С-3’.
Подобран для амплификации промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, например позиция N V00141.
В.2.5.5 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
В.2.6 Оборудование
В соответствии с описанием в В.1.6.
В.2.7 Процедура анализа
В.2.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице В.5. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице В.5.
Таблица В.5 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца |
| 5 |
Вода |
| 14,84 |
10 буфер для ПЦР (с  15 ммоль/л) | 1 | 2,5 |
Раствор dNTP, 16 ммоль/л | 0,64 ммоль/л | 1 |
Праймер 35s-cf3, 20 мкмоль/л | 0,6 мкмоль/л | 0,75 |
Праймер 35S-cr4, 20 мкмоль/л | 0,6 мкмоль/л | 0,75 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 0,8 IU | 0,16 |
Если используется буферный раствор для ПЦР без , следует соответственно довести концентрации и объемы. | ||
В.2.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава GTS 40-3-2 (материал, содержащий 0,1% компонентов генетически модифицированных растений), производимые Институтом референсных материалов и измерений (IRMM), Гиль, Бельгия (IRMM-410).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
В.2.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица В.6 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 25 с/95°С |
| 30 с/62°С |
| 45 с/72°С |
Количество циклов | 50 |
Завершающая полимеризация | 7 мин/72°С |
В.2.8 Специфичность продукта ПЦР
Рекомендуется проверить специфичность продукта ПЦР, полученного из неизвестного образца путем, например, рестрикционного анализа, секвенирования ДНК и ДНК-гибридизации.
В.2.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных образцов стандартного состава (приготовленных, например, из серии стандартов IRMM-410 производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в В.2.8.
Обнаружение фрагментов с размером 123 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК промотора 35S вируса мозаики цветной капусты в пределах установленных параметров специфичности, описанных в В.2.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
В.3 Метод скрининга для обнаружения ДНК генетически модифицированных растений (терминатор NOS Agrobacterium tumefaciens)
В.3.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения различного количества копий последовательности ДНК терминатора нопалин синтазы (NOS) из Agrobacterium tumefaciens. Так как терминатор NOS присутствует во многих генетически модифицированных растениях, этот метод может быть использован для скрининга наличия ингредиентов, полученных из генетически модифицированных растений [22], [23], [29], [30].
Не описан способ проверки специфичности продукта ПЦР. Поэтому этот метод не может рассматриваться как метод идентификации. Он может быть использован для оценки амплифицируемости ДНК, содержащей целевую последовательность.
В.3.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.3.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод прошел метрологическую аттестацию в соответствии с критериями, заданными ISO 5725-2. В совместных сличительных испытаниях, координируемых объединенным центром исследований ЕС JRC, участвовали 23 европейские лаборатории [29], [30]. Оценивали способность метода обнаруживать ГМО в различных материалах образцов переработанной пищевой продукции (готовые продукты из кукурузы, детское питание, печенья, продукты из квашеных соевых бобов), каждый из которых содержал 0%, 2% и 100% (для печенья использовали 10% вместо 100%) сои линии GTS 40-3-2 или кукурузы Event 176. Так как линия Event 176 не содержит последовательности терминатора NOS, образцы, содержащие компоненты, изготовленные из этой линии, не должны анализироваться этим методом. Однако в связи с тем, что совместные сличительные испытания были организованы для оценки метода обнаружения промотора 35S, лаборатории получили все образцы и провели их анализ. Результаты анализа готовых продуктов из кукурузы были исключены из дальнейшей статистической обработки.
Каждый участник получал 4 контрольных образца и 30 образцов неизвестного состава в независимых повторностях, из которых 10 содержали 0% ГМО, а 20 - ингредиенты с различным процентом содержания генетических модификаций. Все участники получили подробное описание метода выделения ДНК с помощью методики ЦТАБ или коммерчески доступного набора для выделения. Однако лаборатории имели право использовать их собственные методы выделения ДНК; в то же время условия ПЦР должны были быть оптимизированы индивидуально для имеющегося у участников оборудования. От лабораторий требовали провести анализ каждого образца один раз и определить, содержит ли образец ГМО или нет. Так как большинство лабораторий предоставили правильные результаты (результаты 14 лабораторий попали в диапазон от 90% до 100% от истинного значения; результаты 3 лабораторий - от 80% до 90% от истинного значения) и ни одна лаборатория не предоставила правильные результаты в диапазоне от 70% до 80%, было установлено значение нижнего предела правильных результатов, равное 80%. Вследствие этого результаты 5 лабораторий были исключены из дальнейшей статистической обработки. Так как линия Event 176 не содержит последовательности терминатора NOS, результаты анализа готовых продуктов из кукурузы должны быть отрицательными. Эти результаты имели высокий процент (100%) правильных результатов и были исключены из дальнейшей статистической обработки.
Для не содержащих ГМО образцов было определено среднее значение правильных результатов, составившее 98,2% (1,8% ложноположительных результатов); для образцов, содержащих ГМО, было определено среднее значение правильных результатов, равное 97,9% (2,1% ложноотрицательных результатов) [29]. Результаты совместных сличительных испытаний приводятся в таблице В.7.
Таблица В.7 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1999 |
Количество лабораторий | 30 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 18 |
Количество образцов на лабораторию | 12 |
Общее количество образцов | 360 |
Количество принятых результатов | 540 |
Ложноположительные результаты | 1,8% |
Ложноотрицательные результаты | 2,1% |
В.3.2.2 Молекулярная специфичность
В.3.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевой последовательности терминатора нопалин синтазы Agrobacterium tumefaciens, описанной в базе данных GenBank®, доступ N V00087.
Не исключается возможность получения ложноположительных результатов из-за того, что амплифицируемая последовательность получена из Agrobacterium tumefaciens - почвенной бактерии, распространенной в природе. Положительные результаты могут означать наличие компонента, произведенного из генетически модифицированного растения, однако интерпретация результатов не должна проводиться без дополнительного подтверждения. Следует принять в расчет возможность контаминации образца Agrobacterium или родственными микроорганизмами.
В.3.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (NCBI BlastN®, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), по состоянию на 28 сентября 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированными сельскохозяйственными растениями. Следует учесть, что обратный праймер обнаружил 100%-ное совпадение с доступом AF015682 (полимераза вируса рваных листьев риса). Оба праймера соответствовали значительному количеству позиций базы данных, относящихся к векторам клонирования и патентам, а также к нопалин синтазе.
В.3.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированных сельскохозяйственных растений, в ходе предварительных совместных сличительных исследований не наблюдали амплификации [30].
В.3.2.3 Предел обнаружения
Для этого метода не был определен абсолютный предел обнаружения, однако была показана способность обнаружения по крайней мере 50 копий ДНК сои линии GTS 40-3-2 [29].
В ходе совместных сличительных испытаний была показана возможность обнаружения 2% GTS 40-3-2 (соевые бобы RoundUp Ready®) в печенье, детском питании и квашеных соевых бобах с 96,4% правильных результатов [29].
В.3.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
В.3.4 Принцип
Принцип метода заключается в амплификации фрагмента ДНК длиной 118 п.н. из терминатора NOS с использованием ПЦР и обнаружении с помощью электрофореза в агарозном геле. Для проверки специфичности продукта ПЦР можно, например, использовать секвенирование ДНК. Однако ни одна из процедур подтверждения специфичности продукта не прошла метрологической аттестации.
В.3.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
В.3.5.1 Вода
В.3.5.3 Раствор dNTP, концентрация dNTP=4 ммоль/л (каждого).
В.3.5.4 Олигонуклеотиды
В.3.5.4.1 Прямой праймер
Терминатор NOS Agrobacterium tumefaciens, HA-nos118f: 5’-gCA TgA CgT TAT TTA TgA gAT ggg-3’.
Подобран для амплификации последовательности, описанной в доступе N V00087.
В.3.5.4.2 Обратный праймер
Терминатор NOS Agrobacterium tumefaciens, HA-nos118r: 5’-gAC ACC gCg CgC gAT AAT TTA TCC-3’.
Подобран для амплификации последовательности, описанной в доступе N V00087.
В.3.5.5 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
В.3.6 Оборудование
В соответствии с В.1.6.
В.3.7 Процедура анализа (проведение ПЦР)
В.3.7.1 Общие положения
Описанный метод рассчитан на общий объем ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице В.8. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице В.8.
Таблица В.8 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца |
| 5 |
Вода |
| 14,84 |
10 буфер для ПЦР (с 15 ммоль/л) | 1 | 2,5 |
Раствор dNTP, 16 ммоль/л | 0,64 ммоль/л | 1 |
Праймер HA-nos118f, 20 мкмоль/л | 0,6 мкмоль/л | 0,75 |
Праймер HA-nos118r, 20 мкмоль/л | 0,6 мкмоль/л | 0,75 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 0,8 IU | 0,16 |
Если используется буферный раствор для ПЦР без , следует соответственно довести концентрации и объемы. | ||
В.3.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава GTS 40-3-2 (материал, содержащий 0,1% компонентов генетически модифицированных растений), производимые Институтом референсных материалов и измерений (IRMM), Гиль, Бельгия (RMM-410).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
В.3.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица В.9 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 25 с/95°С |
| 30 с/62°С |
| 45 с/72°С |
Количество циклов | 50 |
Завершающая полимеризация | 7 мин/72°С |
В.3.8 Специфичность продукта ПЦР
Рекомендуется проверить идентичность продукта ПЦР, полученного из неизвестного образца путем, например, рестрикционного анализа, секвенирования ДНК и ДНК-гибридизации.
В.3.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных образцов стандартного состава (приготовленных, например, из серии стандартов IRMM-410 производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в В.3.8.
Обнаружение фрагментов с размером 118 п.н. показывает, что раствор образца ДНК содержит амплифицируемую ДНК терминатора NOS в пределах установленных параметров специфичности, описанных в В.3.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
В.4 Метод скрининга для обнаружения ДНК генетически модифицированных растений (ген npt ll)
В.4.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения гена, кодирующего неомицин фосфотрансферазу (npt II). Так как этот ген вставлен в интегральные конструкции большинства генетически модифицированных растений, этот генетический элемент может быть использован для скрининга продуктов, в состав которых входят компоненты из ГМО.
В.4.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.4.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод был метрологически аттестован в совместном сличительном испытании на сырьевых продуктах [24], проведенном под руководством рабочей группы "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV). Количество участников, а также количество образцов устанавливали в соответствии с критериями ISO 5725-2.
Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3 (однако вес анализируемой части образца составлял 100 мг).
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице В.10.
Таблица В.10 - Результаты совместных сличительных испытаний
Образец | Томаты Zeneca |
Праймер | АРН2 short/APH2 reverse |
Год | 1998 |
Количество лабораторий | 10 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 9 |
Количество образцов на лабораторию | 5 |
Количество принятых результатов | 45 |
Количество образцов, содержащих ген неомицин фосфотрансферазы (томаты Zeneca) | 22 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
В.4.2.2 Молекулярная специфичность
В.4.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевой последовательности, описанной в базе данных GenBank®, доступ N AF269238.
Неомицин фосфотрансфераза получена из Е. coli K12 и присутствует в некоторых ГМО.
Ген npt II получен из E.coli K12 и присутствует в некоторых ГМО.
Не исключается возможность получения ложноположительных результатов из-за того, что целевая последовательность получена из Е. coli K12. Положительные результаты не должны служить доказательством наличия компонента, произведенного из генетически модифицированного растения.
В.4.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (NCBI BlastN®, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), по состоянию на 28 сентября 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированными сельскохозяйственными растениями. Праймеры обнаружили совпадение только с транспозоном Tn5, синтетическими и патентованными последовательностями.
B.4.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированных сельскохозяйственных растений и произведенных из них готовых продуктов, не наблюдали амплификации.
В.4.2.3 Предел обнаружения
Метрологическую аттестацию проводили только с образцами, содержащими 0% и 100% ГМО.
В.4.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
В.4.4 Принцип
Принцип метода заключается в амплификации фрагмента ДНК длиной 225 п.н. из последовательности гена неомицин фосфотрансферазы с использованием ПЦР и обнаружением с помощью электрофореза в агарозном геле. Для проверки специфичности продукта ПЦР можно, например, использовать рестрикционный анализ.
Неомицин фосфотрансфераза обеспечивает бактериям устойчивость к антибиотикам - неомицину/канамицину; ген добавляют в конструкции только в качестве маркера.
В.4.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
В.4.5.1 Вода
В.4.5.3 Раствор dNTP, концентрация dNTP = 2,5 ммоль/л (каждого).
В.4.5.4 Олигонуклеотиды
В.4.5.4.1 Прямой праймер
АРН2 short: 5’-СТС АСС TTg СТС CTg CCg AgA-3’.
В.4.5.4.2 Обратный праймер
АРН2 reverse: 5’-CgC СТТ gAg ССТ ggC gAA CAg-3’.
В.4.5.5 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
В.4.5.6 Рестриктаза: Rsa I
В.4.6 Оборудование
В соответствии с описанием в В.1.6.
В.4.7 Процедура анализа (проведение ПЦР)
В.4.7.1 Общие положения
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице В.11. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице В.11.
Таблица В.11 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца |
| 5 |
Вода |
| 14,6 |
10 буфер для ПЦР (с 15 ммоль/л) | 1 | 2,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,2 ммоль/л | 0,5 |
Праймер АРН2 short, 10 мкмоль/л | 0,4 мкмоль/л | 1 |
Праймер АРН2 reverse, 10 мкмоль/л | 0,4 мкмоль/л | 1 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 2 IU | 0,4 |
В.4.7.2 Контроли ПЦР
_______________
В.4.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица В.12 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 25 с/95°С |
| 30 с/60°С |
| 45 с/72°С |
Количество циклов | 35 |
Завершающая полимеризация | 7 мин/72°С |
В.4.8 Специфичность продукта ПЦР
Рекомендуется проверить идентичность продукта ПЦР, полученного из неизвестного образца путем, например, рестрикционного анализа, секвенирования ДНК и ДНК-гибридизации. Рестрикция продукта ПЦР ферментом Rsa I должна привести к образованию двух фрагментов (длиной 122 и 93 п.н. соответственно) [24].
В.4.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из соответствующих референсных материалов (например, коммерческих плазмид, содержащих целевую последовательность ДНК).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в В.4.8.
Обнаружение фрагментов с размером 215 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК гена npt II в пределах установленных параметров специфичности, описанных в В.4.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
В.5 Метод скрининга для обнаружения ДНК, выделенной из генетически модифицированных томатов (Zeneca® 282F)
Метод подробно описан в А.3.
В.6 Метод скрининга на основе ПЦР-анализа в реальном времени для обнаружения ДНК генетически модифицированных растений (терминатор NOS Agrobacterium tumefaciens, T-nos)
В.6.1 Назначение, важность и научное обоснование
Испытания на наличие последовательности Agrobacterium tumefaciens T-nos обычно проводятся при скрининге для обнаружения продуктов, в состав которых входят компоненты из генетически модифицированных организмов (ГМО), поскольку многие такие организмы, используемые в коммерческих целях, содержат данный генетический элемент. Поиск в базе данных CERA (см. [50]) дает по крайней мере 43 генетические модификации, содержащие элемент T-nos (см. [51]). Подробная техническая информация, касающаяся использования ПЦР в реальном времени для анализа T-nos качественным методом, и результаты совместных сличительных испытаний были соответствующим образом опубликованы (см. [52]). В указанном исследовании приняли участие 24 лаборатории из Германии, Австрии и Швейцарии. Исследование было спланировано и проведено согласно протоколу IUPAC (см. [48]) на материале 12 слепых образцов ДНК с целевой анализируемой последовательностью T-nos, представленной на двух различных уровнях (шестью образцами с массовой долей ДНК кукурузы NK603 0,5% и шестью с массовой долей 0,1%), а также шести слепых образцов ДНК без целевой последовательности T-nos (шести образцов ДНК генетически не модифицированных сортов кукурузы). Результаты совместных сличительных испытаний для целевой последовательности T-nos были использованы для определения доли ложноположительных и ложноотрицательных заключений. В дополнение к этому были опубликованы подтверждающие данные по специфичности и применимости соответствующих методов на практике при выполнении скрининга для обнаружения растительной продукции из генетически модифицированных сельскохозяйственных культур (см. [53]).
В.6.2 Принцип
Данный метод описывает порядок обнаружения последовательности ДНК из области терминатора гена нопалин-синтазы (T-nos) Agrobacterium tumefaciens с применением качественной ПЦР в реальном времени. T-nos используется как регулирующий элемент во многих генетически модифицированных растениях, что делает данный метод пригодным для скрининга с целью выявления растительной продукции из генетически модифицированных сельскохозяйственных культур. Он может использоваться для анализа ДНК, выделяемой из пищевых продуктов, а также из иного рода продукции (кормов, семян). Применение метода предполагает возможность извлечения из соответствующей матрицы достаточного количества амплифицируемой ДНК для ее последующего изучения.
Примечание - Последовательность ДНК T-nos из Agrobacterium tumefaciens также может быть обнаружена в образцах, содержащих ДНК этих бактерий, однако не включающих в себя каких-либо генетически модифицированных последовательностей ДНК. В этой связи исследования должны дополняться анализом на основе методов, специфичных к генетической конструкции или к трансформационным событиям, для подтверждения вероятных положительных результатов.
В.6.3 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.6.3.1 Робастность метода
_______________
В.6.3.2 Внутрилабораторные испытания
В.6.3.3 Совместные сличительные испытания
_______________
_______________
Результаты совместных сличительных испытаний для определения T-nos по методу ПЦР в реальном времени представлены в таблице В.13.
Таблица В.13 - Результаты совместных сличительных испытаний
Количество лабораторий-участниц | 24 |
Количество лабораторий после исключения выбросов | 23 |
Количество образцов из расчета на лабораторию | 18 |
Количество принятых результатов | 414  |
Количество положительных образцов T-nos | 276 |
Количество отрицательных образцов T-nos | 138 |
Ложноположительные результаты | 3  (2,2%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
Данные, представленные одной из лабораторий, были исключены из сравнения ввиду загрязнения образцов посторонней ДНК, содержащей T-nos , что повлекло за собой получение ложноположительных результатов. Три лаборатории представили ложноположительные результаты (  26,6, 38,9 и 39,6 соответственно) для одного из испытуемых образцов ДНК, не содержащего T-nos . В этих лабораториях при проведении ПЦР в реальном времени использовались такие приборы, как ABI 5700 или LightCycler 1.2. | |
_______________
В.6.3.4 Молекулярная селективность
В.6.3.4.1 Общие положения
Для обнаружения последовательности T-nos в образцах ДНК был выбран и амплифицирован при помощи специфических праймеров фрагмент длиной 84 п.н. из З’-терминального участка гена нопалин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
Ввиду того что амплифицируемая последовательность была позаимствована у Agrobacterium tumefaciens - почвенной бактерии, распространенной в естественной среде, в данной ситуации нельзя исключать получение ложноположительного результата. Соответственно, хотя положительные результаты могут указывать на присутствие продуктов из генетически модифицированных растений, их не следует интерпретировать подобным образом без соответствующего подтверждения. Необходимо учитывать вероятность загрязнения исследуемого материала Agrobacterium tumefaciens или родственными ей видами бактерий.
В.6.3.4.2 Экспериментальная часть
Образцы ДНК, выделенные из имеющихся образцов стандартного состава (см. [53]), были подвергнуты анализу и прошли проверку на наличие T-nos по методу ПЦР в реальном времени с положительным результатом для перечисленных ниже модификаций:
- рисовая мука Bt63
- плоды папайи SunUp (55-1);
- картофельная мука ЕН92-527-1 (BPS-25271-9);
В.6.3.4.3 Теоретическая часть
В.6.4 Принцип и выводы
_______________
В.6.5 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения согласно ISO 5725-1 [40] и ISO 24276.
В.6.6 Типы и количество образцов (аналит и матрица)
Далее в качестве примера представлены данные сличительных испытаний по типам образцов и их количеству, достаточному для реализации описываемого метода.
Были использованы образцы ДНК, выделенные из соевой, кукурузной, рисовой и картофельной муки, а также из других растительных материалов (см. [53]). В ходе совместных сличительных испытаний участники получили в свое распоряжение образцы ДНК, выделенные из кукурузной муки с массовой долей NK603 (ERM BF-415) 0,1% и 0,5% соответственно, и генетически не модифицированной кукурузной муки (см. [54]). Значение концентрации ДНК было приведено к 20 нг/мкл. Конечная масса ДНК добавляемого образца из расчета на одну реакцию не превышала 200 нг.
В.6.7 Предел обнаружения и диапазон применения
_______________
В целом предел обнаружения метода при его практическом применении зависит от размера генома целевого таксона и от количества ДНК в пробе, использованной для ПЦР-анализа.
В.6.8 Расчет неопределенности измерения
Оценка воспроизводимости метода дается исходя из результатов сличительных испытаний (см. В.6.3.3).
В.6.9 Помехи
Количество, качество, а также способность к амплификации матрицы нуклеиновых кислот оказывают непосредственное влияние на получаемый аналитический результат (см. ISO 21571). Отсюда следует необходимость контроля нуклеиновых кислот, используемых для анализа, например, с применением специфичного к целевому таксону метода ПЦР.
В.6.10 Физические условия и условия окружающей среды
Подробнее см. в ISO 24276.
В.6.11 Инструменты и оборудование
В.6.11.1 Амплификатор для проведения ПЦР в реальном времени, оборудованный источником энергии, предназначенным для возбуждения флуоресцентных молекул, и оптической системой детектирования, пригодной для обнаружения флуоресцентных сигналов, генерируемых в процессе ПЦР.
В.6.11.2 Реакционные пробирки с пробками или крышками, способные выдерживать поочередное нагревание до 100°С и охлаждение до 4°С без разрушения и не оказывающие влияния на флуоресцентные сигналы, которые генерируются в процессе амплификации.
В.6.11.3 УФ-спектрофотометр для определения концентрации ДНК.
В.6.12 Реактивы и материалы
Если не указано иное, используются только реактивы, отвечающие требованиям ISO 24276, и только вода категории "для молекулярной биологии" или сопоставимой степени чистоты.
См. также описание конкретных реактивов в В.6.16 (этапы анализа).
В.6.13 Отбор, транспортировка, консервация и хранение образцов
Растворы ДНК могут храниться при температуре 4°С в течение не более чем 1 нед или при температуре минус 20°С в течение более длительного времени. См. также ISO 21571.
В.6.14 Пробоподготовка
См. ISO 21571.
В.6.15 Калибровка оборудования
Приборы (например, такие как амплификаторы) подлежат калибровке согласно ISO/IEC 17025 [41].
В.6.16 Этапы проведения анализа
В.6.16.1 Приготовление экстрактов ДНК
В.6.16.1.1 Выделение ДНК
ДНК выделяется из испытуемого образца с применением соответствующего метода (см. ISO 21571).
При выделении ДНК из испытуемого образца должны соблюдаться общие инструкции и меры, описанные в ISO 21571. Рекомендуется выбирать для выделения ДНК методы, представленные в ISO 21571:2005 (приложение А).
В.6.16.1.2 Количественное определение ДНК
Спектрометрическая оценка общего количества выделенной ДНК осуществлялась по методу, описанному в ISO 21571:2005 (раздел В.1).
В.6.16.1.3 Оценка целостности ДНК
Целостность выделенной ДНК (количество, качество и амплифицируемость) может быть определена при помощи ПЦР в реальном времени по методу, обеспечивающему выявление специфичной для целевого таксона (эндогенной) последовательности.
В.6.16.2 Реактивы для ПЦР
В.6.16.2.1 Общие положения
Могут использоваться готовые смеси реактивов или их отдельные компоненты. Допускается также применение реактивов и полимераз, отличных от описанных, но обеспечивающих получение лучших или таких же результатов.
В.6.16.2.2 Термостабильная ДНК-полимераза для горячего старта ПЦР.
_______________
В.6.16.2.4 Праймеры
См. таблицу В.14.
Таблица В.14 - Олигонукпеотиды
Название | Последовательность ДНК олигонуклеотидов |
T-nos в качестве целевой последовательности | |
180-F | 5’-CAT gTA ATg CAT gAC gTT ATT TATg-3’ |
180-R | 5’-TTg TTT TCT ATC gCg TAT TAA ATg T-3’ |
Tm-180 | 5’-(FAM)-ATg ggT TTT TAT gAT TAg AgT CCC gCA A-(TAMRA)-3’ |
FAM - 6-карбоксифлуоресцеин, TAMRA - 6-карбокситетраметилродамин. Допускается использование иных аналогичных репортерных красителей и/или тушителей. | |
В.6.16.3 Процедура анализа
Ниже описан порядок применения метода с общим объемом материала 25 мкл из расчета на каждую ПЦР при использовании пластиковых флаконов или 20 мкл - при использовании стеклянных капилляров. Применяются реактивы, перечисленные в таблицах В.15 или В.16.
Таблица В.15 - Применяемые реактивы для проведения ПЦР в реальном времени с использованием пластиковых флаконов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на реакцию, мкл |
2х буферных раствора для ПЦР (с , dNTPs и ДНК-полимеразой) | 1
| 12,5 |
Праймер 180-F, с =10 мкмоль/л | 400 нмоль/л | 1 |
Праймер 180-R, с =10 мкмоль/л | 400 нмоль/л | 1 |
Зонд Tm-180, с =10 мкмоль/л | 100 нмоль/л | 0,25 |
Вода | -/- | 5,25 |
Образец ДНК | до 200 нг | 5 |
Общий реакционный объем | -/- | 25 |
При использовании исходной смеси для ПЦР QuantiTect Probe (Qiagen). Могут применяться различные рабочие концентрации. В случае применения различных рабочих концентраций значения объема на образец должны быть соответствующим образом откорректированы. | ||
_______________
Таблица В.16 - Применяемые реактивы для проведения ПЦР в реальном времени с использованием стеклянных капилляров
Реактив | Конечная концентрация | Объем на реакцию, мкл |
5х буферных растворов для ПЦР (с , dNTPs и ДНК-полимеразой) | 1
| 4 |
Праймер 180-F, с =10 мкмоль/л | 1 мкмоль/л | 2 |
Праймер 180-R, с =10 мкмоль/л | 1 мкмоль/л | 2 |
Зонд Tm-180, с =10 мкмоль/л | 200 нмоль/л | 0,4 |
Вода | -/- | 6,6 |
Образец ДНК | До 200 нг | 5 |
Общий реакционный объем | -/- | 20 |
При использовании базового набора LightCycler TaqMan TaqMan (Roche) в качестве буфера ПЦР. (Roche) в качестве буфера ПЦР. Могут применяться различные рабочие концентрации. В случае применения различных рабочих концентраций значения объема на образец должны быть соответствующим образом откорректированы. | ||
_______________
В.6.16.4 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава GTS 40-3-2 (соевую муку с массовой долей 0,1% ERM BF410b). Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
В.6.16.5 Подготовка стандартов
В качестве стандарта для положительного контроля может быть приготовлен раствор ДНК с известной концентрацией (нг/мкл) и необходимым количеством копий последовательности T-nos, рассчитанным для данного значения концентрации.
В.6.16.6 Программа "температура - время"
Хорошо зарекомендовавшая себя программа "температура - время" для данного ПЦР-анализа представлена в таблице В.17 - для пластиковых флаконов и в таблице В.18 - для стеклянных капилляров соответственно.
Таблица В.17 - Программа "температура - время" для пластиковых реакционных сосудов
Шаг | Параметр | Температура, °С | Время | Измерения флуорес- ценции | Циклы | |
1 | Начальная денатурация | 95 | 15 мин | Нет | 1 | |
2 | Амплификация | Денатурация | 94 | 15 с | Нет | 45 |
|
| Отжиг и элонгация | 60 | 60 с | Да |
|
Таблица В.18 - Программа "температура - время" для стеклянных капиллярных сосудов
Шаг | Параметр | Температура, °С | Время | Измерения флуорес- ценции | Циклы | |
1 | Начальная денатурация | 95 | 10 мин | Нет | 1 | |
2 | Амплификация | Денатурация | 94 | 10 с | Нет | 45 |
|
| Отжиг и элонгация | 60 | 40 с | Да |
|
В.6.16.7 Критерии приемки или отбраковки
Если по причине атипичного характера данных, полученных в ходе измерений, их автоматическая интерпретация не позволяет получить приемлемый результат, то может возникнуть необходимость в целях успешной обработки таких данных предварительно установить базовую линию и пороговое значение вручную. В этом случае должны выполняться специальные указания по работе с программным обеспечением для интерпретации данных, приведенные в руководстве по эксплуатации соответствующего прибора.
В.6.16.8 Идентификация
Результаты анализа подлежат проверке в формате исследования ПЦР в реальном времени с использованием зонда для гибридизации, несущего флуоресцентную метку (см. [54]), с целью идентификации продуктов ПЦР в процессе обработки.
В.6.17 Идентификация образцов
Целевая последовательность считается обнаруженной, если:
- при использовании праймеров 180-F и 180-R, специфичных к T-nos, и зонда Tm-180 наблюдается возрастание измеряемого уровня флуоресценции, обусловленное амплификацией;
- в контрольных реакциях ПЦР без добавления ДНК (контроль реактивов для ПЦР, отрицательный контроль экстракции) не наблюдается возрастание уровня флуоресценции, обусловленное амплификацией;
В.6.18 Выполнение вычислений
В.7 Метод скрининга для обнаружения генетически модифицированных организмов (промотор FMV 34S)
В.7.1 Назначение, важность и научное обоснование
Метод применим для обнаружения последовательности ДНК промотора вируса мозаики норичника 34S (FMV 34S) в семенах рапса RT73 и в других генетически модифицированных растениях, содержащих промотор FMV 34S. Он может использоваться для скрининга с целью выявления ДНК генетически модифицированных растений, содержащих данный элемент. В основу метода положена амплификация ДНК в процессе качественного ПЦР-анализа.
Примечание - Обнаружение продуктов ПЦР только с применением электрофореза в агарозном геле не удовлетворяет требованию о наличии проверочного этапа с использованием средств, специфичных к соответствующей последовательности генов. Необходимость проверки молекулярного состава продуктов ПЦР при скрининговых исследованиях зависит от схемы анализа, которой следует применяемый метод скрининга. В общем случае проверка молекулярного состава продуктов ПЦР может осуществляться, например, путем секвенирования, расщепления двумя рестриктазами и/или зондовой гибридизации, которая не рассматривалась при проведении метрологической аттестации метода, описанной в настоящем приложении.
В.7.2 Принцип
Данный метод описывает порядок скринингового исследования на основе качественного ПЦР-анализа для обнаружения промотора FMV 34S в ДНК, выделяемой из семян рапса, путем амплификации продукта ПЦР размером 196 п.н. Ввиду присутствия промотора FMV 34S во многих разновидностях генетически модифицированных растений, в особенности в генетически модифицированном рапсе, картофеле, соевых бобах, хлопке, томатах и свекле, метод может быть использован для скрининга с целью выявления генетически модифицированной растительной ДНК. С учетом того, что последовательность промотора FMV 34S также может быть обнаружена в образцах, содержащих ДНК вируса мозаики норичника, но не включающих в себя генетически измененных последовательностей ДНК, для подтверждения полученных положительных результатов может потребоваться дополнительный анализ.
В.7.3 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.7.3.1 Робастность метода
Робастность качественного метода проведения ПЦР-анализа для обнаружения промотора FMV 34S проверялась при трех различных температурах отжига (53°С, 54°С и 55°С) с применением трех образцов ДНК, содержащих различные количества геномной ДНК, выделенной из семян рапса RT73 (10; 1 и 0,1 нг, что соответствует приблизительно 15000, 1500 и 150 копиям промотора FMV 34S, с тремя повторениями на каждый образец). Результаты проведения ПЦР качественным методом убедительно показали, что в ходе осуществляемых реакций образуются цепочки ДНК одинакового размера независимо от температуры отжига и количества матричной ДНК. Последнее в перечисленном ряду значение температуры отжига, равное 54°С, было выбрано с учетом наибольшей интенсивности сигнала при наименьшей концентрации матричной ДНК (0,1 нг).
_______________
В.7.3.2 Внутри лабораторные испытания
_______________
В.7.3.3 Совместные сличительные испытания
GMDL-SHCIQ были организованы совместные сличительные испытания, посвященные методу обнаружения промотора FMV 34S в генетически модифицированном рапсе RT73. В указанном исследовании приняли участие 12 лабораторий из Канады, Словении, Нидерландов, Германии, Аргентины и Китая.
_______________
Сухие образцы семян RT73 и обычного рапса предварительно измельчались в порошок с помощью криомельницы.
При помощи весов Sartorius BS 224S (неопределенность в пределах ±0,0003 г), откалиброванных, как описано в ISO/IEC 17025 [41], приготавливались навески массой 2,0000 г, 0,4000 г, 0,0400 г, 0,0200 г, 0,0040 г чистого сухого порошка из семян рапса RT73 и 38,0000 г, 39,6000 г, 39,9600 г, 39,9800 г, 39,9960 г чистого сухого порошка из семян обычного рапса.
Взвешенные количества рапса RT73 и соответствующие количества обычного рапса одновременно помещались во флаконы для помола вместимостью 50 мл (общая масса 40,0000 г).
Образцы перемалывались в криогенной мельнице в среде жидкого азота в течение 10 мин, после чего флаконы выдерживались с закрытой крышкой при комнатной температуре в течение 1-2 дн.
Если на внешней поверхности флаконов при комнатной температуре отсутствовала конденсированная влага, то такие смешанные порошкообразные образцы развешивались в склянки малой вместимости, по 1 г в каждую склянку.
Для полученных в результате смешанных образцов массовое содержание генетически модифицированного рапса RT73 в обычном рапсе составляло 5%, 1%, 0,1%, 0,05% и 0,01%. Проверка данных образцов на однородность осуществлялась путем случайного отбора 10 склянок из каждой партии образцов с массовой долей RT73, составляющей 5%, 1% и 0,1% соответственно. Результаты показали, что все матрицы ДНК, выделенные из сухого порошка в 30 склянках, пригодны для амплификации целевых фрагментов ДНК.
Участники получили в свое распоряжение следующие образцы:
- 10 неподписанных образцов, содержащих по массе 5%, 1%, 0,1%, 0,05%, 0,01% рапса RT73, по две склянки на каждое значение концентрации, по 1 г на каждую склянку;
- порошок семян рапса RT73 (с 10%-ной массовой долей компонента RT73) в качестве положительного контроля, с кодовой пометкой "Р", 1 г;
- порошок семян генетически не модифицированного рапса в качестве отрицательного контроля, с кодовой пометкой "N", 1 г;
_______________
Пара праймеров FMV 34S, праймеры F/R: последовательность праймеров и размер ампликона представлены в таблице В.20.
Рабочий процесс совместных сличительных испытаний включал в себя следующие этапы:
_______________
- использование спектрометрического оборудования для оценки общего количества выделенной ДНК в соответствии с ISO 21571:2005 (раздел В.1);
- ПЦР, проводимую качественным методом в целях анализа выделенной ДНК;
- электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле и запись результатов визуализации.
Совместные сличительные испытания проводились в соответствии с ISO 5725-2 [39], в частности с соблюдением требований к мере прецизионности (т.е. повторяемости и воспроизводимости) и правильности.
Возможность применения скринингового метода обнаружения промотора FMV 34S и соответствующий данному методу предел обнаружения оценивались с использованием ДНК, выделенной из 10 двойных слепых образцов, которые представляли собой смесь различных количеств семян рапса RT73 и обычного рапса. Каждая лаборатория получила 10 двойных слепых образцов сухого порошка с массовой долей 5%, 1%, 0,1%, 0,05%, 0,01% рапса RT73, смешанного с генетически не модифицированным рапсом.
Результаты совместных сличительных испытаний даны в таблице В.19. Доля положительных заключений для образцов, содержащих по массе 5%, 1%, 0,1%, 0,05% и 0,01% генетически модифицированного рапса в смеси с генетически не модифицированным рапсом составила 100%, 100%, 95,8%, 70,8% и 20,8% соответственно. Было доказано, что относительный предел обнаружения метода для промотора FMV 34S соответствует массовой доле ГМО, не превышающей 0,1%, как установлено требованиями признаваемых международных руководств.
Таблица В.19 - Результаты совместных сличительных испытаний метода обнаружения промотора FMV 34S
Параметр (сличительные испытания в 2006 г.; анализируемый образец: рапсовая мука RT73) | Значение | ||||
Количество лабораторий | 12 | ||||
Количество лабораторий, подвергнутых оценке | 12 | ||||
Количество образцов из расчета на лабораторию | 10 | ||||
Общее количество образцов | 120 | ||||
Количество принятых результатов | 120 | ||||
Количество образцов, содержащих генетически не модифицированный рапс | 120 | ||||
Целевое содержание материала для обнаружения, массовая доля, % | 5,0 | 1,0 | 0,1 | 0,05 | 0,01 |
Количество образцов | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 |
Количество положительных заключений | 24 | 24 | 23 | 17 | 5 |
Количество ложноотрицательных заключений | 0 | 0 | 1 | 7 | 19 |
Количество ложноположительных заключений | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Доля положительных заключений, % | 100 | 100 | 95,8 | 70,8 | 20,8 |
Доля ложноотрицательных заключений, % | 0 | 0 | 4,2 | 29,2 | 79,2 |
Доля ложноположительных заключений, % | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
В.7.3.4 Молекулярная селективность
В.7.3.4.1 Общие положения
Предлагаемый скрининговый метод направлен на обнаружение последовательностей промотора FMV 34S путем амплификации фрагмента консервативного участка последовательности FMV 34S размером 196 п.н. при помощи специфических праймеров: FMV 34S-праймер F и FMV 34S-праймер R.
В.7.3.4.2 Экспериментальная часть
Амплификация целевой последовательности FMV 34S наблюдалась при использовании геномной ДНК рапса RT73, сортов хлопка MON1445, MON1698 и MON88913, совевых бобов MON 89788 и сахарной свеклы Н7-1.
В.7.3.4.3 Теоретическая часть
Теоретическая специфичность пар праймеров FMV 34S оценивалась путем поиска идентичных последовательностей с использованием программы BLASTN 2.0MP-WashU (см. [82], дата поиска: 2010-02-18). Искомая последовательность размером 196 п.н. представлена в базе данных NCBI как часть последовательности с идентификатором AR016589. Результаты применения программы BLAST подтвердили соответствие данных праймеров широкому списку известных последовательностей, защищенных патентами, а также геному вируса мозаики норичника, зарегистрированному в базе под идентификационным номером Х06166.
В.7.4 Принцип и выводы
Данный метод представляет собой процедуру ПЦР-скрининга, выполняемого качественным методом и ориентированного на обнаружение последовательности промотора FMV 34S с целью выявления генетически модифицированных компонентов в пищевых продуктах. Была выполнена оценка применимости скринингового метода и соответствующего данному методу предела обнаружения, в ходе которой путем электрофореза в агарозном геле был выделен продукт ПЦР длиной 196 п.н.
В.7.5 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения согласно ISO 5725-1 [40] и ISO 24276.
В.7.6 Типы и количество образцов
Репрезентативность испытуемого образца по отношению к лабораторному образцу может обеспечиваться, например, путем размола или гомогенизации. Порядок выполнения измерений и пошаговые процедуры, которым необходимо следовать, описаны в ISO 21571.
В.7.7 Предел обнаружения и диапазон применения
Абсолютный предел обнаружения для качественного ПЦР-анализа соответствовал массе 0,1 нг чистой ДНК рапса RT73, что сопоставимо приблизительно с 75 копиями ДНК гаплоидного генома рапса и 150 копиями целевой последовательности FMV 34S (см. [57]). Относительный предел обнаружения для качественного ПЦР-анализа соответствовал массовой доле 0,1% ДНК RT73 в 20 нг ДНК генома рапса. Наименьшее значение массовой доли ДНК RT73 в процессе совместных сличительных испытаний составило 0,01%.
Ввиду присутствия промотора FMV 34S во многих разновидностях генетически модифицированных растений, в особенности в генетически модифицированном рапсе, картофеле, соевых бобах, хлопке, томатах и свекле, метод может быть использован для скрининга с целью выявления генетически модифицированной растительной ДНК с массовой долей от 0,1% до 100%.
В.7.8 Расчет неопределенности измерения
Общая неопределенность метода оценивается исходя из результатов совместных сличительных испытаний (см. В.7.3.3).
В.7.9 Помехи
Количество, качество, а также способность к амплификации матрицы нуклеиновых кислот оказывают непосредственное влияние на получаемый аналитический результат (см. ISO 21571). Отсюда следует необходимость контроля нуклеиновых кислот, используемых для анализа, например, с применением специфичного к целевому таксону метода ПЦР.
При этом нельзя исключать вероятность получения ложноположительного результата, с учетом того, что амплифицируемая последовательность принадлежит вирусу мозаики норичника, который может заражать растения естественным путем.
В.7.10 Физические условия и условия окружающей среды
Подробнее см. в ISO 24276.
В.7.11 Инструменты и оборудование
В.7.11.1 Общие положения
Все применяемое оборудование должно быть откалибровано в соответствии с ISO/IEC 17025 [41].
В.7.11.2 Оборудование и материалы для выделения ДНК
В.7.11.2.1 Водяная баня или термостат.
В.7.11.2.2 Микроцентрифуга.
В.7.11.2.3 Микропипетки.
В.7.11.2.4 Вихревая мешалка.
В.7.11.2.5 Пробирки вместимостью 1,5/2,0 мл.
В.7.11.2.6 Наконечники и наконечники с фильтром для микропипеток.
В.7.11.2.7 Штатив для реакционных пробирок.
В.7.11.2.8 Перчатки, ПВХ или латексные.
В.7.11.2.9 Вакуумная сушилка, пригодная для высушивания осажденной ДНК (не обязательно).
В.7.11.3 Инструменты и оборудование для количественного определения ДНК
В.7.11.3.1 УФ-спектрофотометр с простым пучком, двойным пучком или также с детектором на фотодиодном массиве либо флуориметр, пригодный для количественного определения с использованием флуоресцентных красителей.
В.7.11.3.2 Измерительные емкости, например кварцевые или пластиковые кюветы, пригодные для УФ-обнаружения на длине волны 260 нм. От размера измерительных емкостей зависит объем измеряемых образцов. Могут использоваться емкости следующих размеров: полумикрокюветы (1000 мкл), микрокюветы (400 мкл), ультрамикрокюветы (100 мкл) и кварцевые капилляры (от 3 до 5 мкл). Оптический путь стандартной кюветы обычно составляет 1 см.
В.7.11.4 Инструменты и оборудование для проведения ПЦР качественным методом
В.7.11.4.1 Амплификатор
Изначально метод был разработан и прошел внутреннюю аттестацию с применением амплификаторов MJ Research РТС-225, Applied Biosystems 2720 и Eppendorf Mastercycler Gradient. Допускается также применение амплификаторов и реакционных флаконов, отличных от описанных, если они обеспечивают получение лучших или таких же результатов.
В.7.11.4.2 Оборудование для электрофореза с блоком питания.
В.7.11.4.3 Микроволновая печь (не обязательно).
В.7.11.4.4 Система визуализации для гелевого анализа.
В.7.11.4.5 Микроцентрифуга.
В.7.11.4.6 Морозильник, обеспечивающий температуру минус 20°С, и холодильник, обеспечивающий температуру 4°С.
В.7.11.4.7 Микропипетки.
В.7.11.4.8 Вихревая мешалка.
В.7.11.4.9 Пробирки вместимостью 0,2; 1,5 и 2,0 мл.
В.7.11.4.10 Наконечники и наконечники с фильтром для микропипеток.
В.7.11.4.11 Штатив для реакционных пробирок.
В.7.11.4.12 Перчатки, ПВХ или латексные.
В.7.12 Реактивы и материалы
В.7.12.1 Общие положения
Если не указано иное, используются только реактивы, отвечающие требованиям ISO 24276, и только вода категории "для молекулярной биологии" или сопоставимой степени чистоты.
В.7.12.2 Выделение ДНК
_______________
Примечание - Возможно применение других проверенных наборов для выделения ДНК или других методов экстрагирования.
В.7.12.3 Качественная ПЦР
Требования к качеству применяемых реактивов см. в ISO 24276:2006 (пункт 5.3.5).
В.7.12.3.3 Раствор dNTP, c(dNTP) = 2,5 ммоль/л (каждый).
В.7.12.3.4 Олигонуклеотиды, см. таблицу В.20.
В.7.12.3.5 ДНК-полимераза термостабильная, 5 МЕ/мкл.
В.7.12.3.6 Размерный стандарт ДНК.
В.7.13 Отбор, транспортировка, консервация и хранение образцов
Растворы ДНК могут храниться при температуре 4°С в течение не более чем 1 нед или при температуре минус 20°С в течение более длительного времени.
В.7.14 Подготовка испытуемого образца
ДНК выделяется однократно для каждого образца, с соблюдением общих инструкций и мер, описанных в ISO 21571.
В.7.15 Калибровка оборудования
Используемые приборы, например амплификаторы и пипетки, должны быть откалиброваны, как указано в ISO/IEC 17025 [41].
В.7.16 Этапы проведения анализа
В.7.16.1 Приготовление экстрактов ДНК
В.7.16.1.1 Выделение ДНК
_______________
В.7.16.1.2 Количественное определение ДНК
Спектрометрическое определение общего количества выделенной ДНК осуществляется в соответствии с методом, описанным в ISO 21571:2005 (раздел В.1).
В.7.16.1.3 Оценка целостности ДНК
Целостность выделенной ДНК оценивалась с применением электрофореза в агарозном геле.
В.7.16.2 Реактивы для ПЦР
В.7.16.2.1 Термостабильная ДНК-полимераза, буферы и т.д.
См. В.7.12.3. Должна использоваться ДНК-полимераза (с ферментными характеристиками, необходимыми для горячего старта), пригодная для проведения ПЦР качественным методом. Допускается также применение реактивов и полимераз, отличных от описанных, но обеспечивающих получение лучших или таких же результатов.
В.7.16.2.2 Праймеры и зонд
См. таблицу В.20.
Таблица В.20 - Последовательности праймеров ПЦР для обнаружения FMV 34S
Название | Олигонуклеотидные последовательности праймеров (5’-3’) | Длина ампликона |
FMV 34S-праймер F | AAg CCT CAA CAA ggT CAg | 196 п.н. |
FMV 34S-праймер R | CTg CTC gAT gTT gAC AAg |
|
В.7.16.3 Процедура анализа
В.7.16.3.1 Общие положения
Методика выполнения качественного ПЦР-анализа для промотора FMV 34S разработана из расчета на общий объем 25 мкл на одну реакцию и на использование реактивов, перечисленных в таблице В.21. На каждую реакцию добавляется по 20 нг матричной ДНК.
Перед проведением стандартной ПЦР исходную реакционную смесь оттаивают, осторожно перемешивают и обрабатывают в центрифуге. Размороженные реактивы сохраняют на льду при температуре от 1°С до 4°С.
Добавляют компоненты согласно таблице В.21. До выполнения амплификации рекомендуется приготовить исходную реакционную смесь для ПЦР.
Распределяют исходную смесь и добавляют образцы ДНК, включая слепые образцы, положительную контрольную пробу, отрицательную контрольную пробу, а также холостую пробу (воду).
Осторожно перемешивают содержимое пробирок для ПЦР (или планшета) и обрабатывают их в микроцентрифуге в течение непродолжительного времени.
Переносят пробирки (или планшет) в амплификатор.
Запускают программу ПЦР с параметрами, описанными в В.7.16.3.4.
По завершении программы ПЦР помещают по 2 мкл загрузочного буфера в каждую реакционную пробирку и смешивают с продуктами ПЦР.
Вносят по 10 мкл каждого продукта ПЦР и размерного стандарта ДНК в лунки с гелем для электрофореза (20 г/л агарозы, 0,5 мкг/мл бромистого этидия).
Обрабатывают гель в камере для электрофореза при 5 В/см в течение 20 мин.
Фиксируют результаты разделения при помощи системы визуализации для анализа результатов.
Таблица В.21 - Реакционные смеси для амплификации в конечном объеме раствора/концентрация из расчета на реакционную пробирку
Реактив | Конечная концентрация | Объем на реакцию, мкл |
Образец ДНК | 20 нг | 1 |
Вода |
| 15,8 |
Буфер ПЦР (без добавления MgCI2*), 10 | 1х | 2,5 |
Раствор MgCI2* , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 2,5 ммоль/л (каждый) | 0,2 ммоль/л (каждый) | 2 |
FMV 348-праймер F, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
FMV 343-праймер F, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
Термостабильная (Tag) ДНК-полимераза, 5 МЕ/л | 1 ME | 0,2 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержал , конечная концентрация в реакционной смеси доводится до 1,5 ммоль/л. | ||
В.7.16.3.2 Контроли ПЦР
При каждом ПЦР-анализе испытанию подлежат положительная контрольная проба, отрицательная контрольная проба и холостая проба (вода), как описано в ISO 24276.
В.7.16.3.3 Подготовка стандартов
В качестве стандарта может быть приготовлен раствор ДНК с известной концентрацией (нг/мкл) и известным количеством копий целевой последовательности FMV 34S.
В.7.16.3.4 Программа "температура - время"
_______________
Таблица В.22 - Программа для проведения ПЦР качественным методом
Активация и начальная денатурация | 3 мин/94°С |
Амплификация | 30 с/94°С |
| 30 с/54°С |
| 40 с/72°С |
Количество циклов | 40 |
Окончательная элонгация | 3 мин/72°С |
В.7.16.3.5 Критерии приемки или отбраковки
Для оценки результатов сличительных испытаний применяются следующие требования к эффективности метода.
Фрагмент размером 196 п.н. должен быть выявлен в положительной контрольной пробе рапса RT73 (образец Р), при этом целевой фрагмент не должен обнаруживаться в отрицательной контрольной пробе (образцы N и М) и холостой пробе. Выявление фрагмента размером 196 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемый промотор FMV 34S.
Получение ложноположительного результата может быть связано с тем, что амплифицируемая последовательность принадлежит вирусу мозаики норичника, который может заражать растения естественным путем. Хотя положительные результаты могут указывать на присутствие продуктов из генетически модифицированных растений, их не следует интерпретировать как убедительное доказательство подобного присутствия без соответствующего подтверждения.
Для дифференцирования между вирусной инфекцией и генетически модифицированным материалом должны использоваться специализированные методы обнаружения вируса мозаики норичника и/или дополнительные скрининговые методы выявления генетически модифицированных организмов.
В.7.16.3.6 Идентификация
В соответствии с представленным методом идентификация осуществляется исключительно исходя из длины последовательностей продуктов ПЦР, определяемой при помощи размерных стандартов ДНК. Искомым продуктом является фрагмент размером 196 п.н.; все остальные полосы, наблюдаемые при электрофорезе в агарозном геле, относятся к побочным продуктам.
В.7.17 Идентификация образцов
Все образцы должны быть четко идентифицированы.
В.7.18 Интерпретация и расчет результатов
Ожидаемая длина ампликона промотора FMV 34S составляет 196 п.н.
Выявление фрагмента размером 196 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемый промотор FMV 34S, размеры которого соответствуют размерам последовательности, выделяемой из семян рапса RT73. В этом случае результаты исследования должны описываться следующим образом: "Последовательность промотора FMV 34S обнаружена в образце X".
Если искомый фрагмент ДНК размером 196 п.н. выделить не удалось, результаты исследования описываются словами: "Последовательность промотора FMV 34S не обнаружена в образце X". В дополнение к результатам указывается предел обнаружения для проведенного анализа.
В.8 Метод скрининга на основе ПЦР-анализа в реальном времени для обнаружения гена bar Streptomyces hygroscopicus
В.8.1 Принцип
Метод описывает порядок обнаружения последовательности ДНК гена фосфинотрицинацетилтрансферазы (bar), принадлежащего Streptomyces hygroscopicus. Ген bar часто обнаруживается в генетически модифицированных растениях (например, рисе, рапсе, кукурузе и хлопке), поскольку растения-носители этого гена нечувствительны к фосфинотрицинсодержащим гербицидам. Представленный метод скрининга для обнаружения гена bar основан на выполнении ПЦР-анализа в реальном времени и может быть использован для скрининга ДНК, которая выделяется из генетически модифицированных растений, содержащих последовательность гена bar.
Последовательность ДНК, амплифицируемая при помощи метода скрининга для гена bar и принадлежащая Streptomyces hygroscopicus, может обнаруживаться в образцах, которые содержат ДНК указанных бактерий естественного происхождения. По этой причине любой положительный результат скрининга для гена bar должен подтверждаться дополнительно. Следовательно, соответствующий образец ДНК требует дальнейшего анализа.
В.8.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.8.2.1 Робастность
Робастность метода проверяется путем внесения следующих изменений в схему анализа:
- уменьшение концентрации праймера с 140 до 100 нмоль/л;
- уменьшение концентрации зонда с 100 до 75 нмоль/л.
Каждая реакция повторяется трижды с использованием одного и того же количества матричной ДНК.
Уменьшение концентрации зонда в процессе испытаний не оказало влияния на пороговое значение цикла.
Уменьшение концентрации праймера привело к увеличению порогового значения цикла в среднем на 0,4. Для качественного метода данное отклонение можно признать несущественным.
В ходе совместных сличительных испытаний робастность метода проверялась с различным оборудованием для проведения ПЦР в реальном времени и с различными исходными смесями. Ни применение различного оборудования для проведения ПЦР, ни использование различных исходных смесей не отразились на эффективности метода.
В.8.2.2 Внутрилабораторные испытания
При проведении внутрилабораторных испытаний метод обеспечил получение удовлетворительных и непротиворечивых результатов. Метод проверялся с использованием серии разбавлений с 5%-ной массовой долей (копии ДНК/копии ДНК) ДНКА риса LL62 и пятью повторениями ПЦР на каждом этапе. Относительные доверительные интервалы (P=95%) для измеренного количества копий, равного 2500, 500, 100, 50, 25, 10 и 5, составили 5,6%, 12,2%, 27,2%, 18,2%, 22,4%, 84,5% и 45,2% соответственно. Метод также был испытан на эффективность с различными приборами для проведения ПЦР в реальном времени (см. В.8.10.1), различными исходными смесями для ПЦР (см. В.8.15.4.1) и образцами ДНК, полученными из различных растений (см. В.8.2.4.3). Результаты проведенных испытаний также свидетельствуют, что метод обеспечивает получение удовлетворительных и согласованных результатов.
В.8.2.3 Совместные сличительные испытания
Эффективность метода оценивалась в рамках совместных сличительных испытаний, координатором которых выступало Федеральное ведомство по защите прав потребителей и безопасности пищевых продуктов (BVL, см. [58], [59]). Исследование проводилось в соответствии с протоколом IUPAC (см. [48]). Всего в исследовании приняли участие 15 лабораторий. Для анализа участники получили в свое распоряжение 12 образцов ДНК с различными концентрациями копий последовательности гена bar, а также 6 образцов ДНК, не содержащих последовательности гена bar. Всем образцам были присвоены случайные номера.
Для получения образцов в качестве исходных использовались растворы геномной ДНК из листьев риса LL62 или рапса MS8 и геномной ДНК, выделенной из генетически не модифицированной рисовой крупы или семян рапса (bar-отрицательных). Все растворы геномной ДНК представляли собой сертифицированные стандартные образцы (приобретенные у Bayer CropScience, Гент, Бельгия). Значения концентрации ДНК определялись фотометрическим способом; количество копий для них рассчитывалось на основе геномных эквивалентов в соответствии с уравнением, приведенным в примечании к В.8.15.4.3. Для риса за основу была принята масса гаплоидного генома, равная 0,5 пг, а для рапса - 1,33 пг (см. [55]). Что касается используемой эталонной ДНК риса LL62 или рапса MS8, предполагалась однократная вставка целевой последовательности bar в геном риса или рапса соответственно (см. [60], [61]), как в случае с гомозиготным рисом LL62 и гемизиготным рапсом MS8, исходя из информации, предоставленной изготовителем.
В случае с безымянными образцами каждому участнику было передано три флакона, в каждом из которых находились части образцов следующих растворов ДНК (с массовыми долями генетически модифицированных ДНК, заданными в соответствии с ранее рассчитанными количествами копий в исходном растворе ДНК): 0,1% ДНК риса LL62 (20 нг/мкл), 0,02% ДНК риса LL62 (20 нг/мкл), 0,1% ДНК рапса MS8 (40 нг/мкл), 0,02% ДНК рапса MS8 (40 нг/мкл), генетически не модифицированный рис (20 нг/мкл), генетически не модифицированный рапс (40 нг/мкл).
Каждый образец был однократно исследован участниками с использованием 5 мкл соответствующего раствора ДНК и системы ПЦР для анализа гена bar и с соблюдением условий, описанных в таблицах В.25-В.28. Калибровочные растворы ДНК и раствор ДНК риса LL62 с пятью копиями гена подвергались измерениям дважды. Измерения выполнялись с использованием различного оборудования для проведения ПЦР в режиме реального времени (см. В.8.10.1).
Обзорная информация и количественная оценка по результатам сличительных испытаний для определения отношения ложноположительных и ложноотрицательных заключений даны в таблице В.23.
Таблица В.23 - Результаты совместных сличительных испытаний
Параметр (сличительные испытания 2008 г.) | Значение |
Количество лабораторий | 15 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 15 |
Количество образцов из расчета на лабораторию | 18 |
Количество принятых результатов | 270 |
Количество образцов, содержащих целевую последовательность bar | 180 |
Количество образцов, не содержащих целевую последовательность bar | 90 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
Таблица В.24 - Оценка результатов совместных сличительных испытаний (количественная)
Содержание ГМО в образцах (копии модифицированных генов/геномные эквиваленты), % массовой доли | Количество положительных результатов/общее количество результатов | Расчетное количество копий гена bar | Количество гена bar , % (относительно количества копий генов соответствующих видов)  | |
|
| Среднее значение |  , % , % | Среднее значение |
0,1% риса LL62 | 45/45 | 218 | 24 | 0,11 |
0,02% риса LL62 | 45/45 | 46 | 25 | 0,02 |
0,1% рапса MS8 | 45/45 | 86 | 17 | 0,11 |
0,02% рапса MS8 | 45/45 | 21 | 31 | 0,03 |
Генетически не модифицированный рис | 0/45 | 0 | - | - |
Генетически не модифицированный рапс | 0/45 | 0 | - | - |
Среднее значение расчетного количества копий по совокупности всех анализов. Коэффициент вариации в условиях воспроизводимости. Исходя из допущения, что из расчета на одну реакцию было использовано 150,000 копий генома рапса (200 нг ДНК рапса) или 200,000 копий генома риса (100 нг ДНК риса) соответственно. | ||||
В.8.2.4 Молекулярная селективность
В.8.2.4.1 Общие положения
Последовательность ДНК, амплифицируемая при помощи метода скрининга для гена bar, может быть обнаружена как в образцах из генетически модифицированных растений, которые содержат ген bar, принадлежащий Streptomyces hygroscopicus, так и в образцах, которые содержат ДНК указанных бактерий естественного происхождения.
По этой причине любой положительный результат скрининга для гена bar должен подтверждаться дополнительно. Следовательно, соответствующий образец ДНК требует дальнейшего анализа.
В.8.2.4.2 Теоретическая часть
В.8.2.4.3 Экспериментальная часть
Целевую последовательность bar не удалось обнаружить в образцах, содержащих ДНК, которая была получена из генетически не модифицированных риса или рапса (см. таблицу В.24). При экспериментальном оценивании специфичности метода перекрестные реакции для метода обнаружения гена bar не наблюдались в случае использования ДНК из следующих генетически модифицированных растений:
- генетически модифицированный рис Bt63;
- генетически модифицированный картофель ЕН92-527-1 (BPS-25271-9);
Для следующих генетически модифицированных растений была экспериментально доказана пригодность метода для определения гена bar к использованию для целей скрининга:
Все разновидности ДНК, которые подлежали исследованию в процессе испытаний на специфичность, были проверены на способность к амплификации и на влияние ингибиторов при помощи методов, специфичных к таксону, до начала применения (данные не приводятся).
В.8.3 Принцип и выводы
_______________
В.8.4 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения согласно ISO 5725-1 [40] и ISO 24276.
В.8.5 Типы и количество образцов
Репрезентативность испытуемого образца по отношению к лабораторному образцу может обеспечиваться, например, путем размола или гомогенизации. Порядок выполнения измерений и пошаговые процедуры, которым необходимо следовать, описаны в ISO 21571.
В.8.6 Предел обнаружения
Метод проверялся с использованием образцов, содержащих малое количество копий гена bar (см. таблицу В.24). Целевую последовательность bar удалось обнаружить во всех содержащих ее образцах. Кроме того, контроль чувствительности с применением пяти копий ДНК риса LL62 позволил амплифицировать целевую последовательность bar во всех задействованных лабораториях (30 одиночных анализов, использованы данные о результатах, полученных с применением стандартного разбавления ДНК, которое использовалось при калибровке, см. В.8.2.3). Исходя из полученных результатов, предел обнаружения (относительно матрицы) не превышает массовой доли 0,02% (образцы ДНК с таким отношением копий гена bar к геномным копиям соответствующих видов) или, в абсолютном выражении, соответствует не более чем пяти копиям.
В.8.7 Расчет неопределенности измерения
В.8.8 Помехи
Количество, качество, а также способность к амплификации матрицы нуклеиновых кислот оказывают непосредственное влияние на получаемый аналитический результат (см. ISO 21571). Отсюда следует необходимость контроля нуклеиновых кислот, используемых для анализа, например, с применением специфичного к целевому таксону метода ПЦР.
В.8.9 Физические условия и условия окружающей среды
Подробнее см. в ISO 24276.
В.8.10 Инструменты и оборудование для проведения ПЦР в реальном времени
В.8.10.1 Амплификатор, оборудованный:
- источником энергии, предназначенным для возбуждения флуоресцентных молекул;
- оптической системой детектирования, пригодной для обнаружения флуоресцентных сигналов, генерируемых в процессе ПЦР.
_______________
В.8.10.2 Реакционные сосуды с пробками или крышками, способные выдерживать поочередное нагревание до 100°С и охлаждение до 4°С без разрушения и не оказывающие влияние на флуоресцентные сигналы, которые генерируются в процессе амплификации.
В.8.11 Реактивы и материалы
Если не указано иное, используются только реактивы, отвечающие требованиям ISO 24276, и только вода категории "для молекулярной биологии" или сопоставимой степени чистоты.
В.8.12 Отбор, транспортировка, консервация и хранение образцов
Растворы ДНК могут храниться при температуре 4°С в течение не более чем 1 нед или при температуре минус 20°С в течение более длительного времени.
В.8.13 Пробоподготовка
См. ISO 21571.
В.8.14 Калибровка оборудования
Приборы (например, такие как амплификаторы) подлежат калибровке как описано в lSO/IEC 17025 [41].
В.8.15 Этапы проведения анализа
В.8.15.1 Общие положения
ДНК выделяется из испытуемого образца с применением соответствующего метода. Анализ ДНК включает в себя:
- проверку количества, качества и амплифицируемости выделенной ДНК, например, с применением специфичного к целевому таксону метода ПЦР (см. ISO 21569 и ISO 21570 [43]);
- обнаружение последовательности гена bar средствами ПЦР в реальном времени.
В.8.15.2 Приготовление экстрактов ДНК
При выделении ДНК из испытуемого образца должны соблюдаться общие инструкции и меры, описанные в ISO 21571. Рекомендуется выбирать для выделения ДНК методы, представленные в ISO 21571:2005 (приложение А).
В.8.15.3 Реактивы для ПЦР
В.8.15.3.1 Термостабильная ДНК-полимераза (для горячего старта ПЦР).
В качестве буферных растворов для ПЦР могут использоваться готовые смеси реактивов или их отдельные компоненты.
В.8.15.3.3 Олигонуклеотиды
Таблица В.25 - Олигонуклеотиды
Название | Последовательность ДНК олигонуклеотида | Конечная концентрация при проведении ПЦР | |
Ген bar в качестве целевой последовательности | Пластиковые реакционные флаконы | Стеклянные капилляры | |
RapB-F1 | 5’-ACA AgC ACg gTC AAC TTC C-3’ | 140 нмоль/л | 340 нмоль/л |
RapB-R1 | 5’-gAg gTC gTC CgT CCA CTC-3’ | 140 нмоль/л | 340 нмоль/л |
RapB-S1 | 5’-(FAM)-TAC CgA gCC gCA ggA ACC-(TAMRA)-3’ | 100 нмоль/л | 120 нмоль/л |
FAM - 6-карбоксифлуоресцеин, TAMRA - 6-карбокситетраметилродамин. Допускается использование иных аналогичных репортерных красителей и/или тушителей, если они достоверно обеспечивают получение лучших или таких же результатов. | |||
В.8.15.4 Процедура анализа
В.8.15.4.1 Проведение ПЦР
Описываемая методика анализа предназначена для работы с общим объемом 25 мкл из расчета на каждую ПЦР, с использованием реактивов, перечисленных в таблице В.26.
Таблица В.26 - Набор реактивов для амплификации последовательности гена bar из расчета на реакционный флакон
Общий объем | 25 мкл | |
ДНК образца (до 200 нг) или контроли | 5 мкл | |
Буферный раствор для ПЦР (с, dNTPs и ДНК-полимеразой) | 12,5 мкл | |
Праймеры | RapB-F1 и RapB-R1 | См. таблицу В.25 |
Зонд | RapB-S1 | См. таблицу В.25 |
Вода |
| До 25 мкл |
В ходе совместных сличительных испытаний в качестве буферного раствора для ПЦР применялись универсальная исходная смесь TaqMan (Applied Biosystems, Дармштадт) вместе с соответствующим оборудованием для проведения ПЦР в режиме реального времени производства компании Applied Biosystems; набор для ПЦР QuantiTect Probe (Applied Biosystems, Дармштадт) вместе с соответствующим оборудованием для проведения ПЦР в режиме реального времени производства компании Applied Biosystems; набор для ПЦР QuantiTect Probe (Qiagen GmbH, Хильден) применялся при использовании другого оборудования для проведения ПЦР в реальном времени с пластиковыми реакционными флаконами; исходная смесь QuantiTect Multiplex PCR No-Rox (Qiagen GmbH, Хильден) применялась при использовании оборудования для проведения ПЦР со стеклянными капиллярами. Допускается использование иных аналогичных изделий других изготовителей, если они достоверно обеспечивают получение лучших или таких же результатов. | ||
_______________
В.8.15.4.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать стандартные образцы ДНК, полученные их листьев генетически модифицированной культуры MS8 и генетически модифицированной культуры LLRice62 (AOCS, Эрбана, США).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
В.8.15.4.3 Подготовка стандартов
Раствор ДНК с известным значением концентрации (нг/мкл) и количеством копий последовательности гена bar, рассчитанным на основе этой концентрации.
В.8.15.4.4 Программа "температура - время"
При использовании данной процедуры ПЦР программа "температура - время", представленная в таблице В.27, подтвердила свою применимость для работы с пластиковыми реакционными флаконами, а представленная в таблице В.28 - со стеклянными капиллярами.
Таблица В.27 - Программа "температура - время" для пластиковых реационных флаконов
Шаг | Параметр | Температура, °С | Время | Измерения флуоресценции | Циклы | |
1 | Начальная денатурация | 95 | 10 мин | Нет | 1 | |
2 | Амплификация | Денатурация | 95 | 15 с | Нет | 45 |
|
| Отжиг и элонгация | 60 | 60 с | Да |
|
Таблица В.28 - Программа "температура - время" для стеклянных капиллярных сосудов
Шаг | Параметр | Температура, °С | Время | Измерения флуоресценции | Циклы | |
1 | Начальная денатурация | 95 | 15 мин | Нет | 1 | |
2 | Амплификация | Денатурация | 95 | 10 с | Нет | 45 |
|
| Отжиг и элонгация | 60 | 15 с | Да |
|
В.8.15.4.5 Критерии приемки или отбраковки
Если по причине атипичного характера данных, полученных в ходе измерений, их автоматическая интерпретация не позволяет получить удовлетворительный результат, то может возникнуть необходимость в целях успешной оценки этих данных предварительно установить базовую линию и пороговое значение вручную. При этом необходимо следовать рекомендациям по работе с программным обеспечением для оценивания данных, предусмотренным в руководстве по эксплуатации соответствующего прибора.
В.8.15.4.6 Идентификация
Целевая последовательность считается обнаруженной, если:
- при использовании специфичных к гену bar праймеров 1RapB-F1 и RapB-R1 и зонда RapB-S1 наблюдается возрастание измеряемого уровня флуоресценции, обусловленное амплификацией;
- в контрольных реакциях при проведении ПЦР без добавления ДНК (контроль реактивов для ПЦР, отрицательный контроль экстракции) не наблюдается возрастание уровня флуоресценции, обусловленное амплификацией;
В.8.16 Идентификация образцов
Все образцы должны быть четко идентифицированы.
В.8.17 Выполнение вычислений
Результаты совместных сличительных испытаний подтверждают заключение о том, что данный метод пригоден для скрининга с целью выявления компонентов ГМО и количественного определения целевой последовательности гена bar. Тем не менее результаты, полученные путем количественной оценки числа копий гена bar, могут быть использованы для определения состава генетически модифицированных материалов только при условии наличия соответствующих сведений о количестве вставок гена bar и степени зиготности видов растений, присутствие которых удается обнаружить в исследуемом образце.
В.9 Обнаружение определенных последовательностей ДНК, часто используемых в генетически модифицированных организмах и принадлежащих вирусу мозаики цветной капусты (промотор CaMV 35S, P35S), а также Agrobacterium tumefaciens (T-nos) в пищевых продуктах. Метод скрининга
В.9.1 Принцип
В настоящем разделе описан порядок параллельного обнаружения последовательностей ДНК промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (P35S) и терминатора гена нопалин-синтазы (T-nos) бактерии Agrobacterium tumefaciens. Поскольку как P35S, так и T-nos, используемые в качестве регулирующих элементов, представлены во многих генетически модифицированных растениях, данный метод может применяться для скрининга ДНК генетически модифицированных организмов в пищевых продуктах. Как правило, анализу с его помощью может быть подвергнут не только любой пищевой продукт, но и продукт иного назначения (например, корма или семена). Применение метода предполагает возможность извлечения из соответствующей матрицы некоторого количества амплифицированной ДНК, достаточного для ее последующего изучения.
С учетом того, что последовательности ДНК P35S и T-nos также могут быть обнаружены в образцах, содержащих ДНК вируса мозаики цветной капусты или ДНК Agrobacterium tumefacien, но не включающих в себя генетически измененных последовательностей ДНК, для подтверждения полученных положительных результатов может потребоваться дополнительный анализ.
В основу представленного метода скринига положены амплификация и обнаружение двух целевых последовательностей ДНК (P35S и T-nos) при проведении одной реакции (так называемая дуплексная ПЦР в реальном времени).
В.9.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.9.2.1 Робастность метода
Робастность метода не контролировалась для случаев с небольшими внесенными изменениями.
_______________
В.9.2.2 Внутри лабораторные испытания
Подробная информация о результатах внутренней аттестации представлена в [62].
В.9.2.3 Совместные сличительные испытания
В.9.2.3.1 Общие положения
Данный метод был аттестован в рамках совместных сличительных испытаний силами рабочей группы "Разработка методов идентификации пищевых продуктов, произведенных с использованием средств генной инженерии" Федерального ведомства по защите прав потребителей и безопасности пищевых продуктов Германии (BVL). Всего в исследовании приняли участие 10 лабораторий (см. [62]). Было использовано 10 различных растворов ДНК или смесей ДНК соответственно (см. таблицы В.30 и В.31). Исследуемая ДНК была выделена из стандартных образцов (серия ERM BF) (IRMM, Гел, Бельгия) с сертифицированными значениями массовой доли 4,29% GA21 (414F) или 0,1% GA21 (414В), 5% MON810 (413F) или 0,1% MON810 (413В), а также 5% Bt11 (412F), 1% Bt11 (412D) и 0,1% Bt11 (412В); кроме того, применялась ДНК, полученная из образца кукурузной муки и испытанная ранее с отрицательным результатом. Растворы с содержанием по массе 0,02%, 0,05% или 2,5% соответственно, упомянутые в таблицах В.30 и В.31 (колонка 1), были получены путем смешивания растворов ДНК, перечисленных выше, из чего следует, что при указании "массовая доля, %" приписанные им значения должны рассматриваться как приблизительные.
Все растворы ДНК были снабжены кодовыми пометками и предоставлены в распоряжение лабораторий-участниц.
Дополнительно для целей количественного определения числа копий P35S и T-nos каждая лаборатория получила серию разбавлений стандартной ДНК, приготовленных с использованием ДНК из сертифицированного стандартного образца Bt11 (ERM BF-412F, массовая доля Bt11 5%) в соответствии с таблицей В.29.
_______________
Каждый образец ДНК подвергался анализу пять раз, таким образом, каждый участник должен был предоставить 50 результатов.
_______________
В.9.2.3.2 Стандартная ДНК для калибровки
Калибровка выполнялась с применением раствора ДНК, содержащего одновременно последовательности P35S и T-nos, например ДНК, полученной из сертифицированного стандартного образца Bt11, а также серии разбавлений, приготовленных на основе этого раствора, включающей в себя разбавления с пятью различными концентрациями (см. таблицу В.29).
Массовая концентрация ДНК определяется спектрометрически. Для кукурузы за основу была принята масса гаплоидного генома, равная 2,73 пг (см. [63]), предполагалась двукратная вставка целевых последовательностей P35S и T-nos в геном кукурузы, а также гетерозиготность материалов ГМО (см. [62]).
Из раствора с 5%-ной массовой долей ДНК Bt11 (основного раствора) приготавливались два разбавления (на основе раствора 0,2х ТЕ), как показано в таблице В.29.
Таблица В.29 - Приготовление серии разбавлений
Уровень | Приготовление | Количество копий ДНК кукурузы на 5 мкл | Количество копий P35S на 5 мкл | Количество копий T-nos на 5 мкл |
S1 | Соответствующее разбавление экстракта ДНК | 50000 | 2500 | 2500 |
S2 | 1 об. S1 + 4 об. 0,2х ТЕ | 10000 | 500 | 500 |
S3 | 1 об. S2 + 1 об. 0,2х ТЕ | 5000 | 250 | 250 |
S4 | 1 об. S3 + 4 об. 0,2х ТЕ | 1000 | 50 | 50 |
S5 | 1 об. S4 + 4 об. 0,2х ТЕ | 200 | 10 | 10 |
В.9.2.3.3 Наклон кривой функции калибровки, эффективность
В отдельных лабораториях при выполнении серии разбавлений наблюдался небольшой эффект ингибирования, прежде всего для системы детектирования T-nos, вследствие чего стандарт S1 не мог быть использован для расчета кривой регрессии. По тенденциям немного лучшую эффективность продемонстрировала система детектирования P35S.
Наименьшая эффективность на уровне 66% для системы T-nos system и 83% для системы P35S соответственно была зафиксирована в одной и той же лаборатории. Тем не менее к рассмотрению были приняты результаты, полученные всеми лабораториями, значения-выбросы не исключались.
В.9.2.3.4 Чувствительность и прецизионность
В таблицах В.30 и В.31 представлены обобщенные сведения об удельном количестве полученных положительных результатов наряду с данными прецизионности для конкретных образцов. Как следует из приведенных значений, концентрация, соответствующая массовой доле Bt11 0,02%, отчетливо распознавалась обеими системами детектирования (50/50 или 49/50 реакций соответственно). Аналогичная ситуация имела место для массовой доли GA21 0,05% или массовой доли MON810 0,05%, в том числе при работе с растворами с высоким содержанием конкурирующей целевой последовательности и в условиях вероятной конкуренции с одной из двух применяемых систем ПЦР (T-nos или P35S соответственно).
В.9.2.3.5 Специфичность
Еще до приготовления отрицательных контролей выяснилось, что все проверенные стандартные образцы с " массовой долей 0%", например образцы с "массовой долей MON810 0%" или "массовой долей GA21 0%", содержали следовые количества последовательностей P35S или T-nos. Подобные материалы могли рассматриваться как обеспечивающие отрицательный результат лишь в сравнении с сертифицированными ГМО, но не с точки зрения присутствия загрязнений, вызванных другими ГМО. С учетом этого обстоятельства лаборатории воспользовались своими собственными образцами смесовой кукурузной муки, для которых уже были подтверждены отрицательные результаты в ходе предшествующих исследований. Однако даже с применением этих образцов в отдельных случаях не удалось полностью избежать получения слабых положительных результатов при проведении ПЦР-анализа. Дальнейшее исследование средствами "одноплексной" ПЦР показало, что образцы с "массовой долей генетически модифицированной кукурузы 0%", "массовой долей GA21 0,05%" и "массовой долей GA21 2,5%" были в небольшой степени загрязнены компонентами, содержащими P35S, а образец с "массовой долей генетически модифицированной кукурузы 0%" также включал в себя компоненты, содержащие T-nos.
Данные наблюдения свидетельствуют о том, что слабые положительные результаты, которые время от времени демонстрировались контрольными пробами, должны рассматриваться как ложно-положительные и что их появление было обусловлено не недостатками применяемого метода, а качеством используемых материалов.
В.9.2.3.6 Степень извлечения и правильность
Лабораториям были переданы экстракты ДНК, содержание референсного гена кукурузы в которых было предварительно приведено к значению, приблизительно соответствующему 50000 копий из расчета на одну исследуемую пробу (см. таблицу В.29). Процентное содержание последовательностей P35S или T-nos соответственно по отношению к референсному гену кукурузы отражено в колонках "Среднее значение" и "Стандартное отклонение" таблиц В.30 и В.31. Для массовых долей Bt11 0,1% и 1,0% отношение в размере 0,11% или 0,94% соответственно было измерено с применением системы P35S; при использовании системы T-nos полученное отношение составило 0,07% или 0,81% соответственно.
Точное количественное определение содержания MON810 или GA21 в рамках совместных сличительных испытаний, использующих выбранную схему испытаний, не представлялось возможным, ввиду того что в качестве стандарта для количественного определения использовалась ДНК, полученная из Bt11. Такие факторы, как различная частота вставки последовательностей P35S или T-nos по сравнению с Bt11 или различная зиготность или плоидность стандартных образцов, применявшихся для приготовления стандартных растворов ДНК, могут служить причиной получения несогласованных результатов. Поэтому значения, приведенные для соответствующих образцов в таблицах В.30 и В.31, заключены в скобки.
В.9.2.3.7 Заключительная оценка
Имеющиеся данные подкрепляют вывод о том, что описанный метод может быть использован для полуколичественного скрининга с целью выявления компонентов ГМО.
В.9.2.4 Молекулярная селективность
В.9.2.4.1 Общие положения
В.9.2.4.1.1 Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (P35S)
Таблица В.30 - Результаты совместных сличительных испытаний для оценки системы детектирования P35S
Система детектирования P35S | Средняя эффективность: 93% (от 83% до 99%) | |||||
Стандартный образец - | Отношение количества | Значения | Количество копий P35S | |||
генетически модифицированная кукуруза (заданное значение), % массовой доли | положительных результатов к общему количеству результатов | Среднее Значение | Стандартное отклонение | Среднее значение | Стандартное отклонение |  , % , % |
0,02% Bt11 (P35S-пол.) | 50/50 | 36,4 | 1,0 | 13 | 4,8 | 38 |
0,1% Bt11 (P35S-пол.) | 50/50 | 34,1 | 0,5 | 56 | 15 | 27 |
1,0% Bt11 (P35S-пол.) | 50/50 | 30,8 | 0,6 | 470 | 72 | 15 |
2,5% MON810 (P35S-пол.) | 50/50 | 29,4 | 0,6 | (1,170) | (116) | 10 |
0,05% MON810 (P35S-пол.) | 50/50 | 34,4 | 0,8 | (29) | 9,4 | 32 |
2,5% GA21 (P35S-отр.) | 7/50  | - (  36) | - | - | - | - |
0,05% GA21 (P35S-отр.) | 10/50 | -
( 38) | - | - | - | - |
0,05% MON810+2,5% GA21 (P35S-отр.) | 50/50 | 34,5 | 5,0 | (43) | (18) | 42 |
2,5% MON810 + 0,05% GA21 (P35S-отр.) | 50/50 | 29,4 | 0,6 | (1,192) | (152) | 13 |
0% генетически модифицированной кукурузы | 10/50  | -
( 38) | - | - | - | - |
Сноски а)-е) и примечания к таблице В.31 применяются также к настоящей таблице. | ||||||
Таблица В.31 - Результаты совместных сличительных испытаний для оценки системы детектирования T-nos
Детектирование T-nos | Средняя эффективность: 102% (от 66% до 120%) | |||||
Стандартный образец - | Отношение количества | Значения | Количество копий T-nos | |||
генетически модифицированная кукуруза (заданное значение) массовая доля, % | положительных результатов к общему количеству результатов | Среднее значение | Стандартное отклонение | Среднее значение | Стандартное отклонение | , % , % |
0,02% Bt11 (T-nos -пол.) | 49/50 | 37,6 | 1,4 | 5,7 | 3,5 | 61 |
0,1% Bt11 (T-nos-пол.) | 50/50 | 34,7 | 0,9 | 37 | 13 | 35 |
1,0% Bt11 (T-nos-поп.) | 50/50 | 31,2 | 0,7 | 404 | 101 | 25 |
2,5% MON810 (T-nos-отр.) | 0/50 | - | - | - | - | - |
0,05% MON810 (T-nos-отр.) | 0/50 | - | - | - | - | - |
2,5 % GA21 (T-nos-пол.) | 50/50 | 27,9 | 4,2 | (4,500) | (1,722) | 38 |
0,05 % GA21 (T-nos-пол.) | 50/50 | 33,6 | 0,9 | (81) | (23) | 28 |
0,05% MON810 + 2,5 % GA21 (T-nos-отр.) | 50/50 | 27,8 | 4,1 | (4,650) | (1,850) | 40 |
2,5% MON810 + 0,05 % GA21 (T-nos-отр.) | 50/50 | 33,9 | 1,0 | (69) | (27) | 40 |
0% генетически модифицированной кукурузы | 5/50 | ( 39) | - | - | - | - |
Результаты со значением  40 рассматривались как отрицательные. Среднее значение. Стандартное отклонение. Коэффициент вариации в условиях воспроизводимости. В некоторых лабораториях при проведении ПЦР-анализа отдельных образцов наблюдались слабые признаки амплификации (например, в 1 или 2 из 5 реакций). Значения в скобках: данные носят исключительно справочный характер; оценка правильности не представляется возможной, поскольку количественное определение осуществлялось на основе стандартных разбавлений Bt11. | ||||||
Перечень генетически измененных растительных культур, содержащих промотор CaMV 35S, представлен в [64], [68]. Все разновидности ДНК, предназначенные для исследования в процессе указанных испытаний на специфичность метода, были проверены на способность к амплификации и на влияние ингибиторов при помощи методов, специфичных к таксону, до начала их применения (данные не приводятся).
Получение ложноположительного результата может быть связано с тем, что амплифицируемая последовательность принадлежит вирусу мозаики цветной капусты, который может заражать не только цветную капусту, но и другие растения семейства капустных (крестоцветных), а также семейств резедовых и пасленовых (см. [65], [66]). Соответственно, положительные результаты для образцов, которые были выделены из растений семейств крестоцветных, резедовых и пасленовых, необходимо использовать с осторожностью. Притом что положительные результаты могут указывать на присутствие продуктов из генетически модифицированных растений, их не следует интерпретировать как убедительное доказательство подобного присутствия без соответствующего подтверждения.
Для дифференцирования вирусной инфекции и генетически модифицированного материала могут использоваться специализированные методы обнаружения вируса мозаики цветной капусты (см. [67]).
См. ISO 21570:2005 [43] (приложение В.1).
В.9.2.4.1.2 Терминатор гена нопалин-синтазы (T-nos) Agrobacterium tumefaciens
Ложноположительный результат в данном случае возможен ввиду того, что амплифицируемая последовательность позаимствована у Agrobacterium tumefaciens, почвенных бактерий, распространенных в природе. Притом что положительные результаты могут указывать на присутствие продуктов из генетически модифицированных растений, их дальнейшая интерпретация нежелательна без соответствующего подтверждения. Необходимо учитывать возможность загрязнения исследуемого материала Agrobacterium tumefaciens или родственными им видами бактерий.
В.9.2.4.2 Теоретическая часть
В.9.2.4.3 Экспериментальная часть
В.9.2.4.3.1 Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (P35S)
См. ISO 21570:2005 [43] (приложение В.1).
Уточненные сведения о генетически модифицированных растениях, поддающихся или не поддающихся выявлению по методу P35S, даны в [68], см. также [53].
В.9.2.4.3.2 Терминатор гена нопалин-синтазы (T-nos) Agrobacterium tumefaciens
Для следующих генетически модифицированных растений была экспериментально доказана пригодность метода для определения гена T-nos к использованию для целей скрининга:
- генетически модифицированный рис Bt63;
- генетически модифицированная папайя SunUp (55-1);
- генетически модифицированные томаты Zeneca.
Уточненные сведения о генетически модифицированных растениях, поддающихся или не поддающихся выявлению по методу T-nos, даны в [68], см. также [53].
В.9.3 Принцип и выводы
_______________
При использовании метода скрининга P35S и/или T-nos для подтверждения положительных результатов в последующем требуется проведение дополнительного анализа.
В.9.4 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения согласно ISO 5725-1 [40] и ISO 24276.
В.9.5 Типы и количество образцов
Репрезентативность испытуемого образца по отношению к лабораторному образцу может обеспечиваться, например, путем размола или гомогенизации. Порядок выполнения измерений и пошаговые процедуры, которым необходимо следовать, описаны в ISO 21571.
В.9.6 Предел обнаружения и диапазон применения
Метод проверялся с использованием образцов, содержащих малое количество копий последовательности промотора 35S и терминатора T-nos (см. таблицы В.30 и В.31).
Во всех образцах, которые содержали целевую последовательность P35S в количестве порядка 10 копий, ее присутствие было успешно установлено. Подобный итог позволяет судить о соответствующем пределе обнаружения метода. Аналогичные результаты наблюдались в интервале значений от 25 до 1500 копий. Оценивание выполнялось на основе данных о результатах, полученных с применением стандартной серии разбавлений ДНК, которые используются при калибровке.
Были также определены 49 из 50 образцов, содержащих целевую последовательность T-nos в количестве порядка 50 копий, что дает представление о пределе обнаружения метода для второй последовательности. Кроме того, искомая последовательность была успешно обнаружена во всех образцах, содержащих от 25 до 1500 T-nos. Оценивание выполнялось на основе данных о результатах, полученных с применением стандартной серии разбавлений ДНК, которые используются при калибровке.
В.9.7 Расчет неопределенности измерения
В рамках совместных сличительных испытаний выполнялась оценка неопределенности. Результаты оценки представлены в В.9.2.3.4.
В.9.8 Помехи
Количество, качество, а также способность к амплификации матрицы нуклеиновых кислот оказывают непосредственное влияние на получаемый аналитический результат (см. ISO 21571). Отсюда следует необходимость контроля нуклеиновых кислот, используемых для анализа, например, с применением специфичного к целевому таксону метода ПЦР.
В.9.9 Физические условия и условия окружающей среды
Подробнее см. в ISO 24276.
В.9.10 Инструменты и оборудование
Подробные сведения об оборудовании и материалах см. в разделах 5 и 6, а также в приложении ISO 21570 [43]. Используется обычное оборудование для лаборатории молекулярной биологии, в частности следующее.
В.9.10.1 Инструменты и оборудование для выделения ДНК
В.9.10.1.1 Центрифуга, позволяющая обрабатывать реакционные флаконы вместимостью 1,5 и 2 мл при 14500g.
В.9.10.2 Инструменты и оборудование для проведения ПЦР в реальном времени
В.9.10.2.1 Амплификатор, оборудованный:
- источником энергии, предназначенным для возбуждения флуоресцентных молекул;
- оптической системой детектирования, пригодной для обнаружения флуоресцентных сигналов, генерируемых в процессе ПЦР.
В.9.10.2.2 Реакционные сосуды с пробками или крышками, способные выдерживать поочередное нагревание до 100°С и охлаждение до 4°С без разрушения и не оказывающие влияния на флуоресцентные сигналы, которые генерируются в процессе амплификации.
В.9.11 Реактивы и материалы
Если не указано иное, используются только реактивы, отвечающие требованиям ISO 24276, и только вода категории "для молекулярной биологии" или сопоставимой степени чистоты.
В.9.12 Отбор, транспортировка, консервация и хранение образцов
Растворы ДНК могут храниться при температуре 4°С в течение не более чем 1 нед или при температуре минус 20°С в течение более длительного времени.
В.9.13 Пробоподготовка
См. ISO 21571.
В.9.14 Калибровка оборудования
Приборы (например, амплификаторы) подлежат калибровке, как описано в ISO/IEC 17025 [41].
В.9.15 Этапы проведения анализа
В.9.15.1 Общие положения
Перед началом анализа ДНК экстрагируется из испытуемого образца с применением соответствующего метода (см. ISO 21571). Анализ включает в себя:
a) проверку количества, качества и амплифицируемости выделенной ДНК, например, с применением специфичного к целевому таксону метода ПЦР (см. ISO 21570 [43]);
b) обнаружение последовательностей P35S и T-nos посредством дуплексного ПЦР-анализа в реальном времени.
При использовании метода скрининга P35S и/или T-nos для подтверждения положительных результатов в последующем требуется проведение дополнительного анализа.
В.9.15.2 Приготовление экстрактов ДНК
При выделении ДНК из испытуемого образца должны соблюдаться общие инструкции и меры, описанные в ISO 21571. Рекомендуется выбирать для выделения ДНК методы, представленные в ISO 21571:2005 (приложение А).
В.9.15.3 Реактивы для ПЦР
В.9.15.3.1 Общие положения
Могут использоваться готовые смеси реактивов или их отдельные компоненты.
В.9.15.3.2 Термостабильная ДНК-полимераза (для горячего старта ПЦР).
В.9.15.3.4 Олигонуклеотиды
См. таблицу В.32.
Таблица В.32 - Олигонуклеотиды
Название | Последовательность ДНК олигонуклеотида |
P35S в качестве целевой последовательности (ISO 21570 [43]) | |
35S-F | 5’-gCC TCT gCC gAC AgT ggT-3’ |
35S-R | 5’-AAg ACg Tgg TTg gAA CgT CTT c-3’ |
35S-TMP FAM | 5’-(FAM)-CAM)-CAM)-C AM)-CCC AM)-CAM)-C(BHQ1)-3’ |
T-nos в качестве целевой последовательности (см. [72], [73]) | |
180-F | 5’-CAT gTA ATg CAT gAC gTT ATT TAT g-3’ |
180-R | 5’-TTg TTT TCT ATC gCg TAT TAA ATg T-3’ |
Tm-180 | 5’-(YY)-ATg ggT TTT TATg gT TATg gT CCC gCATg gBHQ1)-3’ |
FAM - 6-карбоксифлуоресцеин; YY - допускается использование иных аналогичных репортерных красителей и/или тушителей, если они достоверно обеспечивают получение лучших или таких же результатов. | |
В.9.15.4 Методика испытания
В.9.15.4.1 Порядок проведения ПЦР
Описываемая методика предназначена для работы с общим объемом 25 мкл из расчета на каждую ПЦР, с использованием реактивов, перечисленных в таблице В.33.
Таблица В.33 - Набор реактивов для проведения дуплексной ПЦР в реальном времени
Реактив | Конечная концентрация | Объем на реакцию мкл |
Буферный раствор для ПЦР (с , dNTPs и ДНК-полимеразой) | 1х | 12,5 |
Праймер 35S-F, с =2 мкмоль/л | 100 нмоль/л | 1,25 |
Праймер 35S-R, с =2 мкмоль/л | 100 нмоль/л | 1,25 |
Зонд 35S-TMP FAM, с =2 мкмоль/л | 100 нмоль/л | 1,25 |
Праймер 180-F, с =20 мкмоль/л | 1 нмоль/л | 1,25 |
Праймер 180-R, с =20 мкмоль/л | 1 нмоль/л | 1,25 |
Зонд ТМ-180 YY, с =4 мкмоль/л | 200 нмоль/л | 1,25 |
Экстракт ДНК (образец или стандарт ДНК) | До 200 нг | 5 |
Общий реакционный объем | -/- | 25 |
При проведении совместных сличительных испытаний в качестве буферного раствора для ПЦР использовалась универсальная исходная смесь TaqMan (Applied Biosystems, Дармштадт). Допускается использование иных аналогичных изделий других изготовителей, если они достоверно обеспечивают получение лучших или таких же результатов. Если в буферном растворе для проведения ПЦР реализована система предотвращения загрязнений при переносе материалов, основанная на действии фермента урацил-N-гликозилазы (UNG), в программе "температура - время" должен быть предусмотрен дополнительный этап для активации UNG. (Applied Biosystems, Дармштадт). Допускается использование иных аналогичных изделий других изготовителей, если они достоверно обеспечивают получение лучших или таких же результатов. Если в буферном растворе для проведения ПЦР реализована система предотвращения загрязнений при переносе материалов, основанная на действии фермента урацил-N-гликозилазы (UNG), в программе "температура - время" должен быть предусмотрен дополнительный этап для активации UNG. Могут применяться другие рабочие концентрации. В ходе совместных сличительных испытаний применялись растворы ДНК, содержащие приблизительно 50000 копий геномной ДНК кукурузы из расчета на исследуемую часть образца. | ||
_______________
В.9.15.4.2 Контроли ПЦР
Следует использовать соответствующие цели исследованию контроли согласно ISO 24276.
В.9.15.4.3 Подготовка стандартов
Требования к приготовлению стандартов изложены в В.9.2.3.2.
В.9.15.4.4 Программа "температура - время"
При использовании описываемой процедуры ПЦР программа "температура - время", представленная в таблице В.34, подтвердила свою применимость для работы с пластиковыми реакционными флаконами.
Таблица В.34 - Программа "температура - время"
Шаг | Параметр | Температура, °С | Время | Измерения флуоресценции | Циклы | |
1 | Активация UNG (если предусмотрена) | 50 | 2 мин | нет | 1 | |
2 | Начальная денатурация | 95 | 10 мин | нет | 1 | |
3 | Амплификация | Денатурация | 95 | 15 с | нет | 45 |
|
| Отжиг и элонгация | 60 | 60 с | да |
|
В.9.15.4.5 Критерии приемки или отбраковки
Если по причине атипичного характера данных, полученных в ходе измерений, их автоматическая интерпретация не позволяет получить удовлетворительный результат, то может возникнуть необходимость в целях успешной оценки этих данных предварительно установить базовую линию и пороговое значение вручную. В этом случае должны выполняться специальные указания по работе с программным обеспечением для оценивания данных, приведенные в руководстве по эксплуатации соответствующего прибора.
В.9.15.4.6 Идентификация
Целевые последовательности считаются обнаруженными, если:
- при использовании праймеров 35S-F и 35S-R, специфичных к P35S, и зонда 35S-TMP наблюдается возрастание измеряемого уровня флуоресценции, обусловленное амплификацией;
- при использовании праймеров 180-F H180-R, специфичных к T-nos, и зонда Tm-180 наблюдается возрастание измеряемого уровня флуоресценции, обусловленное амплификацией;
- в контрольных реакциях ПЦР без добавления ДНК (контроль реактивов для ПЦР, отрицательный контроль экстракции) не наблюдается возрастание уровня флуоресценции, обусловленное амплификацией;
В.9.16 Идентификация образцов
Все образцы должны быть четко идентифицированы.
В.9.17 Выполнение вычислений
Имеющиеся данные подкрепляют вывод о том, что описанный метод может быть использован для полуколичественного скрининга с целью выявления компонентов ГМО.
Разделы В.6-В.9 (Введены дополнительно, Изм. N 1).
Приложение С
(справочное)
Методы, специфичные к генетической конструкции
С.1 Специфичный к генетической конструкции метод обнаружения модифицированных последовательностей ДНК из генетически модифицированной сои GTS 40-3-2 (соевые бобы RoundUp Ready®)
С.1.1 Общие положения
_______________
Эта конструкция используется и в других ГМО.
Этот метод невозможно использовать для разделения сои линии GTS 40-3-2 и селекционных сортов со сложным геномом, полученных при скрещивании сои GTS 40-3-2 и других модифицированных линий сои, за исключением применения метода на отдельных зернах и на растениях, для которых можно подтвердить наличие/отсутствие последовательностей, происходящих от других трансформационных событий.
С.1.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
С.1.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод был метрологически аттестован в совместном сличительном испытании [8], проведенном под руководством рабочей группы "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV). Количество участников, а также количество образцов устанавливали в соответствии с критериями ISO 5725-2. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3 (однако вес анализируемой части образца составлял 100 мг).
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице С.1.
Таблица С.1 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1998 |
Количество лабораторий | 25 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 24 |
Количество образцов на лабораторию | 5 |
Количество принятых результатов | 105 |
Количество образцов, содержащих сою линии GTS 40-3-2 | 56 |
Количество образцов, содержащих немодифицированную сою | 49 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
С.1.2.2 Молекулярная специфичность
С.1.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевой последовательности, описанной в ссылке [8]. Информация о генетической конструкции, внесенной в геном сои, приводится в ссылке [31].
С.1.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (база данных GenBank®, BlastN® 2.2.1, по состоянию на 1 июля 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированными линиями сои, а также с другими сельскохозяйственными растениями. Более того, набор праймеров был подобран для амплификации специфической последовательности ДНК, присутствующей только в искусственной, не встречающейся в природе области стыка.
С.1.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированных соевых бобов, картофеля, томатов, кукурузы и сахарной свеклы [32] или генетически модифицированных линий кукурузы Event 176 (Bt 176), Bt 11, Т 25 и MON 810, не наблюдали амплификации.
С.1.2.3 Предел обнаружения
Относительный предел обнаружения определили как равный или больший массовой фракции 0,1% соевых бобов в соевой муке (сертифицированный образец стандартного состава IRMM-410R, произведенный IRMM, Гиль, Бельгия) [9]. Было также показано, что с помощью этого метода возможно обнаружить 0,45% GTS 40-3-2 в соевой муке после выпечки [33].
С.1.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
С.1.4 Принцип
Устойчивость сои GTS 40-3-2 к глифосату обеспечивается внедрением в геном генетической конструкции, кодирующей 5-энолпирувилшикимат-3-фосфат синтаза (EPSPS) из штамма СР4 Agrobacterium sp, входящей в состав последовательности белка - переносчика хлоропласта из Petunia hybrida (сигнальная последовательность переноса, СТР, служит для переноса EPSPS в хлоропласты). Глифосат ингибирует EPSPS в растениях. Принцип метода заключается в амплификации путем ПЦР фрагмента ДНК длиной 172 п.н., охватывающего стык между последовательностью промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и последовательностью СТР, с последующим обнаружением с помощью электрофореза в агарозном геле.
С.1.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
С.1.5.1 Вода
С.1.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP = 2,5 ммоль/л (каждого).
С.1.5.5 Олигонуклеотиды
С.1.5.5.1 Прямой праймер
35s-f2: 5’-TgA TgT gAT АТС ТСС ACT gAC g-3’.
Позиции N (база данных GenBank®) V00141, J02048.
С.1.5.5.2 Обратный праймер
petu-r1: 5’-TgT АТС ССТ TgA gCC ATg TTg Т-3’.
Позиции N (база данных GenBank®) М21084, J03227.
С.1.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
С.1.5.7 Зонд для гибридизации
H-35s-ar1: 5’-ggg ТСТ TgC gAA ggA TAg Tg-3’.
С.1.5.9 Раствор для гибридизации, содержащий 10 пмоль зонда для гибридизации в 2,5 мл прегибридизационного раствора (С.1.5.8). Температура гибридизации - 50°С. Дополнительная информация по условиям гибридизации приводится в [12].
С.1.6 Оборудование
С.1.6.1 Амплификатор
С.1.6.2 Камера для электрофореза, с источником питания.
С.1.6.3 Прибор для гибридизации
С.1.7 Процедура анализа
С.1.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице С.2. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице С.2.
Таблица С.2 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 1 |
Вода |
| 15,9 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,8 ммоль/л | 2 |
Праймер 35s-f2, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
Праймер petu-r1, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 0,5 IU | 0,1 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 1,5 ммоль/л. | ||
С.1.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава GTS 40-3-2 (материал, содержащий 0,1% компонентов генетически модифицированных растений), производимые Институтом референсных материалов и измерений (IRMM), Гиль, Бельгия (IRMM-410).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
С.1.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица С.3 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 30 с/95°С |
| 30 с/60°С |
| 25 с/72°С |
Количество циклов | От 35 до 40 |
Завершающая полимеризация | 3 мин/72°С |
С.1.8 Специфичность продукта ПЦР
Проверка специфичности амплифицированного продукта может быть выполнена с помощью гибридизации по Саузерну с использованием меченного флуоресцеином зонда H-35s-ar1 (С.1.5.7-С.1.5.9). Немодифицированные образцы должны дать отрицательные результаты в таком гибридизационном анализе [8].
С.1.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных образцов стандартного состава сои линии GTS 40-3-2 (например, из серии стандартов IRMM-410 производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в С.1.8.
Обнаружение фрагментов с размером 172 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК из сои линии GTS 40-3-2 в пределах установленных параметров специфичности, описанных в С.1.2.2. Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
С.2 Специфичный к генетической конструкции метод обнаружения модифицированных последовательностей ДНК из генетически модифицированных томатов (Zeneca® 282F)
С.2.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения генетически модифицированных томатов с замедленным созреванием в сырье путем амплификации области стыка между элементами последовательностей однокопийного гена из Agrobacterium tumefaciens (терминатор NOS) и гена полигалактуроназы (PG) из Lycopersicon esculentum Mill, соединенных путем рекомбинации in vitro.
Эта конструкция может быть в будущем использована и в других ГМО.
Этот метод невозможно использовать для разделения томатов Zeneca 282F и селекционных сортов со сложным геномом, полученных при скрещивании Zeneca 282F и других модифицированных линий томатов, за исключением применения метода на отдельных зернах и на растениях, для которых можно подтвердить наличие/отсутствие последовательностей, происходящих от других событий трансформации.
С.2.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
С.2.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод был метрологически аттестован в совместном сличительном испытании [15], проведенном под руководством рабочей группы "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV). Количество участников, а также количество образцов устанавливали в соответствии с критериями ISO 5725-2. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3 (однако вес анализируемой части образца составлял 100 мг).
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице С.4.
Таблица С.4 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1999 |
Количество лабораторий | 18 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 18 |
Количество образцов на лабораторию | 5 |
Количество принятых результатов | 90 |
Количество образцов, содержащих генетически модифицированные томаты (Zeneca 282F) | 43 |
Количество образцов, содержащих немодифицированные томаты (Zeneca 282С) | 47 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
С.2.2.2 Молекулярная специфичность
С.2.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод описан в ссылках [15] и [16]. Информация о генетической конструкции, внесенной в геном томатов, приводится в ссылке [18].
С.2.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (база данных GenBank®, BlastN® 2.2.1, по состоянию на 1 июля 2001 г.) не обнаружил существенной гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированными томатами, а также с другими сельскохозяйственными растениями. Более того, набор праймеров был подобран для амплификации специфической последовательности ДНК, присутствующей только в искусственной, не встречающейся в природе области стыка.
С.2.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированных томатов со сходными фенотипами: томаты Long-Life типа Selfesta F1, Seduro F1, Lioba F1 и Harzglut F1 (производство семенного материала Quedlinburg, Германия) [15], не наблюдали амплификацию.
С.2.2.3 Предел обнаружения
С.2.3 Адаптация
_______________
С.2.4 Принцип
Особенностью генетически модифицированных томатов (Lycopersicon esculentum Mill), разработанных компанией Zeneca, является замедленное созревание плода, обусловленное ингибированием продукции полигалактуроназы (PG).
Генетическая модификация в этих томатах заключается во внедрении в геном дополнительного неполного гена полигалактуроназы (PG) в качестве кДНК. Наличие этого гена приводит к резкому снижению количества эндогенного фермента полигалактуроназы томатов. Этот фермент играет принципиальную роль в созревании томатов [17].
Принцип метода заключается в амплификации путем ПЦР фрагмента ДНК длиной 350 п.н., охватывающего искусственный стык между сегментом фрагмента кДНК гена PG и соседней последовательностью терминатора NOS. Такая комбинация присутствует только в генетически модифицированных томатах. Полученный продукт ПЦР может быть обнаружен с помощью электрофореза в агарозном геле. Проверка специфичности продукта ПЦР может быть выполнена с помощью описанного далее специфичного гибридизационного зонда.
С.2.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
С.2.5.1 Вода
С.2.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
С.2.5.5 Олигонуклеотиды
С.2.5.5.1 Прямой праймер
PG34L: 5’-ggA ТСС ТТА gAA gCA ТСТ AgT-3’.
Позиция N Х04583.
С.2.5.5.2 Обратный праймер
t-NOS: 5’-САТ CgC AAg АСС ggC ААС Ag-3’.
Позиция N NC002147.
С.2.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
С.2.5.7 Зонд для гибридизации, Tomate-2
Меченный дигоксигенином ДНК зонд (Tomate-2) имеет следующую последовательность:
5’-Dig-CCT СТА gAg Tcg АСС TgC Agg TCg -3’.
С.2.5.9 Раствор для гибридизации, содержащий 10 пмоль зонда для гибридизации в 2,5 мл прегибридизационного раствора (С.2.5.8).
Температура гибридизации - 60°С. Дополнительная информация по условиям гибридизации приводится в ссылке [12].
С.2.5.10 Рестриктаза: Еае I или Mwo I.
С.2.6 Оборудование
В соответствии с С.1.6.
С.2.7 Процедура анализа
С.2.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице С.5. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице С.5.
Таблица С.5 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 0,5 |
Вода |
| 17,3 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,4 ммоль/л | 1,0 |
Праймер PG34L, 10 мкмоль/л | 0,4 мкмоль/л | 1,0 |
Праймер t-NOS, 10 мкмоль/л | 0,4 мкмоль/л | 1,0 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 1 IU | 0,2 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 1,5 ммоль/л. | ||
С.2.7.2 Контроли ПЦР
_______________
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
С.2.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица С.6 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 30 с/94°С |
| 60 с/60°С |
| 60 с/72°С |
Количество циклов | 35 |
Завершающая полимеризация | 6 мин/72°С |
С.2.8 Специфичность продукта ПЦР
Проверка специфичности амплифицированного продукта может быть выполнена с помощью гибридизации по Саузерну с использованием меченного дигоксигенином зонда Tomate-2 (С.2.5.7-С.2.5.9). Немодифицированные образцы должны дать отрицательные результаты в таком гибридизационном анализе.
Специфичность амплифицированного продукта может быть проверена с помощью рестрикционного анализа с использованием ферментов Еае I или Mwo I. Рестрикция ферментом Еае I дает два фрагмента длиной 126 и 224 п.н. соответственно. Рестрикция ферментом Mwo I дает три фрагмента длиной 8, 164 и 178 п.н. соответственно.
С.2.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из соответствующих референсных материалов.
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в С.2.8.
Обнаружение фрагментов с размером 350 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК из генетически модифицированных томатов Zeneca в пределах установленных параметров специфичности, описанных в С.2.2.2. Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
С.3 Специфичный к генетической конструкции метод обнаружения модифицированных последовательностей ДНК из генетически модифицированной кукурузы Bt 11
С.3.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения генетически модифицированной кукурузы Bt 11, производящей токсин Bacillus thuringiensis (компания Syngenta, ранее Novartis), в сырье путем амплификации области стыка между элементами последовательностей однокопийного гена из adh 1S-lntron2 (IVS2) кукурузы и гена pat из Streptomyces viridochromogenes.
Эта конструкция может быть в будущем использована и в других ГМО.
Этот метод невозможно использовать для разделения кукурузы Bt 11 и селекционных сортов со сложным геномом, полученных при скрещивании кукурузы Bt 11 и других модифицированных линий кукурузы, за исключением применения метода на отдельных зернах и на растениях, для которых можно подтвердить наличие/отсутствие последовательностей, происходящих от других событий трансформации.
С.3.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
С.3.2.1 Совместные сличительные испытания
_______________
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице С.7.
Таблица С.7 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 2000 |
Количество лабораторий | 18 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 16 |
Количество образцов на лабораторию | 6 |
Количество принятых результатов | 96 |
Количество образцов, содержащих кукурузу Bt 11 | 32 |
Количество образцов, содержащих кукурузу Event 176 | 32 |
Количество образцов, содержащих немодифицированную кукурузу | 32 |
Ложноположительные результаты | 3 (5%) |
Ложноотрицательные результаты | 3 (10%) |
Кроме того, 14 лабораторий дополнительно получили образцы ДНК, выделенные из генетически модифицированной кукурузы Bt 11 и содержащие 50; 5; 0,5 и 0,05 нг. Результаты исследования приводятся в таблице В8 [20].
Таблица С.8 - Результаты совместных сличительных испытаний
Количество ДНК | Результаты | Примечание | |
| Правильно | Неправильно |
|
50 нг | 14 | - |
|
5 нг | 14 | - |
|
0,5 нг | 12 | 1 | Ложноотрицательный |
|
| 1 | Спорный |
0,05 нг | 7 | 5 | Ложноотрицательный |
|
| 2 | Спорный |
С.3.2.2 Молекулярная специфичность
С.3.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Информация о генетической конструкции, внесенной в геном кукурузы, приводится в ссылке [34]. Конструкция ДНК- это конструкция, описанная в доступе N AR110602 базы данных EMBL/GenBank® (конструкция запатентована) и содержащая те же элементы и в том же порядке, что и конструкция для Bt 11.
С.3.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (база данных GenBank®, BlastN® 2.2.1, по состоянию на 1 июля 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированной кукурузой, а также с другими сельскохозяйственными растениями. Более того, набор праймеров был подобран для амплификации специфической последовательности ДНК, присутствующей только в искусственной, не встречающейся в природе области стыка.
С.3.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированной кукурузы или генетически модифицированной сои GTS 40-3-2 (соя RoundUp Ready®) или кукурузы линий Event 176 (Bt 176), Т 25 и MON 810, не наблюдали амплификации.
Количество целевых последовательностей равно одному.
С.3.2.3 Предел обнаружения
С.3.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
С.3.4 Принцип
Ген Bt присутствует в почвенной бактерии Bacillus thuringiensis; белок, синтезируемый в генетически модифицированном растении с внесенным геном Bt, защищает растение от поражения личинками европейского зернового сверлильщика. Белок Bt активизируется в кишечнике этих насекомых, приводя к образованию пор в мембране клетки, что вызывает нарушение осмотического баланса и лизис клеток.
Ген pat присутствует в почвенной бактерии Streptomyces viridochromogenes и кодирует фермент фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазу, которая обеспечивает устойчивость растения к гербициду (к глюфосинату аммония). Глюфосинат аммония нарушает синтез глютамина в растениях. Принцип метода заключается в амплификации путем ПЦР фрагмента ДНК длиной 189 п.н., охватывающего стык между adh интроном IVS2 и последовательностью гена pat. Полученный продукт ПЦР может быть обнаружен с помощью электрофореза в агарозном геле. Проверка специфичности продукта ПЦР может быть выполнена с помощью описанного далее специфичного зонда для гибридизации.
С.3.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
С.3.5.1 Вода
С.3.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
С.3.5.5 Олигонуклеотиды
С.3.5.5.1 Прямой праймер
Интрон IVS2-2: 5’-CTg ggA ggC САА ggT АТС ТАА Т-3’.
Позиция N AR110602.
С.3.5.5.2 Обратный праймер
Кодирующий участок белка PAT, РАТ-В: 5’-gCT gCT gTA gCT ggC СТА АТС Т-3’.
Позиция N AR110602.
С.3.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
С.3.5.7 Зонд для гибридизации, 5’-меченый (например, дигоксигенином) зонд Bt: 5’-ТАТ CTg ТСТ CAg ggg CAg ACT С-3’, концентрация = 20 мкмоль/л.
С.3.5.9 Раствор для гибридизации, содержащий 10 пмоль зонда для гибридизации в 2,5 мл прегибридизационного раствора (С.3.5.7). Температура гибридизации - 60°С. Дополнительная информация по условиям гибридизации приводится в ссылке [12].
С.3.5.10 Рестриктаза
Hinf I.
С.3.6 Оборудование
В соответствии с С.1.6.
С.3.7 Процедура анализа
С.3.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице С.9. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице С.9.
Таблица С.9 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 1 |
Вода |
| 15,8 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 2 ммоль/л | 2,0 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,4 ммоль/л | 1,0 |
Праймер IVS2-2, 10 мкмоль/л | 0,5 мкмоль/л | 1,25 |
Праймер РАТ-В, 10 мкмоль/л | 0,5 мкмоль/л | 1,25 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 1 IU | 0,2 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 2 ммоль/л. | ||
С.3.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава, например материал, содержащий 1% генетически модифицированной кукурузы Bt 11, производства Института референсных материалов и измерений (IRMM), Гиль, Бельгия (IRMM-412).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
С.3.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица С.10 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 12 мин/95°С |
Амплификация | 30 с/95°С |
| 30 с/64°С |
| 30 с/72°С |
Количество циклов | 38 |
Завершающая полимеризация | 10 мин/72°С |
С.3.8 Специфичность продукта ПЦР
Проверка специфичности амплифицированного продукта может быть выполнена с помощью гибридизации по Саузерну с использованием меченного дигоксигенином зонда Bt (С.3.5.7-С.3.5.9). Немодифицированные образцы должны дать отрицательные результаты в таком гибридизационном анализе [20].
Специфичность амплифицированного продукта может быть проверена с помощью рестрикционного анализа с использованием фермента Нinf I. Рестрикция этим ферментом дает два фрагмента длиной 116 и 73 п.н. соответственно [20].
С.3.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных референсных материалов, приготовленных из кукурузы Bt 11 (например, серия IRMM-412, производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в С.3.8.
Обнаружение фрагментов с размером 118 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК из генетически модифицированной кукурузы Bt 11 в пределах установленных параметров специфичности, описанных в С.3.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, приложение В.2.
С.4 Специфичный к генетической конструкции метод обнаружения модифицированных последовательностей ДНК из генетически модифицированной кукурузы Event 176 (кукуруза Bt 176)
С.4.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения генетически модифицированной кукурузы Event 176 (производства Syngenta) в сырье и переработанных продуктах путем амплификации искусственной области стыка между двумя копиями генетической конструкции, перенесенной в геном растения. Целью модификации кукурузы был синтез токсина Bt (типа crylA(b)) из Bacillus thuringiensis путем вставки синтетического гена Bt, регулируемого промотором CPDK из Zea mays.
Эта конструкция может быть в будущем использована и в других ГМО.
Этот метод не позволяет распознавать селекционные сорта со сложным геномом, за исключением применения метода на отдельных зернах и растениях.
С.4.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
С.4.2.1 Совместные сличительные испытания
_______________
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице С.11.
Таблица С.11 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 2000 |
Количество лабораторий | 18 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 16 |
Количество образцов на лабораторию | 6 |
Количество принятых результатов | 96 |
Количество образцов, содержащих кукурузу Bt 11 | 32 |
Количество образцов, содержащих кукурузу Event 176 | 32 |
Количество образцов, содержащих немодифицированную кукурузу | 32 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
Кроме того, 13 лабораторий дополнительно получили образцы ДНК, выделенные из генетически модифицированной кукурузы Event 176 (кукуруза Bt 176) с массовой фракцией 0,1% ГМО в виде сухой кукурузной муки (сертифицированные референсные образцы стандартного состава, приготовленные IRMM, Гиль, Бельгия). Двенадцать лабораторий представили положительные по содержанию Event 176 (Bt 176) результаты, а одна лаборатория представила результаты как спорные (определено в двух повторах) [20].
С.4.2.2 Молекулярная специфичность
С.4.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был описан в ссылках [20] и [35].
Информация о генетической конструкции, перенесенной в геном кукурузы, приводится в ссылке [35].
С.4.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (база данных GenBank®, BlastN® 2.2.1, по состоянию на 1 июля 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированной кукурузой, а также с другими сельскохозяйственными растениями. Более того, набор праймеров был подобран для амплификации специфической последовательности ДНК, присутствующей только в искусственной, не встречающейся в природе области стыка.
С.4.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из генетически модифицированной сои (GTS 40-3-2) и кукурузы линий Bt 11, Т 25 и MON 810 [11] или немодифицированной кукурузы [11], [20], не наблюдали амплификации.
Количество копий последовательностей равно двум.
С.4.2.3 Предел обнаружения
С.4.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
С.4.4 Принцип
Токсин Bt Bacillus thuringiensis - это инсектицид бактериального происхождения. Генетически модифицированные растения, содержащие ген Bt, продуцируют продукт гена как эндогенный пестицид. Кукуруза Event 176 (кукуруза Bt 176) содержит синтетический ген Bt типа CrylA(b) под контролем промотора CPDK6. Принцип метода заключается в амплификации методом ПЦР фрагмента ДНК длиной 211 п.н., охватывающего стык между промотором CPDK6 и последовательностью гена Bt. Полученный продукт ПЦР может быть обнаружен с помощью электрофореза в агарозном геле. Проверка специфичности продукта ПЦР может быть выполнена с помощью описанного далее специфичного зонда для гибридизации.
С.4.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
С.4.5.1 Вода
С.4.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
С.4.5.5 Олигонуклеотиды
С.4.5.5.1 Прямой праймер
Cry03: 5’-СТС TCg CCg ТТС ATg ТСС gT-3’.
Номер позиции в базе данных отсутствует. Праймер локализован на промоторе CPDK6. Праймер на 100% соответствует CPDK кукурузы, позиция N L27484.1.
С.4.5.5.2 Обратный праймер
Cry04: 5’-ggT CAg gCT Cag gCT gAT gT-3’.
Позиция N 41419 (согласно ссылке [36]). Праймер локализован на синтетическом гене CrylA(b).
С.4.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
С.4.5.7 Зонд для гибридизации (Cry01)
5’-ATg gAC ААС ААС ССС ААС АТС-3’.
С.4.5.9 Раствор для гибридизации, содержащий 10 пмоль зонда для гибридизации в 2,5 мл прегибридизационного раствора (C.4.5.8).
Температура гибридизации - 50°С. Дополнительная информация по условиям гибридизации приводится в [12].
С.4.6 Оборудование
В соответствии с описанием в С.1.6.
С.4.7 Процедура анализа
С.4.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице С.12. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице С.12.
Таблица С.12 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 2 |
Вода |
| 15,4 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,4 ммоль/л | 1,0 |
Праймер Cry03, 5 мкмоль/л | 0,25 мкмоль/л | 1,25 |
Праймер Cry04, 5 мкмоль/л | 0,25 мкмоль/л | 1,25 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 0,5 IU | 0,1 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 1,5 ммоль/л. | ||
С.4.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава (материал, содержащий 0,1% генетически модифицированной кукурузы Event 176 (Bt 176), например, производства Института референсных материалов и измерений (IRMM), Гиль, Бельгия (IRMM-411, MZ-0,1).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
С.4.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица С.13 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 12 мин/95°С |
Амплификация | 30 с/95°С |
| 30 с/63°С |
| 30 с/72°С |
Количество циклов | 38 |
Завершающая полимеризация | 6 мин/72°С |
С.4.8 Специфичность продукта ПЦР
Проверка специфичности амплифицированного продукта может быть выполнена с помощью гибридизации по Саузерну с использованием меченного дигоксигенином зонда Cry01 (С.4.5.7-С.4.5.9). Немодифицированные образцы должны дать отрицательные результаты в таком гибридизационном анализе [20].
Специфичность амплифицированного продукта может быть проверена с помощью рестрикционного анализа с использованием ферментов Нае III, Taq I или Dde I. Рестрикция ферментом Нае III дает два фрагмента длиной 162 и 49 п.н. соответственно. Рестрикция ферментом Taq I дает три фрагмента длиной 168, 22 и 21 п.н. соответственно [20]. Рестрикция ферментом Dde I дает три фрагмента длиной 128, 72 и 11 п.н. соответственно [20].
С.4.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных референсных материалов, приготовленных из кукурузы Event 176 (Bt 176) (например, серия IRMM-411 производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в С.4.8.
Обнаружение фрагментов с размером 211 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК из кукурузы Event 176 (Bt 176) в пределах установленных параметров специфичности, описанных в С.4.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
С.5 Специфичный к генетической конструкции метод обнаружения модифицированных последовательностей ДНК из генетически модифицированной кукурузы Т 25
С.5.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения генетически модифицированной кукурузы Т 25/"Liberty-Link" в сырье путем амплификации однокопийной области стыка между последовательностями ДНК из промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и гена pat, соединенных путем рекомбинации in vitro.
Эта конструкция может быть в будущем использована и в других ГМО.
Этот метод не позволяет распознавать селекционные сорта со сложным геномом, за исключением применения метода на отдельных зернах и растениях.
С.5.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
С.5.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод был метрологически аттестован в совместном сличительном испытании [20], проведенном под руководством рабочей группы "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV). Количество участников, а также количество образцов устанавливали в соответствии с критериями ISO 5725-2. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3.
Для совместных сличительных испытаний были подготовлены образцы муки (перемолотые зерна) из кукурузы линий Т 25 (0,1%, 1%), MON 810 (0,1%, 1%) и из немодифицированной кукурузы.
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблицах С.14 и С.15.
Таблица С.14 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 2001 |
Количество лабораторий | 16 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 16 |
Количество образцов на лабораторию | 5 |
Количество принятых результатов | 75 |
Количество образцов, содержащих кукурузу Т25 | 33 |
Количество образцов, содержащих кукурузу MON 810 | 31 |
Количество образцов, содержащих немодифицированную кукурузу | 11 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 4 (12%) |
Таблица С.15 - Подробные результаты совместных сличительных испытаний
Тип образца | Количество образцов | Правильно | Неправильно |
Образцы, не содержащие Т25 | |||
0% ГМО | 11 | 11 | 0 |
0,1% MON 810 | 13 | 13 | 0 |
1% MON 810 | 18 | 18 | 0 |
Образцы, содержащие Т25 | |||
0,1% Т25 | 18 | 15 | 3 (отриц.) |
1% Т25 | 15 | 14 | 1 (отриц.) |
Все три отрицательных результата были получены в одной лаборатории. | |||
С.5.2.2 Молекулярная специфичность
С.5.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод описан в ссылке [20].
Примечание - Информация о последовательности для разработки этого метода была предоставлена компанией Bayer Crop Science (ранее Aventis Crop Science).
Информация о генетической конструкции, перенесенной в геном кукурузы, приводится в ссылке [37].
С.5.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (база данных GenBank®, BlastN® 2.2.1, по состоянию на 1 июля 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированной кукурузой, а также с другими сельскохозяйственными растениями. Более того, набор праймеров был подобран для амплификации специфической последовательности ДНК, присутствующей только в искусственной, не встречающейся в природе области стыка.
С.5.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированной кукурузы или генетически модифицированных сои GTS 40-3-2 (соя RoundUp Ready®) или кукурузы линий Event 176 (Bt 176), Bt 11 и MON 810, не наблюдали амплификации.
Количество копий последовательностей равно одному.
С.5.2.3 Предел обнаружения
С.5.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
С.5.4 Принцип
Ген pat присутствует в почвенной бактерии Streptomyces viridochromogenes и кодирует фермент фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазу, которая обеспечивает устойчивость растения к гербициду (к глюфосинату аммония). Глюфосинат аммония нарушает синтез глютамина в растениях.
Принцип метода заключается в амплификации методом ПЦР фрагмента ДНК длиной 209 п.н., охватывающего стык между промотором 35S вируса мозаики цветной капусты и последовательностью гена pat. Полученный продукт ПЦР может быть обнаружен с помощью электрофореза в агарозном геле. Проверка специфичности продукта ПЦР может быть выполнена с помощью описанного далее рестрикционного анализа.
С.5.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
С.5.5.1 Вода
С.5.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
С.5.5.5 Олигонуклеотиды
С.5.5.5.1 Прямой праймер
T25-F7: 5’-ATg gTg gAT ggC ATg ATg TTg-3’.
Позиция (в базе данных GenBank®) N NC001497. Праймер локализован на промоторе 35S вируса мозаики цветной капусты.
С.5.5.5.2 Обратный праймер
T25-R3: 5’-TgA gCg AAA ССС ТАТ AAg ААС СС-3’.
Позиция в базе данных отсутствует. Праймер локализован на кодирующем участке белка PAT.
С.5.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
С.5.5.7 Рестриктаза: Hinf I и Mwo I.
С.5.6 Оборудование
В соответствии с описанием в С.1.6.1 и С.1.6.2.
С.5.7 Процедура анализа
С.5.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице С.16. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице С.16.
Таблица С.16 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 2 |
Вода |
| 14,8 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 2 ммоль/л | 2,0 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,4 ммоль/л | 1,0 |
Праймер T25-F7, 10 мкмоль/л | 0,5 мкмоль/л | 1,25 |
Праймер T25-R3, 10 мкмоль/л | 0,5 мкмоль/л | 1,25 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 1 IU | 0,2 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 2 ммоль/л. | ||
С.5.7.2 Контроли ПЦР
_______________
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
С.5.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица С.17 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 12 мин/95°С |
Амплификация | 30 с/95°С |
| 30 с/64°С |
| 30 с/72°С |
Количество циклов | 40 |
Завершающая полимеризация | 10 мин/72°С |
С.5.8 Специфичность продукта ПЦР
Проверка специфичности амплифицированного продукта может быть выполнена с помощью рестрикционного анализа с использованием ферментов Hinf I или Mwo I. Рестрикция ферментом Hinf I дает два фрагмента длиной 121 и 88 п.н. соответственно. Рестрикция ферментом Mwo I дает два фрагмента длиной 141 и 68 п.н. соответственно [20].
С.5.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из соответствующих референсных материалов, приготовленных из кукурузы Т 25.
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в С.5.8.
Обнаружение фрагментов с размером 209 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК из генетически модифицированной кукурузы Т 25 в пределах установленных параметров специфичности, описанных в С.5.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
_______________
С.6.1 Принцип
Данный метод описывает специфичный к генетической конструкции порядок качественного обнаружения генетически модифицированных последовательностей ДНК в папайе (Carica papaya), устойчивой к вирусу кольцевой пятнистости папайи (PRSV). Информация о генетической конструкции, внедренной в геном папайи, представлена в [70].
Применение метода предполагает возможность извлечения из соответствующей матрицы достаточного количества амплифицированной ДНК для ее последующего изучения. Применяемый метод может быть описан как ПЦР-анализ в сочетании с рестрикционным анализом и следующим за ним ПЦР-анализом в реальном времени. В основу метода положено определение последовательностей ДНК промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и области стыка между последовательностями ДНК CMV/PRSV СР DNA (кодирующими химерный белок оболочки вируса мозаики огурца/белок оболочки вируса кольцевой пятнистости папайи) (см. [71]).
С.6.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
С.6.2.1 Робастность метода
В ходе совместных сличительных испытаний была проверена робастность предлагаемого метода. Праймеры контролировались средствами обычной ПЦР и ПЦР в реальном времени. Кроме того, метод был испытан с применением различных приборов для проведения ПЦР, а именно амплификатором блочного типа для проведения ПЦР и амплификатором блочного типа для проведения ПЦР в реальном времени. Испытания подтвердили, что метод обладает необходимой робастностью (см. данные совместных сличительных испытаний).
С.6.2.2 Внутри лабораторные испытания
Внутрилабораторные испытания, организованные до начала совместных сличительных испытаний, продемонстрировали возможность успешного экстрагирования как по методу СТАВ, так и с применением готового набора реактивов (см. [71]) и достаточную робастность метода в условиях применения различного специализированного оборудования для проведения ПЦР-анализа и соответствующих ПЦР-процедур (см. С.6.2.1, С.6.2.4.3 и С.6.6).
С.6.2.3 Совместные сличительные испытания
Данный метод был аттестован в рамках совместных сличительных испытаний силами рабочей группы "Разработка методов идентификации пищевых продуктов, произведенных с использованием средств генной инженерии" Федерального ведомства по защите прав потребителей и безопасности пищевых продуктов Германии (BVL) в 2005-11. В указанном совместном исследовании приняли участие 10 лабораторий (см. [72]).
В ходе исследования испытаниям были подвергнуты образцы, содержащие по массе от 10% до 100% измельченных плодов генетически модифицированной папайи (модификации папайи SunUp 55-1 (уникальный идентификатор: CUH-CP551-8) или 63-1 (уникальный идентификатор: CUH-СР631-7)). Образцы были снабжены кодовыми пометками и предоставлены в распоряжение лабораторий-участниц. При проведении совместных сличительных испытаний выделение ДНК по методу СТАВ выполнялось на части анализируемого образца массой 2 г (см. [72]). После экстрагирования ДНК проводился видоспецифичный ПЦР-анализ для проверки амплифицируемости PCR выделенной ДНК. Специфичное выявление последовательностей ДНК генетически модифицированной папайи осуществлялось путем однократного проведения ПЦР-анализа и последующего рестрикционно-ферментного анализа. Помимо этого, эффективность метода была проверена средствами ПЦР в реальном времени. Результаты совместных сличительных испытаний представлены в таблице C.18.
Таблица C.18 - Результаты совместных сличительных испытаний
Параметр | Обычная ПЦР | ПЦР в реальном времени |
Количество лабораторий | 10 | 10 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 10 | 10 |
Количество образцов из расчета на лабораторию | 6 | 6 |
Количество принятых результатов | 60 | 60 |
Количество образцов, содержащих генетически модифицированную папайю, устойчивую к PRSV | 39 | 34 |
Количество образцов, не содержащих генетически модифицированную папайю | 21 | 26 |
Ложноположительные результаты | 2 | 0 |
Ложноотрицательные результаты | 2 | 2 |
В общем итоге неверное заключение о составе образцов было сделано двумя лабораториями.
Первая лаборатория, которой были переданы три одинаковых образца с 10%-ной массовой долей генетически модифицированной папайи, получила для одного из них ложноотрицательные результаты при проведении стандартной ПЦР и ПЦР в режиме реального времени. Второй лаборатории в числе прочих кодированных образцов также был направлен образец с 10%-ным массовым содержанием генетически модифицированной папайи, и он аналогичным образом дал отрицательные результаты при проведении обычного ПЦР-анализа и ПЦР-анализа в реальном времени. Располагая тремя образцами, не содержащими генетически модифицированную папайю, данная лаборатория получила ложноположительные результаты при проведении ПЦР-анализа обычным методом для двух таких образцов, тогда как при проведении ПЦР-анализа в реальном времени эти образцы были распознаны правильно (см. [72]).
С.6.2.4 Молекулярная селективность
С.6.2.4.1 Общие положения
_______________
С.6.2.4.2 Теоретическая часть
_______________
С.6.2.4.3 Экспериментальная часть
В ходе внутрилабораторного исследования испытаниям подвергались различные виды генетически модифицированных растений (см. таблицу С.19), а также папайя, содержащая 100% генетически модифицированного материала (модификация папайи SunUp 55-1 (уникальный идентификатор: CUH-СР551-8) или 63-1 (уникальный идентификатор: CUH-CP631-7)), обычно с количеством по 500 геномных копий на исследуемую часть образца и двумя репликациями. Только генетически модифицированная папайя обеспечила получение специфичного продукта ПЦР длиной 152 п.н.
Таблица С.19 - Виды исследованных генетически модифицированных растений
Кукуруза Bt11 (SYN-BT 11-1) | Хлопок Bxn (10211, BXN-1 (10211, BXN-1 211-9; 10215, BXN-1 215-4; 10222, BXN-1 222-2) |
Кукуруза MON810 (MON- 81 81 -6) | Хлопок Bollgard ll(MON 15985-7) |
Кукуруза Т25 (ACS-ZM 3-2) 3-2) | Соевые бобы GTS40-3-2 (MON- 4 32-6) |
Кукуруза GA21 (MON- 21-9) 21-9) 21-9) | Томаты FlavrSavr (CGN-89564-2) |
Кукуруза СВН351 (ACS-ZM 4-3) 4-3) | Картофель NewLeaf (Bt6, NMK-89812-3; Bt10, NMK-89175-5; Bt12, NMK-896 1-8; Bt16, NMK-89167-6; Bt17, NMK-89593-9; Bt18, NMK-899 6-7; Bt23, NMK-89675-1) |
Канола GT73 (MON- 73-7) 73-7) 73-7) | Сахарная свекла LL (ACS-BV 1-3) 1-3) |
Канола Т45 (ACS-BN 8-2) 8-2) | - |
Канола MS1/RF1 (ACS-BN 4-7 4-7 ACS-BN 1-4) 1-4) | - |
_______________
С.6.3 Принцип и выводы
Средствами ПЦР амплифицируется фрагмент ДНК длиной 152 п.н., начиная с последовательностей ДНК промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и заканчивая последовательностями ДНК на стыке между генами белков вирусной оболочки. Такой продукт амплификации является специфичным для генетически модифицированной папайи CUH-CP551-8 и CUH-CP631-7.
_______________
С.6.4 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения согласно ISO 24276.
С.6.5 Типы и количество образцов
Далее в качестве примера представлены данные сличительных испытаний по типам образцов и их количеству, достаточному для реализации описываемого метода.
Репрезентативность испытуемого образца по отношению к лабораторному образцу может обеспечиваться, например, путем размола или гомогенизации. Порядок выполнения измерений и пошаговые процедуры, которым необходимо следовать, описаны в ISO 21571. При проведении совместных сличительных испытаний образцы для выделения ДНК отбирались из гомогенизированных измельченных плодов папайи.
С.6.6 Предел обнаружения и диапазон применения
В ходе исследования испытаниям были подвергнуты образцы, содержащие по массе от 10% до 100% генетически модифицированной папайи. Была подтверждена возможность выявления генетических модификаций в папайе, массовая доля генетически модифицированного материала в которой соответствует 10% (см. таблицу С.20).
В целях оценки практической чувствительности метода по отношению к анализируемому образцу предполагалось, что в последнем содержится геном папайи размером 372 Мп.н.
Количество копий, которое с 95% вероятностью позволяло бы сделать положительное заключение по итогам проведения ПЦР, было определено в рамках соответствующего внутрилабораторного исследования. ПЦР-анализ после десятикратного повторения (схема, согласованная на международном уровне, см., например, руководство EURACHEM Guide [84]) с применением пары праймеров sunup-af1 и sunup-ar1 продемонстрировал положительный результат для каждой отдельно взятой реакции в случае использования пяти копий генома.
Таблица С.20 - Количество образцов, для которых были получены ложноотрицательные или ложноположительные результаты
Количество | Содержание | Стандартная ПЦР | ПЦР в реальном времени | ||
образцов | генетически модифицированной папайи, % массовой доли | Ложнополо- жительные результаты | Ложноотри- цательные результаты | Ложнополо- жительные результаты | Ложноотри- цательные результаты |
20 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 |
20 | 10 | 0 | 2 | 0 | 2 |
20 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 |
С.6.7 Расчет неопределенности измерения
Оценивание неопределенности измерения осуществляется в рамках соответствующих внутрила-бораторных исследований.
С.6.8 Помехи
Количество, качество, а также способность к амплификации матрицы нуклеиновых кислот оказывают непосредственное влияние на получаемый аналитический результат (см. ISO 21571). Отсюда следует необходимость контроля нуклеиновой кислоты, используемой для анализа, например, с применением специфичного к целевому таксону метода ПЦР.
С.6.9 Физические условия и условия окружающей среды
Подробнее см. в ISO 24276.
С.6.10 Инструменты и оборудование
Используется обычное оборудование для лаборатории молекулярной биологии, в частности следующее.
С.6.10.1 Инструменты и оборудование для проведения ПЦР с последующим рестрикцией но-ферментным анализом
С.6.10.1.1 Амплификатор
С.6.10.1.2 Термостат или водяная баня.
С.6.10.2 Инструменты и оборудование для проведения ПЦР в реальном времени
С.6.10.2.1 Амплификатор, оборудованный источником энергии, предназначенным для возбуждения флуоресцентных молекул, и оптической системой детектирования, пригодной для обнаружения флуоресцентных сигналов, генерируемых в процессе ПЦР.
С.6.10.2.2 Реакционные пробирки с пробками или крышками, способные выдерживать поочередное нагревание до 100°С и охлаждение до 4°С без разрушения и не оказывающие влияния на флуоресцентные сигналы, которые генерируются в процессе амплификации.
С.6.11 Реактивы и материалы
Если не указано иное, используются только реактивы, отвечающие требованиям ISO 24276, и только вода категории "для молекулярной биологии" или сопоставимой степени чистоты.
С.6.12 Отбор, транспортировка, консервация и хранение образцов
Растворы ДНК могут храниться при температуре 4°С в течение не более чем 1 нед или при температуре минус 20°С в течение более длительного времени.
С.6.13 Пробоподготовка
См. ISO 21571.
С.6.14 Калибровка оборудования
См. ISO/IEC 17025 [41].
С.6.15 Этапы проведения анализа
С.6.15.1 Общие положения
ДНК выделяется из испытуемого образца с применением соответствующего метода. Анализ ДНК включает в себя следующие этапы:
a) проверку количества, качества и амплифицируемости выделенной ДНК, например, с применением специфичного к целевому таксону метода ПЦР.
Примечание - Последовательности ДНК для стандартной ПЦР и ПЦР в реальном времени указаны в таблице С.21. Подробнее см. в [72], [73];
b) выявление соответствующей генетической модификации в папайе, устойчивой к PRSV. В описываемом случае средствами ПЦР амплифицируется целевая последовательность, специфичная для данной генетической модификации. Для этих целей может быть использована стандартная ПЦР или ПЦР в реальном времени. При проведении ПЦР-анализа обычным методом продукты реакции разделяются путем электрофореза в агарозном геле и подвергаются анализу с применением соответствующего размерного маркера ДНК для предполагаемых длин последовательностей продуктов ПЦР;
c) проверку амплифицированной ДНК путем рестрикционно-ферментного расщепления, если использовалась стандартная ПЦР. При использовании ПЦР в реальном времени контроль выполняется на этапе согласно пункту b), с использованием зонда, помеченного флуоресцентным красителем.
С.6.15.2 Приготовление экстрактов ДНК
Подробнее о выделении ДНК см. в ISO 21571. В ходе совместных сличительных испытаний для измельченных плодов папайи успешно применялось экстрагирование по методу СТАВ. Размер анализируемой части образца для исследования составлял 2 г.
С.6.15.3 Количественное определение ДНК
Подробнее о количественном определении при работе с экстрактами ДНК см. в ISO 21571.
С.6.15.4 Оценка целостности ДНК
Выполнялась проверка количества, качества и амплифицируемости выделенной ДНК, например, с применением специфичного к целевому таксону метода ПЦР.
С.6.16 Реактивы для ПЦР
С.6.16.1 Общие положения
Если не указано иное, используются только реактивы, отвечающие требованиям ISO 24276, и только вода категории "для молекулярной биологии" или сопоставимой степени чистоты.
Могут использоваться готовые буферные смеси для ПЦР или их отдельные компоненты.
С.6.16.2 ПЦР
Реакционные растворы, необходимые для проведения ПЦР, обычно сохраняются в виде аликвот при температуре минус 20°С.
С.6.16.2.1 Термостабильная ДНК-полимераза (для горячего старта ПЦР), 5 МЕ/мкл.
С.6.16.2.2 Основной буферный раствор для ПЦР.
С.6.16.2.3 Раствор магния хлорида, с=25 ммоль/л, при необходимости (если в основном буферном растворе для ПЦР отсутствует магния хлорид).
С.6.16.2.4 Раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP), содержащий dATP, dCTP, dGTP и dTTP, с=2,5 ммоль/л для каждого из компонентов.
С.6.16.2.5 Праймеры и зонды. См. таблицу С.21.
Таблица С.21 - Олигонуклеотиды
Название | Последовательность ДНК олигонуклеотидов |
Последовательности ДНК генетически модифицированной папайи в качестве целевых последовательностей для ПЦР-анализа обычным методом | |
sunup-af1 | 5’-ТТС ATT Tgg AgA ggA CAg ggT AC-3’ |
sunup-ar1 | 5’-TCA TTC TTg gAC TgA CgA CgT-3’ |
Последовательности ДНК генетически модифицированной папайи в качестве целевых последовательностей для ПЦР-анализа в реальном времени | |
35S-F | 5’-gAC gTA Agg gAT gAC gCA CAA-3’ |
sunup-ar1 | 5’-TCA TTC TTg gAC TgA CgA CgT-3’ |
35S-T | 5’-FAM-CCC ACT АТС CTT CgC AAg ACC CTT CC-TAMRA-3’ |
FAM - 6-карбоксифлуоресцеин, TAMRA - 6-карбокситетраметилродамин. Допускается использование иных аналогичных репортерных красителей и/или тушителей, если они достоверно обеспечивают получение лучших или таких же результатов. | |
С.6.16.3 Ферменты рестрикции Kpn I, Nla III, Tsp 509 I
С.6.17 Методика испытания
С.6.17.1 Исходная смесь для проведения ПЦР
Наименования и количество реактивов для общего объема 25 мкл из расчета на каждую ПЦР приведены в таблицах С.22 и С.23. ПЦР-анализ может также проводиться с меньшим или большим рабочим объемом, при условии, что значения объема растворов в составе исходной смеси будут соответствующим образом скорректированы. Следует использовать 5 мкл экстракта ДНК.
Совместные сличительные испытания подтвердили применимость конечных значений концентрации реактивов, приведенных в таблицах С.22 и С.23.
Непосредственно перед применением реактивы осторожно оттаивают и обрабатывают в центрифуге. В процессе подготовки к проведению ПЦР реактивы, если требуется, сохраняют на ледяной бане.
Перед пипетированием каждый реактив должен быть тщательно перемешан. Смесь, приготавливаемая для проведения ПЦР, должна содержать все необходимые для реакции компоненты, за исключением экстракта ДНК. Количество смеси определяется исходя из количества проводимых реакций плюс по меньшей мере одна дополнительная реакция.
Смесь для проведения ПЦР перемешивают и после непродолжительной обработки в ценрифуге добавляют при помощи пипетки в реакционные сосуды из расчета 20 мкл на сосуд.
При помощи пипетки добавляют также 5 мкл экстракта ДНК, 5 мкл отрицательной контрольной пробы для контроля экстракции, 5 мкл контрольной пробы для контроля реактивов, используемых при ПЦР, 5 мкл воды в пробирки для контрольной реакции (ПЦР без матрицы ДНК) или 5 мкл положительной контрольной пробы для контроля экстрации в соответствующие пробирки для проведения ПЦР.
В течение непродолжительного времени обрабатывают партию реакционных сосудов в центрифуге и помещают их в систему ПЦР реального времени. Запускают программу "температура - время" в соответствии с указаниями изготовителя.
Таблица С.22 - Добавление реактивов (стандартная ПЦР)
Реактив | Конечная концентрация | Объем на реакцию, мкл |
Образец ДНК | От 10 до 50 нг | 5 |
Вода | - | 12,3 |
Буфер ПЦР 10 (без добавления ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,2 ммоль/л | 0,5 |
Праймер sunup-af1, 10 мкмоль/л | 0,6 мкмоль/л | 1,5 |
Праймер sunup-ar1, 10 мкмоль/л | 0,6 мкмоль/л | 1,5 |
Термостабильная ДНК-полимераза (для горячего старта ПЦР), 5 МЕ/мкл | 1 ME | 0,2 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержал магния хлорид, итоговая концентрация в реакционной смеси доводится до 1,5 ммоль/л. | ||
Таблица С.23 - Концентрация реактивов (ПЦР в реальном времени с блочным амплификатором)
Реактив | Конечная концентрация |
Образец ДНК | От 10 до 50 нг |
Вода | - |
Буфер ПЦР х 2, например набор QuantiTect Probe (Qiagen) (Qiagen) | 1
|
Праймер 35S-F, 10 мкмоль/л | 0,4 мкмоль/л |
Праймер sunup-ar1, 10 мкмоль/л | 0,4 мкмоль/л |
Зонд 35S-T | 0,4 мкмоль/л |
С.6.17.2 Контроли ПЦР
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
С.6.17.3 Подготовка стандартов
Для определения размера продуктов ПЦР могут использоваться серийно выпускаемые размерные стандарты ДНК.
С.6.17.4 Программы "температура - время"
_______________
Таблица С.24 - Программа "температура - время" для ПЦР-анализа обычным методом
Параметр | Время и температура |
Активация и начальная денатурация | 10 мин при 95°С |
Амплификация | 25 с при 94°С |
| 30 с при 62°С |
| 40 с при 72°С |
Количество циклов | 40 |
Окончательная элонгация | 7 мин при 72°С |
Таблица С.25 - Программа "температура - время" для ПЦР-анализа в реальном времени с использованием блочного амплификатора
Параметр | Время и температура |
Активация и начальная денатурация | 15 мин при 95°С |
Амплификация | 15 с при 94°С |
| 60 с при 60°С |
Количество циклов | 45 |
Окончательная элонгация | 30 с при 40°С |
С.6.17.5 Критерии приемки или отбраковки
С.6.17.5.1 Для стандартной ПЦР
Для обнаружения продуктов стандартной ПЦР используется гелевый электрофорез (например, как описано в ISO 21571:2005 (раздел В.2)). Продукты ПЦР при проведении электрофореза в агарозном геле разделяются в зависимости от их молекулярной массы. Для исследования с применением гелевого электрофореза отбирается по 10 мкл продуктов ПЦР. Результаты исследования документируются. Длина продукта ПЦР, получаемого при проведении ПЦР-анализа обычным методом, должна составлять 152 п.н. Результаты ПЦР-анализа, проведенного обычным методом, считаются отвечающими критериям приемки, если:
- данные, полученные с применением контролей, соответствуют ожидаемым;
- продукты ПЦР имеют характерную длину 152 п.н.
Порядок действий, позволяющий подтвердить получение искомых продуктов ПЦР, описан в С.6.17.6.1.
С.6.17.5.2 Для ПЦР в реальном времени
Если по причине атипичного характера данных, полученных в ходе измерений, их автоматическая интерпретация не позволяет получить удовлетворительный результат, то может возникнуть необходимость в целях успешной оценки этих данных предварительно установить базовую линию и пороговое значение вручную. В этом случае должны выполняться специальные указания по работе с программным обеспечением для оценки данных, предусмотренные в руководстве по эксплуатации соответствующего прибора.
С.6.17.6 Идентификация
С.6.17.6.1 Идентификация продуктов стандартной ПЦР средствами рестрикционно-ферментного анализа
С целью подтверждения присутствия среди продуктов ПЦР определенной целевой последовательности ДНК продукты ПЦР подвергаются рестрикционно-ферментному анализу. Для проведения анализа выбирается и используется по меньшей мере один из ферментов рестрикции, перечисленных в таблицах С.26 и С.27.
Таблица С.26 - Ферменты рестрикции, условия инкубации, количество и размер рестрикционных фрагментов
Фермент рестрикции | Условия инкубации | Количество/размер рестрикционных фрагментов |
Kpn I | 37°С, 4 ч | 24 и 128 п.н. |
Nla III | 37°С, 4 ч/65°С, 20 мин | 94 и 58 п.н. |
Tsp 509 I | 65°С, 4 ч | 77 и 75 п.н. |
Таблица С.27 - Добавление реактивов для рестрикционного анализа
Реактив | Объем |
Продукт ПЦР | 5 мкл |
Фермент рестрикции (не менее 10 ME) | х мкл |
Реакционный буфер (10х) | 2 мкл |
Вода | До 20 мкл |
Для анализа рестрикционных фрагментов может использоваться гелевый электрофорез в соответствии с ISO 21571:2005 (раздел В.2).
Целевая последовательность считается обнаруженной при проведении стандартного ПЦР-анализа, если:
- ПЦР, специчная к таксону, дает положительные результаты.
Примечание - ПЦР-анализ с применением методов, специфичных к таксону, необходим для исключения ложноотрицательных результатов;
- длина продукта ПЦР, полученного с применением пары праймеров sunup-af1/sunup-ar1, соответствует 152 п.н.;
- фрагмент длиной 152 п.н. при помощи фермента рестрикции Kpn I разрезается на два фрагмента длиной 24 и 128 п.н., или при помощи фермента рестрикции Nla III на два фрагмента длиной 94 и 58 п.н., или при помощи фермента рестрикции Tsp 509 I на два фрагмента длиной 77 и 75 п.н. соответственно.
Примечание - С учетом разделяющих свойств применяемой агарозы после расщепления последовательности ДНК с использованием Kpn I наблюдение фрагмента ДНК размером 24 п.н. средствами гелевого электрофореза в отдельных случаях может оказаться невозможным. При использовании для рестрикции фермента Tsp 509 I возможность проследить за разделением последовательности ДНК на два фрагмента размером 77 п.н. и 75 п.н. также не гарантируется;
- контрольные ПЦР-анализы без добавления ДНК (контроль реактивов для ПЦР, отрицательный контроль экстракции) дают отрицательные результаты;
- при проведении анализов для контроля амплификации (положительный контроль целевой ДНК, контроль ингибирования ПЦР) обнаруживается продукт ПЦР длиной 152 п.н., который по итогам рестрикционного анализа с применением указанных ферментов демонстрирует соответствующие характеристики.
С.6.17.6.2 Идентификация продуктов ПЦР в реальном времени
При использовании ПЦР в реальном времени целевая последовательность считается обнаруженной, если:
- ПЦР, специчная к таксону, дает положительные результаты.
Примечание - ПЦР-анализ с применением методов, специфичных к таксону, необходим для исключения ложноотрицательных результатов;
- при использовании праймеров 35S-F и sunup-ar1, а также зонда 35S-TMP наблюдается возрастание измеряемого уровня флуоресценции, обусловленное амплификацией;
- в контрольных реакциях ПЦР без добавления ДНК (контроль реагентов ПЦР, отрицательный контроль экстракции) не наблюдается возрастание уровня флуоресценции, обусловленное амплификацией;
С.6.18 Идентификация образца
Все образцы должны быть четко идентифицированы.
С.6.19 Выполнение вычислений
Имеющиеся данные подкрепляют вывод о том, что описанный метод может быть использован для полуколичественного скрининга с целью выявления компонентов ГМО.
С.7 Специфичный к генетической конструкции метод обнаружения модифицированных последовательностей ДНК генетически модифицированной линии риса ТТ51-1 (сорт Bt63)
С.7.1 Принцип
Метод предназначен для выявления ДНК, устойчивой к поражению насекомыми генетически модифицированной линии риса ТТ51-1 (сорт Bt63) (см. [74]) в сырье или переработанных продуктах (рисовая крупа, рисовая лапша) путем амплификации единичной копии последовательности размером 83 п.н., представляющей собой область стыка между искусственным геном CrylA(c) и терминатором Nos (см. [75]), средствами ПЦР в реальном времени.
Данный метод не может быть использован для дифференцирования между разновидностями риса, содержащими одну и ту же генетическую конструкцию. Для уточнения полученных данных (например, для выявления конкретного трансформационного события) требуется проведение дополнительного анализа.
С.7.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
С.7.2.1 Робастность
Робастность метода проверяется путем внесения следующих изменений в схему анализа:
- уменьшения концентрации праймера с 300 до 200 нмоль/л;
- уменьшения концентрации зонда с 100 до 75 нмоль/л.
Каждая реакция повторяется трижды с использованием одного и того же количества матричной ДНК.
С.7.2.2 Внутри лабораторные испытания
С.7.2.3 Совместные исследования
Данный метод был аттестован в рамках совместных сличительных испытаний силами рабочей группы "Разработка методов идентификации пищевых продуктов, произведенных с использованием средств генной инженерии" Федерального ведомства по защите прав потребителей и безопасности пищевых продуктов Германии (BVL)(cm. [77]). Количество участников и количество образцов отвечали установленным критериям согласно ISO 5725-2 [39] и протоколу IUPAC (см. [48]).
Для анализа участники получили в свое распоряжение шесть образцов рисовой муки, шесть образцов рисовой лапши и три образца ДНК. Образцы содержали различные концентрации последовательности cry1A(c)-T-nos или не содержали данной генетической конструкции (отрицательные образцы) соответственно. Всем образцам были присвоены случайные номера.
Для получения образцов риса использовались цельные рисовые зерна или рисовая лапша. Из соответствующего количества тонко помолотых зерен генетически не модифицированного риса и риса Bt63 (JRC, Испра) была приготовлена смесь с 0,1%-ной массовой долей Bt63; далее путем гомогенного перемешивания с мукой из генетически не модифицированного риса из нее была получена смесь, содержащая по массе 0,05% Bt63. В качестве образцов лапши из генетически модифицированного риса выступали два разных положительных образца с Bt63, которые были предложены лабораториями, осуществляющими официальный мониторинг ГМО, и на момент подготовки к испытаниям уже были заявлены в Европейской системе быстрого оповещения. Отрицательные образцы были представлены лапшой из генетически не модифицированного риса.
Образцы рисовой лапши были перемолоты до гомогенного состояния. В случае с безымянными образцами каждому участнику были переданы два флакона, в которых находились части образцов массой 1 г каждый, содержащие рисовую муку следующего состава:
a) массовая доля риса Bt63 0,1%;
b) массовая доля риса Bt63 0,05%;
c) генетически не модифицированный рис;
d) рисовая лапша, содержащая Bt63 (образец a);
e) рисовая лапша, содержащая Bt63 (образец b);
f) рисовая лапша, не содержащая Bt63.
Для экстрагирования ДНК применялся метод СТАВ, как описано в ISO 21571:2005 (раздел А.31), размер используемой части образца составлял 1 г.
Результаты совместных сличительных испытаний представлены в таблицах С.28 и С.29.
Таблица С.28 - Результаты совместных сличительных испытаний. Оценка результатов, полученных на образцах риса
Параметр (сличительные испытания 2008 г.) | Значение |
Количество лабораторий | 17 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 17 |
Количество образцов из расчета на лабораторию | 12 |
Количество принятых результатов | 191 |
Количество образцов, содержащих рис Bt63 | 129 |
Количество образцов, содержащих генетически не модифицированный рис | 62 |
Ложноположительные результаты | 1 (1,6%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
Одна из лабораторий заявила об утечке четырех образцов, оставленных на ночь на инкубацию, что сделало невозможным их последующий анализ. В общей сложности в пяти образцах ДНК риса не была обнаружена тремя различными лабораториями. Одна лаборатория указала для пяти испытуемых образцов (двух образцов зерен риса и трех образцов рисовой лапши) необычно низкие значения gos9 (  14), как следствие, результаты, полученные на этих испытуемых образцах, при подготовке оценки не учитывались. | |
Таблица С.29 - Результаты совместных сличительных испытаний. Оценка результатов для образцов плазмидной ДНК
Параметр (сличительные испытания 2008 г.) | Значение |
Количество лабораторий | 17 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 17 |
Количество образцов плазмидной ДНК Bt63 из расчета на лабораторию | 3 |
Количество выполненных определений из расчета на образец плазмидной ДНК | 2 |
Количество положительных результатов/общее количество выполненных определений при количестве копий плазмидной ДНК, равном 0 | 0/34 |
Количество положительных результатов/общее количество выполненных определений при количестве копий плазмидной ДНК, равном 5 | 32/34 |
Количество положительных результатов/общее количество выполненных определений при количестве копий плазмидной ДНК, равном 20 | 34/34 |
С.7.2.4 Молекулярная селективность
С.7.2.4.1 Общие положения
Настоящий подраздел отвечает требованиям, обозначенным в разделе 7.
Описание метода приведено в [75]. Информация о генетической конструкции, внедренной в геном риса, представлена в [76].
С.7.2.4.2 Теоретическая часть
С.7.2.4.3 Экспериментальная часть
Амплификация не наблюдалась при использовании ДНК генетически не модифицированных соевых бобов, семян рапса, кукурузы и риса.
Признаков амплификации также не было отмечено для следующих генетически модифицированных линий (см. [75]):
- линии картофеля ЕН92-527-1 (BPS-25271-9);
Все разновидности ДНК, предназначенные для исследования в процессе испытаний на специфичность метода, были проверены на способность к амплификации и на влияние ингибиторов при помощи методов, специфичных к таксону, до начала их применения (данные не приводятся).
С.7.3 Принцип и выводы
Фрагмент ДНК размером 83 п.н., охватывающий область между искусственным геном crylA(c) и терминатором nos со спейсерной областью длиной 15 п.н. амплифицируется и обнаруживается средствами ПЦР в реальном времени. В основу системы ПЦР реального времени положена процедура ПЦР-анализа с применением специфического гидролизного зонда, помеченного 6-карбоксифлуоресцеином (FAM) в качестве репортерной молекулы и 6-карбокситетраметилродамин (TAMRA) в качестве молекулы-гасителя (см. [54]).
С.7.4 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения согласно ISO 5725-1 [40] и ISO 24276.
С.7.5 Типы и количество образцов
Репрезентативность испытуемого образца по отношению к лабораторному образцу может обеспечиваться, например, путем размола или гомогенизации. Порядок выполнения измерений и пошаговые процедуры, которым необходимо следовать, описаны в ISO 21571. Общее количество молотой рисовой лапши, использованное для проведения совместных исследований, составило 1 г.
С.7.6 Предел обнаружения (LOD)
Исходя из допущения, что на гаплоидный геном приходится только одна копия генетической конструкции и что молекулярная масса одной копии гаплоидного генома риса составляет 0,47 пг, следует полагать, что предел обнаружения метода не превышает пяти копий, в том числе в присутствии ДНК обычного риса (в качестве целевого таксона) и ДНК кукурузы (в качестве примера нецелевого таксона) (см. [79], [77]).
Предел обнаружения метода (относительно матрицы), таким образом, не превышает массовой доли 0,05% (для образцов ДНК с указанным массовым отношением количества целевых копий cry1A(c)-T-nos к количеству копий генома риса) (см. [78]).
С.7.7 Расчет неопределенности измерения
В рамках совместных сличительных испытаний выполнялась оценка неопределенности. Результаты оценки представлены в С.7.2.3.
С.7.8 Помехи
Количество нуклеиновой кислоты, которая используется в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени, а также ее способность к амплификации имеют решающее значение для чувствительности, обеспечиваемой описанным методом. За исключением указанного общего условия, другая специализированная информация об источниках помех для данного метода отсутствует.
С.7.9 Физические условия и условия окружающей среды
Подробнее см. в ISO 24276.
С.7.10 Инструменты и оборудование
Подробные сведения об оборудовании и материалах см. в ISO 21569. Используется обычное оборудование для лаборатории молекулярной биологии, в частности следующее.
С.7.10.1 Инструменты и оборудование для выделения ДНК
С.7.10.1.1 Амплификатор или водяная баня, предпочтительно с функцией встряхивания.
С.7.10.1.2 Центрифуга, позволяющая обрабатывать реакционные флаконы вместимостью 1,5 и 2 мл при 14500g.
С.7.10.2 Инструменты и оборудование для проведения ПЦР в реальном времени
С.7.10.2.1 Амплификатор, оборудованный:
- источником энергии, предназначенным для возбуждения флуоресцентных молекул;
- оптической системой детектирования, пригодной для обнаружения флуоресцентных сигналов, генерируемых в процессе ПЦР.
С.7.10.2.2 Реакционные емкости с пробками или крышками, способные выдерживать поочередное нагревание до 100°С и охлаждение до 4°С без разрушения и не оказывающие влияния на флуоресцентные сигналы, которые генерируются в процессе амплификации.
С.7.11 Реактивы и материалы
Если не указано иное, используются только реактивы, отвечающие требованиям ISO 24276, и только вода категории "для молекулярной биологии".
С.7.11.1 Реактивы для экстрагирования ДНК по методу СТАВ
См. ISO 21571.
С.7.11.2 Реактивы для проведения ПЦР-анализа в реальном времени
С.7.11.2.1 Термостабильная ДНК-полимераза (для горячего старта ПЦР).
_______________
С.7.11.2.3 Олигонуклеотиды
См. таблицу С.30.
Таблица С.30 - Олигонуклеотиды
Название | Последовательность ДНК олигонуклеотида | Конечная концентрация при проведении ПЦР |
Конструкция cry1A(c)-T-nos в качестве целевой последовательности | ||
T51F | 5’-gAC TgC Tgg AgT gAT TAT CgA CAg A-3’ | 300 нмоль/л |
T51R | 5’-AgC TCg gTA CCT CgA CTT ATT CAg-3’ | 300 нмоль/л |
T51p | 5’-(FAM)-TCg AgT TCA TTC CAg TTA CTg CAA CAC TCg Ag-(TAMRA)-3’ | 100 нмоль/л |
FAM - 6-карбоксифлуоресцеин, TAMRA - 6-карбокситетраметилродамин. Допускается использование иных аналогичных репортерных красителей и/или тушителей. | ||
С.7.12 Отбор, транспортировка, консервация и хранение образцов
Растворы ДНК могут храниться при температуре 4°С в течение не более чем 1 нед или при температуре минус 20°С в течение более длительного времени.
С.7.13 Пробоподготовка
Репрезентативность испытуемого образца по отношению к лабораторному образцу может обеспечиваться, например, путем размола или гомогенизации. Порядок выполнения измерений и пошаговые процедуры, которым необходимо следовать, подробно описаны в ISO 21571.
С.7.14 Калибровка оборудования
Приборы (например, амплификаторы) подлежат калибровке, как описано в ISO/IEC 17025 [41].
С.7.15 Этапы проведения анализа
С.7.15.1 Общие положения
ДНК выделяется из испытуемого образца с применением соответствующего метода. Анализ ДНК включает в себя:
a) проверку количества, качества и амплифицируемости выделенной ДНК, например, с применением специфичного к целевой последовательности таксона риса метода ПЦР;
b) обнаружение конструкции cry1A(c)-T-nos средствами ПЦР в реальном времени.
С.7.15.2 Приготовление экстрактов ДНК
С.7.15.2.1 Выделение ДНК
При выделении ДНК из испытуемого образца должны соблюдаться общие инструкции и меры, описанные в ISO 21571.
Метод СТАВ был использован для экстрагирования ДНК, как указано в ISO 21571:2005 (раздел А.3), с изменениями описанными ниже. Аттестация метода выполнялась на примере выделения ДНК из тонко помолотого материала исследуемого образца массой 1 г. Изменения, внесенные в порядок экстрагирования ДНК, предполагают добавление к экстракционному буферу для СТАВ 10 мкл раствора протеиназы K в соответствии с ISO 21571:2005 (пункт А.3.1.5.8), т.е. придание произвольному использованию протеиназы K статуса обязательного требования, а также проведение ночной инкубации при температуре 65°С с непрерывным перемешиванием.
В случае разбухания материала до такого состояния, при котором частицы суспензии теряют свою подвижность, должен использоваться дополнительный экстракционный буфер для СТАВ с целью снижения вязкости образца. Это делается поэтапно, с добавлением 1 мл экстракционного буфера для СТАВ на каждом этапе. Необходимость в добавлении буфера часто возникает при экстрагировании ДНК из рисовой лапши.
С.7.15.2.2 Количественное определение ДНК
Подробные требования см. в ISO 21571:2005 (приложение В).
С.7.15.2.3 Оценка целостности ДНК
Целостность ДНК определяется косвенным образом средствами ПЦР реального времени, специфичной к целевому таксону, что позволяет получить продукт ПЦР сопоставимой длины (см. [75]).
С.7.15.3 Реактивы для ПЦР
См. С.7.11.2.
С.7.15.4 Методика испытания
С.7.15.4.1 Порядок проведения ПЦР
Описываемая методика предназначена для работы с общим объемом 25 мкл из расчета на каждую ПЦР, с использованием реактивов, перечисленных в таблице С.31.
Перед применением реактивы осторожно оттаивают и в течение непродолжительного времени обрабатывают в центрифуге. Следят за тем, чтобы все реактивы были тщательно перемешаны непосредственно перед пипетированием. Для проведения ПЦР приготавливается смесь, содержащая все необходимые для реакции компоненты, за исключением экстракта ДНК. Количество смеси, требуемое для ПЦР-анализа, определяется исходя из количества проводимых реакций плюс по меньшей мере одна дополнительная реакция в качестве резерва для пипетирования. Используют 5 мкл экстракта ДНК.
Таблица С.31 - Набор реактивов для амплификации
Общий объем | 25 мкл | |
ДНК образца (до 200 нг) или контроли | 5 мкл | |
Буферный раствор для ПЦР (с , dNTPs и ДНК-полимеразой) | 12,5 мкл | |
Праймеры | T51F + T51R | См. таблицу С.30 |
Зонд | T51p | См. таблицу С.30 |
Вода |
| До объема 25 мкл |
а) При проведении совместных сличительных испытаний в качестве буферного раствора для ПЦР использовалась универсальная исходная смесь TaqMan (Applied Biosystems, Дармштадт). Допускается использование иных аналогичных изделий других изготовителей, если они достоверно обеспечивают получение лучших или таких же результатов.
| ||
_______________
Реактивы смешивают, обрабатывают в центрифуге в течение непродолжительного времени и при помощи пипетки помещают в реакционные флаконы из расчета 20 мкл на флакон.
С целью контроля качества реактивов, применяемых при ПЦР, при помощи пипетки помещают 5 мкл воды в соответствующий флакон.
В оставшиеся флаконы вносят 5 мкл экстракта ДНК, либо 5 мкл контрольной пробы для отрицательного контроля экстракции, либо 5 мкл контрольной пробы для положительного контроля экстракции из расчета на каждый флакон.
В случае необходимости может быть предусмотрен также контроль ингибирования при выполнении ПЦР.
Переносят флаконы в амплификатор и запускают программу "температура - время".
С.7.15.4.2 Контроли ПЦР
В качестве материала для положительного контроля могут быть использованы геномная ДНК риса линии ТТ51-1 (сорт Bt63) или серийно выпускаемые плазмиды, содержащие целевую последовательность генов.
С.7.15.4.3 Программа "температура - время"
При использовании описываемой процедуры ПЦР программа "температура - время", представленная в таблице С.32, подтвердила свою применимость.
Таблица С.32 - Программа "температура - время"
Шаг | Параметр | Температура, °С | Время | Измерения флуоресценции | Циклы | |
1 | Начальная денатурация | 95 | 10 мин | Нет | 1 | |
2 | Амплификация | Денатурация | 95 | 20 с | Нет | 45 |
|
| Отжиг и элонгация | 60 | 60 с | Да |
|
С.7.15.4.4 Критерии приемки или отбраковки
Если по причине атипичного характера данных, полученных в ходе измерений, их автоматическая интерпретация не позволяет получить удовлетворительный результат, то может возникнуть необходимость в целях успешной оценки этих данных предварительно установить базовую линию и пороговое значение вручную. В этом случае должны выполняться специальные указания по работе с программным обеспечением для оценки данных, предусмотренные в руководстве по эксплуатации соответствующего прибора.
С.7.16 Идентификация образца
Все образцы должны быть четко идентифицированы.
С.8 Специфичный к генетической конструкции метод обнаружения последовательности ctp2-cp4-epsps при скрининге компонентов генетически модифицированных организмов в пищевых продуктах
С.8.1 Назначение, важность и научное обоснование
Данный метод описывает специфичный к генетической конструкции порядок скрининга ДНК, которая может быть выделена из генетически модифицированных растений, содержащих последовательность генов ctp2-cp4-epsps.
Переход от СТР2 (хлоропластного промежуточного сигнального пептида Arabidopsis thaliana) к гену устойчивости к гербицидам cp4-epsps (гену 5-энолпирувил-шикимат-3-фосфат-синтазы штамма СР4 Agrobacterium tumefaciens) зачастую наблюдается у генетически модифицированных растений (см. [53]).
Как правило, описываемый метод может применяться не только для любых видов пищевых продуктов, но и для продуктов иного назначения (например, корма или семена). Применение метода предполагает возможность извлечения из соответствующей матрицы некоторого количества амплифицированной ДНК, достаточного для ее последующего изучения. В основу представленного метода положено проведение ПЦР-анализа в реальном времени.
Для уточнения данных, полученных при обнаружении (например, для выявления конкретного трансформационного события), требуется проведение дополнительного анализа.
С.8.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
С.8.2.1 Робастность
Робастность метода не проверялась для случаев с небольшими внесенными изменениями.
В ходе совместных сличительных испытаний робастность метода проверялась с различным оборудованием для проведения ПЦР в реальном времени (см. С.8.10.1) и различными исходными смесями (см. таблицу С.36, сноску b)). Ни использование различного оборудования для проведения ПЦР в реальном времени, ни использование различных исходных смесей не отразились на эффективности метода.
С.8.2.2 Внутри лабораторные испытания
При проведении внутрилабораторных испытаний метод обеспечил получение удовлетворительных и непротиворечивых результатов. Метод проверялся с использованием серии разбавлений ДНК, выделенной из стандартных образцов с 4,9%-ной массовой долей кукурузы NK 603 и 100%-ной массовой долей рапса GT73 соответственно. ПЦР-анализ проводился с пятью повторениями на каждом этампе разбавления. В процессе исследования ДНК GT73 относительные доверительные интервалы (Р=95%) для измеренного количества копий, равного 2000, 400, 100, 25, 10 и 5, составили 7,4%, 12,1%, 10,5%, 13,7%, 24,7% и 41,0% соответственно. В процессе исследования ДНК NK603 относительные доверительные интервалы (Р=95%) для измеренного количества копий, равного 2500, 500, 250, 50, 10 и 5, составили 5,6%, 13,9%, 3,3%, 39,4%, 52,6% и 58,8% соответственно. Метод также был испытан на эффективность с образцами ДНК, полученными из различных растений (см. С.8.2.4.3). Результаты проведенных испытаний также свидетельствуют, что метод обеспечивает получение удовлетворительных и согласованных результатов.
С.8.2.3 Совместные сличительные испытания
С.8.2.3.1 Общие положения
Эффективность метода оценивалась в рамках совместных сличительных испытаний (см. [59]), координатором которых выступало Федеральное ведомство по защите прав потребителей и безопасности пищевых продуктов и в котором приняли участие 11 лабораторий. Для анализа участники получили в свое распоряжение 12 образцов ДНК с различными концентрациями копий последовательности гена ctp2-cp4-epsps, а также 6 образцов ДНК, предположительно, не содержащих данной последовательности. Всем образцам были присвоены случайные номера.
Для экстрагирования ДНК применялся метод СТАВ, как описано в ISO 21571:2005 (раздел А.3). Приготовление образцов ДНК осуществлялось с применением геномной ДНК, выделенной из сертифицированного стандартного образца с 0,1%-ной массовой долей NK603 (ERM BF 415b производства IRMM, Гел), а также из муки, для получения которой была использована генетически не модифицированная кукуруза, или из семян рапса GT73 и сертифицированных стандартных образцов генетически не модифицированного рапса (0304-А и 0304-В производства AOCS, США). Мука из генетически не модифицированной кукурузы и генетически не модифицированные семена рапса не демонстрировали признаков амплификации в ходе предварительного ПЦР-анализа для выявления последовательности ctp2-cp4-epsps. Материалы с 0,02%-ным массовым содержанием ДНК NK603 или 0,02%-ным массовым содержанием ДНК GT73 соответственно были получены путем смешивания растворов ДНК с 0,1%-ной массовой долей NK603 или 0,1%-ной массовой долей GT73 соответственно и ДНК генетически не модифицированных кукурузы или рапса в отношении 1:5.
Аликвоты следующих растворов ДНК были представлены в качестве безымянных образцов:
a) ДНК NK603 массовой долей 0,1%, приблизительно 27 нг/мкл;
b) ДНК NK603 массовой долей 0,02%, приблизительно 27 нг/мкл;
c) ДНК генетически не модифицированной кукурузы, приблизительно 27 нг/мкл;
d) ДНК рапса GT73 массовой долей 0,1%, приблизительно 13 нг/мкл;
e) ДНК рапса GT73 массовой долей 0,02%, приблизительно 13 нг/мкл;
f) ДНК генетически не модифицированного рапса, приблизительно 13 нг/мкл.
С.8.2.3.2 Качественная оценка результатов
Результаты совместных сличительных испытаний представлены в таблице С.33.
Таблица С.33 - Результаты совместных сличительных испытаний (качественная оценка)
Параметр (межлабораторные сличения 2008 г.) | Значение |
Количество лабораторий | 11 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 11 |
Количество образцов из расчета на лабораторию | 18 |
Количество принятых результатов | 198 |
Количество образцов, содержащих последовательность ctp2-cp4-epsps | 132 |
Количество образцов, не содержащих последовательность ctp2-cp4-epsps | 66 |
Ложноположительные результаты | 13 (19,7%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
См. также С.8.2.4.3. | |
С.8.2.3.3 Полуколичественная оценка результатов
Таблица С.34 - Оценка результатов совместных сличительных испытаний (полуколичественная)
Содержание генетически модифицированных материалов (копии генетически | Количество положительных результатов/общее количество результатов | Расчетное количество копий последовательности ctp2-cp4-epsps | ||
модифицированной последовательности/геномные эквиваленты), % массовой доли |
| Среднее значение | , % , % | |
0,1% кукурузы NK603 | 33/33 | 50 | 35 | |
0,02% кукурузы NK603 | 33/33 | 11 | 41 | |
0,1% рапса GT73 | 33/33 | 36 | 32 | |
0,02% рапса GT73 | 33/33 | 9 | 50 | |
Генетически не модифицированная кукуруза | 12/33 | 0 | - | |
Генетически не модифицированный рапс | 1/33 | 0 | - | |
Среднее значение расчетного количества копий по совокупности всех анализов. Коэффициент вариации в условиях воспроизводимости. См. также С.8.2.4.3. |
| |||
Результаты, полученные двумя лабораториями, использовавшими стеклянные капилляры, были аналогичны результатам, которые были получены в ходе совместных сличительных испытаний с применением оборудования, рассчитанного на использование пластиковых реакционных флаконов, в том числе относительно чувствительности, средних значений и стандартного отклонения количества копий, а также достигаемой специфичности (данные не приводятся).
С.8.2.3.4 Чувствительность и прецизионность
В таблице С.34 дано обобщенное представление о доле положительных результатов наряду с данными прецизионности для конкретных образцов. Метод проверялся с использованием образцов, содержащих малое количество копий последовательности ctp2-cp4-epsps. Целевую последовательность ctp2-cp4-epsps удалось обнаружить во всех содержащих ее образцах. Кроме того, контроль чувствительности с применением пяти копий ДНК кукурузы NK603 позволил амплифицировать целевую последовательность ctp2-cp4-epsps во всех 22 выполненных определениях. Исходя из полученных результатов, предел обнаружения (относительно матрицы) может быть представлен как массовая доля, не превышающая 0,02% (для образцов ДНК с указанным массовым отношением количества копий ctp2-cp4-epsps к количеству копий генома соответствующих видов), или в виде абсолютного значения, составляющего не более 5 копий, как свидетельствуют испытания ДНК кукурузы NK603.
Потенциальные значения-выбросы на этапе перед расчетом данных прецизионности исключены не были. Проверка пригодности метода для выполнения количественного определения не являлась центральной задачей совместных сличительных испытаний.
С.8.2.4 Молекулярная селективность
С.8.2.4.1 Общие положения
Описание метода приведено в [59], [80]. Информация о генетической конструкции, внедренной в геном кукурузы NK603, представлена в [81].
С.8.2.4.2 Теоретическая часть
С.8.2.4.3 Экспериментальная часть
При экспериментальном оценивании специфичности метода перекрестные реакции для метода обнаружения ctp2-cp4-epsps не наблюдались в случае использования ДНК из следующих генетически модифицированных растений:
- генетически модифицированный картофель EH92-527-1 (BPS-25271-9).
Для следующих генетически модифицированных растений была экспериментально доказана пригодность метода для определения последовательности ctp2-cp4-epsps к использованию для целей скрининга:
- генетически модифицированная соя MON89788 (MON-89788-1).
Все разновидности ДНК, предназначенные для исследования в процессе испытаний на специфичность метода, были проверены на способность к амплификации и на влияние ингибиторов при помощи методов, специфичных к таксону, до начала их применения (данные не приводятся).
Существует постоянно обновляемый перечень (таблица скрининга) трансформационных событий в генетически модифицированных растениях, которые обнаруживаются (или не обнаруживаются) с применением данного метода (см. [68]).
С.8.3 Принцип и выводы
С.8.4 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения согласно ISO 5725-1 [40] и ISO 24276.
С.8.5 Типы и количество образцов
Репрезентативность испытуемого образца по отношению к лабораторному образцу может обеспечиваться, например, путем размола или гомогенизации. Порядок выполнения измерений и пошаговые процедуры, которым необходимо следовать, описаны в ISO 21571. Для проведения совместных сличительных испытаний используется набор образцов ДНК (см. С.8.2.3.1).
С.8.6 Предел обнаружения
Метод проверялся с использованием образцов, содержащих малое количество копий целевой последовательности ctp2-cp4-epsps (см. таблицу С.34). Искомую целевую последовательность удалось обнаружить во всех образцах, содержащих ctp2-cp4-epsps. Кроме того, контроль чувствительности с применением пяти копий ДНК кукурузы NK603 позволил амплифицировать целевую последовательность ctp2-cp4-epsps во всех задействованных лабораториях (22 одиночных анализа, использованы данные о результатах, полученных с применением стандартного разбавления ДНК, которое использовалось при калибровке, см. С.8.2.3.4). Исходя из полученных результатов, предел обнаружения (относительно матрицы) не превышает массовой доли 0,02% (для образцов ДНК с указанным массовым отношением количества копий ctp2-cp4-epsps к количеству геномных копий соответствующих видов) или, в абсолютном выражении, соответствует не более чем пяти копиям.
С.8.7 Расчет неопределенности измерения
В рамках совместных сличительных испытаний выполнялась оценка неопределенности. Результаты оценки представлены в С.8.2.3.2.
С.8.8 Помехи
Количество нуклеиновой кислоты, которая используется в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени, а также ее способность к амплификации имеют решающее значение для чувствительности, обеспечиваемой описанным методом. За исключением указанного общего условия, другая специализированная информация об источниках помех для данного метода отсутствует.
С.8.9 Физические условия и условия окружающей среды
Подробнее см. в ISO 24276.
С.8.10 Инструменты и оборудование
Подробные сведения об оборудовании и материалах см. в ISO 21569.
С.8.10.1 Амплификатор
Прибор для проведения ПЦР в реальном времени с применением пластиковых реакционных флаконов (обеспечивающий активацию и измерения эмиссии олигонуклеотидов, помеченных флуоресцентным красителем).
_______________
С.8.10.2 Реакционные емкости с пробками или крышками, способные выдерживать поочередное нагревание до 100°С и охлаждение до 4°С без разрушения и не оказывающие влияния на флуоресцентные сигналы, которые генерируются в процессе амплификации.
С.8.11 Реактивы и материалы
Если не указано иное, используются только реактивы, отвечающие требованиям ISO 24276, и только вода категории "для молекулярной биологии" или сопоставимой степени чистоты.
С.8.12 Отбор, транспортировка, консервация и хранение образцов
Растворы ДНК могут храниться при температуре 4°С в течение не более чем 1 нед или при температуре минус 20°С в течение более длительного времени.
С.8.13 Пробоподготовка
См. ISO 21571.
С.8.14 Калибровка оборудования
Приборы (например, амплификаторы) подлежат калибровке, как описано в ISO/IEC 17025 [41].
С.8.15 Этапы проведения анализа
С.8.15.1 Общие положения
ДНК выделяется из испытуемого образца с применением соответствующего метода. Анализ ДНК включает в себя:
a) проверку количества, качества и амплифицируемости выделенной ДНК, например, с применением специфичного к целевому таксону метода ПЦР, см. раздел 7 и ISO 21570 [43];
b) обнаружение конструкции ctp2-cp4-epsps средствами ПЦР в реальном времени.
С.8.15.2 Приготовление экстрактов ДНК
Общие инструкции и меры, а также соответствующие методы выделения ДНК описаны в ISO 21571.
С.8.15.3 Реактивы для ПЦР
С.8.15.3.1 Термостабильная ДНК-полимераза (для горячего старта ПЦР).
В качестве буферных растворов для ПЦР могут использоваться готовые смеси реактивов или их отдельные компоненты. При проведении совместных сличительных испытаний использовались буферные растворы, указанные в сноске b) таблицы С.36.
С.8.15.3.3 Олигонуклеотиды
См. таблицу С.35.
Таблица С.35 - Олигонуклеотиды
Название | Последовательность ДНК олигонуклеотида | Конечная концентрация при проведении ПЦР |
ctp2-cp4-epsps в качестве целевой последовательности (см. [59]) | ||
GT73-F | 5’-ggg ATg ACg TTA ATT ggC TCT g-3’ | 375 нмоль/л |
GT73-R | 5’-ggC TgC TTg CAC CgT gAA-3’ | 375 нмоль/л |
GT73-TMP | 5’-(FAM)-CAC gCC gTg gAA ACA gAA gAC ATg ACC-(TAMRA)-3’ | 150 нмоль/л |
FAM - 6-карбоксифлуоресцеин, TAMRA - 6-карбокситетраметилродамин. Допускается использование иных аналогичных репортерных красителей и/или тушителей, если они достоверно обеспечивают получение лучших или таких же результатов. | ||
С.8.16 Методика испытания
С.8.16.1 Порядок проведения ПЦР
Описываемая методика предназначена для работы с общим объемом 25 мкл из расчета на каждую ПЦР, с использованием реактивов, перечисленных в таблице С.36.
Перед применением реактивы осторожно оттаивают и в течение непродолжительного времени обрабатывают в центрифуге. Следят за тем, чтобы все реактивы были тщательно перемешаны непосредственно перед пипетированием. Для проведения ПЦР приготавливается смесь, содержащая все необходимые компоненты, за исключением экстракта ДНК. Количество смеси, требуемое для ПЦР-анализа, определяется исходя из количества проводимых реакций плюс по меньшей мере одна дополнительная реакция в качестве резерва для пипетирования.
Экстракт ДНК отбирают частями по 5 мкл.
Таблица С.36 - Набор реактивов для амплификации последовательности ДНК ctp2-cp4-epsps (из расчета на реакционный флакон)
Общий объем | 25 мкл | |
ДНК образца (до 200 нг) или контроли | 5 мкл | |
Буферный раствор для ПЦР (с , dNTPs и ДНК-полимеразой) | 12,5 мкл | |
Праймеры | GT73-TMF и GT73-TMR | См. таблицу С.35 |
Зонд | GT73-TMP | См. таблицу С.35 |
Вода |
| До 25 мкл |
В ходе совместных сличительных испытаний применялись растворы ДНК, содержащие приблизительно 50000 копий геномной ДНК соответствующих видов из расчета на одну исследуемую пробу. В ходе совместных сличительных испытаний в качестве буферного раствора для ПЦР применялась универсальная исходная смесь TaqMan (Applied Biosystems, Дармштадт) вместе с соответствующим оборудованием для выполнения ПЦР в реальном времени производства компании Applied Biosystems; набор для ПЦР QuantiTect Probe (Qiagen GmbH, Хильден) применялся при использовании другого оборудования для выполнения ПЦР в реальном времени с пластиковыми реакционными сосудами; исходная смесь QuantiTect Multiplex PCR No-Rox (Qiagen GmbH, Хильден) применялась при использовании оборудования для выполнения ПЦР со стеклянными капиллярами. Допускается использование иных аналогичных изделий других изготовителей, если они достоверно обеспечивают получение лучших или таких же результатов. | ||
_______________
Реактивы смешивают, обрабатывают в центрифуге в течение непродолжительного времени и помещают в реакционные флаконы из расчета 20 мкл на флакон.
С целью контроля качества реактивов, применяемых при ПЦР, при помощи пипетки помещают 5 мкл воды в соответствующий флакон.
В оставшиеся флаконы вносят 5 мкл экстракта ДНК, либо 5 мкл контрольной пробы для отрицательного контроля экстракции, либо 5 мкл контрольной пробы для положительного контроля экстракции из расчета на каждый флакон.
В случае необходимости может быть предусмотрен также контроль ингибирования при выполнении ПЦР.
Переносят флаконы в амплификатор и запускают программу "температура - время".
С.8.16.2 Контроли ПЦР
В качестве положительного контроля можно использовать сертифицированные стандартные образцы ДНК NK603 (материалы с 0,1%-ной массовой долей компонентов генетически модифицированных растений), выпускаемые Институтом стандартных образцов и измерений (IRMM), Гел, Бельгия (IRMM-410). Рекомендуется проводить дополнительный контроль на уровне предела обнаружения, например, с "0,02%-ной массовой долей NK 603" путем приготовления смеси ДНК из материала с 0,1%-ным массовым содержанием NK603 и ДНК генетически не модифицированной кукурузы (см. С.8.2.3.1).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
С.8.16.3 Приготовление стандартной ДНК для калибровки
Раствор ДНК с известным значением концентрации (нг/мкл) и количеством копий ctp2-cp4-epsps, рассчитанным на основе этой концентрации.
На основе геномных эквивалентов может быть вычислено соответствующее количество копий последовательности ctp2-cp4-epsps. При этом должно учитываться количество вставок в растительный геном, а также степень зиготности используемого растительного материала.
С.8.16.4 Программа "температура - время"
При использовании описываемой процедуры ПЦР программа "температура - время", представленная в таблице С.37, подтвердила свою применимость для работы с пластиковыми реакционными флаконами.
Таблица С.37 - Программа "температура - время" для пластиковых реационных флаконов
Шаг | Параметр | Температура, °С | Время | Измерения флуоресценции | Циклы | |
1 | Начальная денатурация | 95 | 10 мин | Нет | 1 | |
2 | Амплификация | Денатурация | 95 | 15 с | Нет | 45 |
|
| Отжиг и элонгация | 60 | 60 с | Да |
|
_______________
С.8.16.5 Критерии приемки или отбраковки
Если по причине атипичного характера данных, полученных в ходе измерений, их автоматическая интерпретация не позволяет получить удовлетворительный результат, то может возникнуть необходимость в целях успешной оценки этих данных предварительно установить базовую линию и пороговое значение вручную. В этом случае должны выполняться специальные указания по работе с программным обеспечением для оценки данных, предусмотренные в руководстве по эксплуатации соответствующего прибора.
С.8.17 Идентификация образца
Целевая последовательность считается обнаруженной, если:
b) в контрольных реакциях ПЦР без добавления ДНК (контроль реагентов ПЦР, отрицательный контроль экстракции) не наблюдается возрастание уровня флуоресценции, обусловленного амплификацией;
Все образцы должны быть четко идентифицированы.
С.8.18 Выполнение вычислений
Результаты совместных сличительных испытаний подтверждают заключение о том, что данный метод пригоден для скрининга с целью выявления компонентов ГМО и количественного определения целевой последовательности генетической конструкции ctp2-cp4-epsps. Тем не менее результаты, полученные путем количественной оценки числа копий конструкции ctp2-cp4-epsps, могут быть использованы для определения состава генетически модифицированных материалов только при наличии соответствующих сведений о количестве вставок ctp2-cp4-epsps и степени зиготности видов растений, присутствие которых удается обнаружить в исследуемом образце.
Разделы С.6-С.8 (Введены дополнительно, Изм. N 1).
Приложение D
(справочное)
Методы, специфичные к трансформационным событиям
D.1 Специфичный к трансформационному событию метод обнаружения модифицированных последовательностей ДНК из генетически модифицированной кукурузы МON 810
D.1.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения генетически модифицированной, защищенной от насекомых-вредителей кукурузы MON 810 в сырье путем амплификации однокопийной области границы интеграции последовательности генома и последовательности вставки, включающей в себя промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, соединенных путем рекомбинации in vitro.
Этот метод не позволяет распознавать селекционные сорта со сложным геномом, за исключением применения метода на отдельных зернах и растениях.
D.1.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
D.1.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод был метрологически аттестован в совместном сличительном испытании [20], проведенном под руководством рабочей группы "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV). Количество участников, а также количество образцов устанавливали в соответствии с критериями ISO 5725-2. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3.
Для совместных сличительных испытаний были подготовлены образцы муки (перемолотые зерна) из кукурузы MON 810 DK 513/59179 (0,1%, 1%), Т25 (0,1%, 1%) и из немодифицированной кукурузы. Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблицах D.1 и D.2.
Таблица D.1 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 2001 |
Количество лабораторий | 16 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 16 |
Количество образцов на лабораторию | 5 |
Количество принятых результатов | 75 |
Количество образцов, содержащих кукурузу MON 810 | 31 |
Количество образцов, содержащих кукурузу Т25 | 33 |
Количество образцов, содержащих немодифицированную кукурузу | 11 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
Таблица D.2 - Подробные результаты совместных сличительных испытаний
Тип образца | Количество образцов | Правильно | Неправильно |
Образцы, не содержащие MON 810 | |||
0% ГМО | 11 | 11 | 0 |
0,1% Т25 | 18 | 18 | 0 |
1% Т25 | 15 | 15 | 0 |
Образцы, содержащие MON 810 | |||
0,1% MON 810 | 13 | 13 | 0 |
1% MON 810 | 18 | 18 | 0 |
D.1.2.2 Молекулярная специфичность
D.1.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод описан в ссылке [20].
Примечание - Информация о последовательности для разработки этого метода была предоставлена компанией Monsanto.
Информация о генетической конструкции, перенесенной в геном кукурузы, приводится в ссылке [38].
D.1.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (база данных GenBank®, BlastN® 2.2.1, по состоянию на 1 июля 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированной кукурузой, а также с другими сельскохозяйственными растениями. Более того, набор праймеров был подобран для амплификации специфической последовательности ДНК, присутствующей только в искусственной и не встречающейся в природе области стыка (участок границы вставки).
D.1.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированной кукурузы, генетически модифицированной сои GTS 40-3-2 (соя RoundUp Ready®) или кукурузы линий Event 176 (Bt 176), Bt 11 и Т 25, не наблюдали амплификации.
Количество копий последовательностей равно одному.
D.1.2.3 Предел обнаружения
D.1.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
D.1.4 Принцип
Ген Bt присутствует в почвенной бактерии Bacillus thuringiensis подвид kurstaki. Белок, синтезируемый в тканях генетически модифицированного растения с перенесенным геном Bt, защищает растение от поражения личинками европейского зернового сверлильщика. Белок Bt активизируется в кишечнике этих насекомых, приводя к образованию пор в мембране клетки, что вызывает нарушение осмотического баланса и лизис клеток.
Принцип метода заключается в амплификации методом ПЦР фрагмента ДНК длиной 170 п.н., охватывающего стык между промотором 35S вируса мозаики цветной капусты и последовательностью генома кукурузы. Полученный продукт ПЦР может быть обнаружен с помощью электрофореза в агарозном геле. Проверка специфичности продукта ПЦР должна выполняться с помощью описанного далее рестрикционного анализа (см. D.1.8).
D.1.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
D.1.5.1 Вода
D.1.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP = 2,5 ммоль/л (каждого).
D.1.5.5 Олигонуклеотиды
Информация по участку границы вставки была опубликована [38] в позиции базы данных N AF434709.
D.1.5.5.1 Прямой праймер
VW01: 5’-TCg AAg gAC gAA ggA CTC TAA Cg-3’.
Позиция N AF434709. Праймер локализован на геноме кукурузы.
D.1.5.5.2 Обратный праймер
VW03: 5’-ТСС АТС ТТТ ggg АСС ACT gTC g-3’.
Позиции (в базе данных GenBank®) N V00141, J02048. Праймер локализован на промоторе 35S вируса мозаики цветной капусты.
D.1.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
D.1.5.7 Рестриктаза: Mwo I и Нае III.
D.1.6 Оборудование
D.1.6.1 Амплификатор
D.1.6.2 Камера для электрофореза, с источником питания.
D.1.7 Процедура анализа
D.1.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице D.3. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице D.3.
Таблица D.3 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 2 |
Вода |
| 14,8 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 2 ммоль/л | 2,0 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,4 ммоль/л | 1,0 |
Праймер VW01, 10 мкмоль/л | 0,5 мкмоль/л | 1,25 |
Праймер VW03, 10 мкмоль/л | 0,5 мкмоль/л | 1,25 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 1 IU | 0,2 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 2 ммоль/л. | ||
D.1.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительного контроля можно использовать сертифицированные референсные материалы IRMM-413 (производства IRMM).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
D.1.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица D.4 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 12 мин/95°С |
Амплификация | 30 с/95°С |
| 30 с/64°С |
| 30 с/72°С |
Количество циклов | 40 |
Завершающая полимеризация | 10 мин/72°С |
D.1.8 Специфичность продукта ПЦР
Проверка специфичности амплифицированного продукта может быть выполнена с помощью рестрикционного анализа с использованием ферментов Нае III или Mwo I. Рестрикция ферментом Нае III дает два фрагмента длиной 126 и 44 п.н. соответственно. Рестрикция ферментом Mwo I дает два фрагмента длиной 109 и 61 п.н. соответственно.
D.1.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных референсных материалов, приготовленных из кукурузы MON 810 (например, серия IRMM-413 производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в D.1.8.
Обнаружение фрагментов с размером 170 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК из генетически модифицированной кукурузы MON 810 в пределах установленных параметров специфичности, описанных в D.1.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
D.2 Специфичный к трансформационным событиям метод обнаружения линии рапса RT73
D.2.1 Назначение, важность и научное обоснование
Ниже представлена оценка применимости метода, специфичного к трансформационным событиям, для обнаружения генетически модифицированного рапса RT73 в пищевых продуктах. Он может быть использован в целях выявления как генетически модифицированного рапса RT73, так и производных от него продуктов. В основу метода положена амплификация ДНК в процессе качественного ПЦР-анализа.
D.2.2 Принцип
Данный метод описывает порядок обнаружения рапса RT73 средствами специфичной к трансформационным событиям качественной ПЦР, предусматривающей амплификацию однокопийной области границы интеграции ДНК генома рапса и последовательности вставки.
Применимость метода, специфичного к трансформационным событиям, оценивалась в рамках совместных сличительных испытаний с использованием смесового порошка, содержащего различные количества семян рапса RT73 наряду с семенами обычного рапса.
Примечание - Обнаружение продуктов ПЦР только с применением электрофореза в агарозном геле не удовлетворяет требованию о наличии проверочного этапа, специфичного к определенной последовательности генов. Проверка молекулярного состава продуктов ПЦР может осуществляться, например, путем секвенирова-ния, расщепления двумя рестриктазами и/или зондовой гибридизации, которая не рассматривалась при проведении метрологической аттестации метода, описанной в настоящем приложении.
D.2.3 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
D.2.3.1 Робастность метода
Робастность ПЦР-анализа качественным методом, специфичным к трансформационным событиям, проверялась при трех различных температурах отжига (58°С, 59°С и 60°С), тремя навесками ДНК RT73 (10, 1 и 0,1 нг, что соответствует приблизительно 7500, 750 и 75 копиям гаплоидной геномной ДНК) и тремя повторениями на каждый образец. Результаты проведения ПЦР качественным методом убедительно показали, что в ходе выполняемых реакций образуются цепочки ДНК одинакового размера независимо от температуры отжига и количества матричной ДНК. Последняя в перечисленном ряду температура отжига, равная 59°С, была выбрана с учетом наибольшей интенсивности сигнала при наименьшей концентрации матричной ДНК (0,1 нг).
_______________
D.2.3.2 Внутри лабораторные испытания
_______________
D.2.3.3 Совместные исследования
GMDL-SHCIQ было организовано совместное исследование в целях аттестации специфичного к трансформационным событиям метода обнаружения рапса RT73 (см. [57]). В указанном исследовании приняли участие 12 лабораторий из Канады, Словении, Нидерландов, Германии, Аргентины и Китая.
Рабочий процесс совместных сличительных испытаний включал в себя следующие этапы:
_______________
- спектрометрическое определение общего количества выделенной ДНК в соответствии с методом, описанным в ISO 21571:2005 (раздел В.1);
- ПЦР, проводимую качественным методом для анализа выделенной ДНК;
- электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле и запись результатов визуализации.
Совместные сличительные испытания проводились в соответствии с ISO 5725-2 [39], в частности с соблюдением требований к мере прецизионности (т.е. повторяемости и воспроизводимости) и правильности.
Применимость специфичного к трансформационным событиям метода для обнаружения RT73 оценивалась с использованием двойных слепых образцов сухого смесового порошка, содержащего различные концентрации семян рапса RT73 и обычного рапса. Каждая лаборатория получила 10 двойных слепых образцов сухого порошка с массовой долей 5%, 1%, 0,1%, 0,05%, 0,01% рапса RT73 в смеси с генетически не модифицированным рапсом.
Результаты совместных сличительных испытаний представлены в таблице D.5. Доля достоверных обнаружений для образцов, содержащих по массе 5%, 1%, 0,1%, 0,05% и 0,01% генетически модифицированного рапса RT73 составила 100%, 100%, 100%, 70,8% и 37,5% соответственно. Было доказано, что предел обнаружения специфичного к трансформационным событиям метода для RT73 соответствует массовой доле ГМО, не превышающей 0,1%.
Примечание - Обнаружение продуктов ПЦР только с применением электрофореза в агарозном геле не удовлетворяет требованию о наличии проверочного этапа, специфичного к определенной последовательности генов. Проверка молекулярного состава продуктов ПЦР может осуществляться, например, путем секвенирования, расщепления двумя рестриктазами и/или зондовой гибридизации, которая не рассматривалась при проведении метрологической аттестации метода, описанной в настоящем приложении.
Таблица D.5 - Результаты совместных сличительных испытаний для метода обнаружения RT73, специфичного к трансформационным событиям
Параметр (сличительные испытания 2006 г.; образец: рапсовая мука RT73) | Значение | ||||
Количество лабораторий | 12 | ||||
Количество лабораторий, подвергнутых оценке | 12 | ||||
Количество образцов из расчета на лабораторию | 10 | ||||
Общее количество образцов | 120 | ||||
Количество принятых результатов | 120 | ||||
Количество образцов, содержащих рапс RT73 | 120 | ||||
Целевой материал для обнаружения, % массовой доли | 5,0 | 1,0 | 0,1 | 0,05 | 0,01 |
Количество образцов | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 |
Количество положительных заключений | 24 | 24 | 24 | 17 | 9 |
Количество ложноотрицательных заключений | 0 | 0 | 0 | 7 | 17 |
Количество ложноположительных заключений | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Доля положительных результатов, % | 100 | 100 | 100 | 70,8 | 37,5 |
Доля ложноотрицательных заключений, % | 0 | 0 | 0 | 29,2 | 62,5 |
Доля ложноположительных заключений, % | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
D.2.3.4 Молекулярная селективность
D.2.3.4.1 Общие положения
Для обнаружения ДНК генома RT73 методом, специфичным к трансформационным событиям, выполнялась амплификация фрагмента размером 204 п.н., охватывающего стык 3’-концевого участка вставки в геном растения, при помощи специфичных праймеров: RТ73-праймер F и RТ73-праймер R.
D.2.3.4.2 Экспериментальная часть
D.2.3.4.3 Теоретическая часть
Теоретическая специфичность праймеров RT73-пpaймep F и RT73-пpaймep R оценивалась путем анализа последовательностей с использованием программы BLASTN 2.0MP-WashU (см. [82]). Искомая последовательность размером 204 п.н. является частью патентованных последовательностей АХ685147 и ЕА327697. Гомологичные последовательности ДНК у генетически не модифицированного рапса, других генетически модифицированных линий рапса и иных сельскохозяйственных культур обнаружены не были (дата поиска: 2010-02-18). Кроме того, используемый набор праймеров был предназначен для амплификации специфической последовательности ДНК, присутствующей только в искусственной, не встречающейся в природе области стыка.
D.2.4 Принцип и выводы
Данный метод представляет собой процедуру специфичного к трансформационным событиям качественного ПЦР-анализа, который направлен на обнаружение 3’-концевой стыковой последовательности с целью определения присутствия генетически модифицированного рапса RT73. Применимость описанного метода, специфичного к трансформационным событиям, и соответствующего предела обнаружения, обеспечиваемого при ПЦР-анализе, признается доказанной.
Примечание - Обнаружение продуктов ПЦР только с применением электрофореза в агарозном геле не удовлетворяет требованию о наличии проверочного этапа, специфичного к определенной последовательности генов. Проверка молекулярного состава продуктов ПЦР может осуществляться, например, путем секвенирования, расщепления двумя рестрикгазами и/или зондовой гибридизации, которая не рассматривалась при проведении метрологической аттестации метода, описанной в настоящем приложении.
D.2.5 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения согласно ISO 5725-1 [40] и ISO 24276.
D.2.6 Типы и количество образцов
Далее в качестве примера представлены данные сличительных испытаний по типам образцов и их количеству, достаточному для реализации описываемого метода.
Сухие образцы семян RT73 и генетически не модифицированного рапса предварительно измельчались в порошок с помощью криомельницы.
_______________
Взвешенные количества рапса RT73 и соответствующие количества генетически не модифицированного рапса одновременно помещались во флаконы для помола вместимостью 50 мл (общая масса 40,0000 г).
Образцы перемалывались в криогенной мельнице в среде жидкого азота в течение 10 мин, после чего флаконы выдерживались с закрытой крышкой при комнатной температуре в течение 1-2 дн.
Если внешняя поверхность флаконов при комнатной температуре сохраняла стабильное состояние и на ней отсутствовала конденсированная влага, такие смешанные порошкообразные образцы развешивались в склянки малой вместимости, по 1 г в каждую склянку.
Массовое содержание генетически модифицированного рапса RT73 в генетически не модифицированном рапсе для полученных в результате смешанных образцов составляло 5%, 1%, 0,1%, 0,05% и 0,01%. Проверка указанных образцов на однородность осуществлялась путем случайного отбора 10 склянок из каждой партии образцов с массовой долей RT73, составляющей 5%, 1% и 0,1% соответственно. Результаты показали, что матрицы ДНК, выделенные из сухого порошка в 30 склянках, с массовым содержанием компонента RT73 5%, 1% и 0,1%, пригодны для амплификации целевых фрагментов ДНК.
Участники получили в свое распоряжение следующие образцы:
- 10 двойных слепых образцов порошка из семян рапса, содержащих по массе 5%, 1%, 0,1%, 0,05%, 0,01% рапса RT73, по две склянки на каждое значение концентрации, по 1 г на каждую склянку;
- порошок семян рапса RT73 (с 10%-ной массовой долей компонента RT73) в качестве положительного контроля, кодированный обозначением "P", 1 г;
- порошок семян генетически не модифицированного рапса в качестве отрицательного контроля, с кодовой пометкой "N", 1 г;
_______________
- пару праймеров RT73-пpaймep F/R, последовательность праймеров и размер ампликона показаны в таблице D.6.
D.2.7 Предел обнаружения и диапазон применения
Абсолютный предел обнаружения соответствовал массе ДНК генома рапса RT73 0,1 нг, что сопоставимо приблизительно с 75 копиями гаплоидного генома рапса (см. ISO/TS 21098 [42]). Относительный предел обнаружения для качественного ПЦР-анализа соответствовал массовой доле 0,1% RT73, содержащегося в 20 нг ДНК генома рапса. Наименьшее значение массовой доли целевой последовательности RT73 в процессе совместных сличительных испытаний составило 0,01%.
Специфичный к трансформационным событиям ПЦР-анализ для RT73, проводимый качественным методом, использовался с целью однозначного определения образцов с массовым содержанием рапса RT73 от 0,1% до 100%.
D.2.8 Расчет неопределенности измерения
Оценка воспроизводимости метода дается исходя из результатов сличительных испытаний.
D.2.9 Помехи
Количество, качество, а также способность к амплификации матрицы нуклеиновых кислот оказывают непосредственное влияние на получаемый аналитический результат (см. ISO 21571). Отсюда следует необходимость контроля нуклеиновой кислоты, используемой для анализа, например, с применением специфичного к целевому таксону метода ПЦР.
D.2.10 Физические условия и условия окружающей среды
Подробнее см. в ISO 24276, в частности о следующем:
- должно обеспечиваться строгое разделение рабочих зон для подготовки ДНК, проведения ПЦР, амплификации и электрофореза;
- перед повторным использованием оборудования с него должны удаляться все остаточные следы ДНК;
- во избежание загрязнения для пипеток должны использоваться аэрозольустойчивые наконечники с фильтром;
- применяемые перчатки не должны иметь посыпки и должна обеспечиваться их частая смена.
D.2.11 Инструменты и оборудование
Все применяемое оборудование должно быть откалибровано в соответствии с ISO/IEC 17025 [41].
D.2.11.1 Оборудование для выделения ДНК
D.2.11.1.1 Водяная баня или термостат.
D.2.11.1.2 Микроцентрифуга.
D.2.11.1.3 Микропипетки.
D.2.11.1.4 Мешалка, например вихревая.
D.2.11.1.5 Пробирки для микроцентрифуги вместимостью 1,5/2,0 мл.
D.2.11.1.6 Наконечники и наконечники с фильтром для микропипеток.
D.2.11.1.7 Штатив для реакционных пробирок.
D.2.11.1.8 Перчатки, ПВХ или латексные.
D.2.11.1.9 Вакуумная сушилка, пригодная для высушивания осажденной ДНК (не обязательно).
D.2.11.2 Оборудование для количественного определения ДНК
D.2.11.2.1 УФ-спектрофотометр с простым пучком, двойным пучком или также с детектором на фотодиодном массиве либо флуориметр, пригодный для количественного определения с использованием флуоресцентных красителей.
D.2.11.2.2 Измерительные емкости, например кварцевые или пластиковые кюветы, пригодные для УФ-обнаружения на длине волны 260 нм. От размера измерительных емкостей зависит объем измеряемых образцов. Могут использоваться емкости следующих размеров: полумикрокюветы (1000 мкл), микрокюветы (400 мкл), ультрамикрокюветы (100 мкл) и кварцевые капилляры (от 3 до 5 мкл). Оптический путь стандартной кюветы обычно составляет 1 см.
D.2.11.3 Оборудование для проведения ПЦР-анализа качественным методом
D.2.11.3.1 Амплификатор
_______________
D.2.11.3.2 Оборудование для электрофореза с блоком питания.
D.2.11.3.3 Микроволновая печь (не обязательно).
D.2.11.3.4 Система визуализации для гелевого анализа.
D.2.11.3.5 Микроцентрифуга.
D.2.11.3.6 Морозильник, обеспечивающий температуру минус 20°С, и холодильник, обеспечивающий температуру 4°С.
D.2.11.3.7 Микропипетки.
D.2.11.3.8 Мешалка, например вихревая.
D.2.11.3.9 Пробирки для микроцентрифуги вместимостью 0,2, 1,5, 2,0 мл.
D.2.11.3.10 Наконечники и наконечники с фильтром для микропипеток.
D.2.11.3.11 Штатив для реакционных пробирок.
D.2.12 Реактивы и материалы
Если не указано иное, используются только реактивы, отвечающие требованиям ISO 24276, и только вода категории "для молекулярной биологии" или сопоставимой степени чистоты.
D.2.12.1 Выделение ДНК
_______________
D.2.12.2 Качественная ПЦР
Требования к качеству применяемых реактивов см. в ISO 24276:2006 (пункт 5.3.5).
D.2.12.2.3 Раствор dNTP, с (dNTP) = 2,5 ммоль/л (каждый).
D.2.12.2.4 Олигонуклеотиды, см. таблицу D.6.
D.2.12.2.5 Полимераза ДНК, термостабильная, 5 МЕ/мкл.
D.2.12.2.6 Размерный стандарт ДНК.
D.2.12.2.7 Загрузочный буфер.
D.2.12.2.8 Электрофорезный буфер.
D.2.12.2.9 Агароза.
D.2.13 Отбор, транспортировка, консервация и хранение образцов
Растворы ДНК могут храниться при температуре 4°С в течение не более чем 1 нед или при температуре минус 20°С в течение более длительного времени.
D.2.14 Подготовка испытуемого образца
Каждому участнику было передано 10 двойных слепых образцов смесового порошка из семян рапса с различным массовым содержанием RT73, в том числе 5%, 1%, 0,1%, 0,05% и 0,01%, один образец порошка из семян рапса RT73 в качестве положительного контроля и один образец порошка из семян обычного рапса в качестве отрицательного контроля.
Для каждого образца экстрагирование ДНК выполнялось один раз. Анализ каждого испытуемого образца проводился средствами ПЦР. Совместное исследование было организовано в форме двойных слепых сличительных испытаний.
D.2.15 Калибровка оборудования
Используемые приборы, например амплификаторы и пипетки, должны быть откалиброваны, как указано в ISO/IEC 17025 [41].
D.2.16 Этапы проведения анализа
D.2.16.1 Приготовление экстрактов ДНК
D.2.16.1.1 Выделение ДНК
_______________
D.2.16.1.2 Количественное определение ДНК
Спектрофотометрическое количественное определение выделенной ДНК осуществляется по методу, описанному в ISO 21571:2005 (раздел В.1).
D.2.16.2 Оценка целостности ДНК
Целостность выделенной ДНК оценивалась с применением электрофореза в агарозном геле.
D.2.17 Реактивы для ПЦР
D.2.17.1 Термостабильная ДНК-полимераза, буферы и т.д.
Должна использоваться термостабильная ДНК-полимераза (с ферментными характеристиками, необходимыми для горячего старта), пригодная для выполнения ПЦР качественным методом. Допускается также применение реактивов и полимераз, отличных от описанных, но обеспечивающих получение лучших или таких же результатов.
D.2.17.2 Праймеры и зонд
Таблица D.6 - Последовательности праймеров для обнаружения RT73 с применением специфичного к трансформационным событиям метода ПЦР
Название | Олигонуклеотидные последовательности праймеров (5’-3’) | Размер ампликона п.н. |
RT73-праймер F | AAT AAC gCT gCg gAC ATC TA | 204 |
RT73-праймер R | CAg CAA gAT TCT CTg TCA ACA A |
|
D.2.18 Методика испытания
D.2.18.1 Общие положения
Методика выполнения качественного ПЦР-анализа для RT73 разработана из расчета на общий объем 25 мкл на одну реакцию и на использование реактивов, перечисленных в таблице D.7. На каждую реакцию добавляются по 20 нг матричной ДНК.
Перед проведением ПЦР исходную реакционную смесь оттаивают, осторожно перемешивают и обрабатывают в центрифуге. Размороженные реактивы сохраняют на льду при температуре от 1°С до минус 4°С.
Добавляют компоненты согласно таблице D.7. До выполнения амплификации рекомендуется приготовить исходную реакционную смесь для ПЦР.
Распределяют исходную смесь и добавляют образцы ДНК, включая слепые образцы, положительную контрольную пробу, отрицательную контрольную пробу, а также холостую пробу (воду).
Осторожно перемешивают содержимое пробирок для ПЦР (или планшета) и обрабатывают их в микроцентрифуге в течение непродолжительного времени.
Помещают пробирки (или планшет) в амплификатор.
Запускают программу ПЦР с параметрами, описанными в таблице D.8.
По завершении программы ПЦР помещают по 2 мкл загрузочного буфера в каждую реакционную пробирку и смешивают с продуктами ПЦР.
Вносят по 10 мкл каждого продукта ПЦР и размерного стандарта ДНК в лунки с гелем для электрофореза (20 г/л агарозы, 0,5 мкг/мл бромистого этидия).
Обрабатывают гель в камере для электрофореза при 5 В/см в течение 20 мин.
Визуализируют результаты разделения и фиксируют их при помощи соответствующей системы для анализа результатов.
Таблица D.7 - Набор реактивов для обнаружения RT73 средствами ПЦР (из расчета на реакционный флакон)
Реактив | Конечная концентрация | Объем на реакцию, мкл |
Образец ДНК | 20 нг | 1 |
Вода |
| 15,8 |
Буфер ПЦР х10 (без добавления ) | 1х | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTPs, 2,5 ммоль/л (каждый) | 0,2 ммоль/л (каждый) | 2 |
RT73-праймер F, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
RT73-праймер R, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
Термостабильная (Taq) ДНК-полимераза, 5 МЕ/л | 1 ME | 0,2 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержал , конечная концентрация в реакционной смеси доводится до 1,5 ммоль/л. | ||
D.2.18.2 Контроли ПЦР
При каждом ПЦР-анализе испытанию подлежат положительная контрольная проба, отрицательная контрольная проба и холостая проба (вода). Подробнее см. в ISO 24276.
D.2.18.3 Подготовка стандартов
Наличие положительной контрольной пробы, отрицательной контрольной пробы и холостой пробы (воды) предусматривается при проведении ПЦР-анализа качественным методом.
Примечание - На рынке доступны серийно выпускаемые размерные стандарты ДНК, служащие для определения длины продуктов ПЦР.
D.2.18.4 Программа "температура - время"
_________________
Таблица D.8 - Программа "температура - время"
Активация и начальная денатурация | 3 мин/94°С |
Амплификация | 30 с/94°С |
| 30 с/59°С |
| 40 с/72°С |
Количество циклов | 40 |
Окончательная элонгация | 3 мин/72°С |
D.2.18.5 Критерии приемки или отбраковки
Для оценки результатов сличительных испытаний применяются следующие требования к эффективности метода.
Фрагмент размером 204 п.н. должен быть выявлен в положительной контрольной пробе рапса RT73 (образец Р), при этом целевой фрагмент не должен обнаруживаться в отрицательной контрольной пробе (образцы N и М) и холостой пробе. Выявление фрагмента размером 204 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК промотора рапса RT73.
Примечание - Обнаружение продуктов ПЦР только с применением электрофореза в агарозном геле не удовлетворяет требованию о наличии проверочного этапа, специфичного к определенной последовательности генов. Проверка молекулярного состава продуктов ПЦР может осуществляться, например, путем секвенирова-ния, расщепления двумя рестриктазами и/или зондовой гибридизации, которая не рассматривалась при проведении метрологической аттестации метода, описанной в настоящем приложении.
D.2.18.6 Обнаружение
На данный момент результаты идентификации могут основываться исключительно на сведениях о размере продукта ПЦР, полученных с помощью размерного стандарта ДНК. Фрагмент 204 п.н. должен представлять собой специфический продукт; присутствие других фрагментов ДНК свидетельствует о неспецифической амплификации.
D.2.19 Идентификация образца
Все слепые образцы должны четко идентифицироваться по признаку "обнаружено - не обнаружено".
D.2.20 Интерпретация и расчет результатов
Искомый ампликон для специфичного к трансформационным событиям метода обнаружения RT73 имеет размер 204 п.н.
Выявление фрагмента размером 204 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемый фрагмент ДНК, размеры которого соответствуют размерам последовательности, выделяемой из семян рапса RT73. В этом случае результаты исследования должны описываться следующим образом: "В образце X была обнаружена модифицированная последовательность, специфичная для рапса RT73".
Если амплификация искомого фрагмента ДНК длиной 204 п.н. не наблюдается, результат должен быть описан как: "В образце X, модифицированная последовательность, специфичная для рапса RT73 обнаружена не была".
В дополнение к результатам указывается предел обнаружения для проведенного анализа.
Примечание - Обнаружение продуктов ПЦР только с применением электрофореза в агарозном геле не удовлетворяет требованию о наличии проверочного этапа, специфичного к определенной последовательности генов. Проверка молекулярного состава продуктов ПЦР может осуществляться, например, путем секвенирования, расщепления двумя рестриктазами и/или зондовой гибридизации, которая не рассматривалась при проведении метрологической аттестации метода, описанной в настоящем приложении.
Раздел D.2 (Введен дополнительно, Изм. N 1).
Библиография
[1] | Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.В., Horn, G.Т., Erlich, H.A, and Arnheim, N.: Enzymatic amplification of G-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 1985, 230, pp.1350-1354 | |
| (Ферментная амплификация генетических последовательностей гемоглобина и анализ сайта рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии) | |
[2] | Mullis, K.В. and Faloona, FA: Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed reaction. Methods Enzymol., 1987, 155, pp.335-350 | |
| (Специальный синтез ДНК in vitro с катализатором полимеразой. Методы ферментологии) | |
[3] | Heaton, Р.А.: Quantification of total DNA by spectroscopy. In Analytical Molecular Biology: Quality and Validation, ed. Saunders, G.S and Parkes, H.C. RSC publications, 1999, U.K | |
| (Общая количественная оценка ДНК средствами спектроскопии. Опубликовано: Аналитическая молекулярная биология. Качество и валидация) | |
[4] | Bickley and Hopkins: Inhibitors and enhancers of PCR in Analytical Molecular Biology: Quality and Validation, ed. Saunders, G.S and Parkes, H.C. RSC publications, 1999, U.K | |
| (Ингибиторы и катализаторы ПЦР в аналитической молекулярной биологии. Качество и валидация) | |
[5] | Arumuganathan, К. and Earle, E.D.: Nuclear content of some important plant species, Plant Mol. Biol. Rep., 9 (3), 1991/pp.208-218 | |
| (Устройство клеточного ядра у некоторых важных видов растений. Молекулярная биология растений) | |
[6] | Wolf, С., Scherzinger, М., Wurz, A., Pauli, U., Hubner, P., and Luthy, J.: Detection of cauliflower mosaic virus by the polymerase chain reaction: testing of food components for false-positive 35S-promoter screening results. Eur. Food Res. Technol., 2000, 210, pp.367-372 | |
| (Обнаружение вируса мозаики цветной капусты с использованием цепной реакции полимеразы: испытания пищевых компонентов на ложноположительные результаты скрининга 35S-промотра. Европейские исследования и технология в области пищевой продукции) | |
[7] | Holst-Jensen, A., Ronning, S.B., LOVSETH, A. and Berdal, K.G.: PCR technology for screening and quantification of genetically modified organisms (GMOs). Anal. Bioanal. Chem., 2003, 375, pp.985-993 | |
| (Технология ЦПР для скрининговых испытаний и количественного определения генетически модифицированных организмов (ГМО). Аналитическая и биоаналитическая химия) | |
[8] | Detection of a genetic modification of soybeans by amplification of the modified DNA sequence by means of the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a DNA probe, No. L 23.01.22-1. Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office, Loose leaf edition as of March 1998, Berlin, Koln, Beuth Verlag GmbH | |
| (Обнаружение генетически модифицированных соевых бобов путем амплификации измененной последовательности ДНК с использованием цепной реакции полимеразы (PCR) и гибридизации продуктов ПЦР с пробой ДНК, N. L 23.01.22-1//Сборник официально утвержденных методов согласно ст.35 Федерального закона Германии о пищевых продуктах. Методы отбора проб и анализа пищевой продукции, табачной продукции, косметики и промышленных товаров/Федеральное ведомство здравоохранения, листовое издание по состоянию на март 1998 г.) | |
[9] | Report of the EU tender No. XXIV/98/A3/001. Development of qualitative as well as quantitative detection methods to Identify a genetic modification in soybean and maize. http://www.europa.eu.int/comm/food/fs/biotech/biotech02 en.html.2000 | |
| (Отчет о проведении тендера EC N XXIV/98/A3/001. Разработка методов качественного и количественного определения для обнаружения генетически модифицированных сои и кукурузы) | |
[10] | Meyer, R., Chardonnens, F., hubner, P., and Luthy, J.: Polymerase chain reaction (PCR) in the quality and safety assurance of food: detection of Soya in processed meat products. Z Lebensm. Unters. Forsch., 1996, 203, pp.339-344 | |
| (Использование цепной реакции полимеразы (ЦПР) в целях обеспечения качества и безопасности пищевой продукции: обнаружение сои в продуктах мясопереработки // Испытания и исследования пищевых продуктов) | |
[11] | Broll, H., Wagner, U., Spiegelberg, A., Zagon, J., and Schauzu, M.: Anwendung von Methoden zum Nachweis von gentechnisch veranderten Sojabohnen und gentechnisch verendertem Mais in im Handel befindlichen Lebensmitteln, Bundesgesundhblatt, 1998, 12, pp.560-562 | |
| (Применение методов обнаружения генетически модифицированных соевых бобов и генетически модифицированной кукурузы в пищевых продуктах, представленных в торговой сети // Федеральный бюллетень по здравоохранению) | |
[12] | Sambrook, J. and Russell, D.W.: Molecular cloning: a laboratory manual. 3  edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001 | |
| (Молекулярное клонирование: лабораторное руководство) | |
[13] | Detection of a genetic modification of potatoes by amplification of the modified DNA sequence using the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a DNA probe, No. L 24.01-1: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office, Loose leaf edition as of January 1997, Berlin, K6ln, Beuth Verlag GmbH | |
| (Обнаружение генетически модифицированного картофеля путем амплификации измененных последовательностей ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации продуктов с пробой ДНК, N L 24.01-1//Сборник официально утвержденных методов согласно ст.35 Федерального закона Германии о пищевых продуктах. Методы отбора проб и анализа пищевой продукции, табачной продукции, косметики и промышленных товаров/Федеральное ведомство здравоохранения, листовое издание по состоянию на январь 1997 г.) | |
[14] | Taberlet, P., Gielly, L., Pautou, G., and B.J.: Universal primers for amplification of three noncoding regions of chloroplast DNA. Plant Mol. Biol., 1991,17, pp.1105-1109 | |
| (Универсальные праймеры для амплификации трех некодирующих регионов ДНК хлоропластов. Молекулярная биология растений) | |
[15] | Detection of a genetic modification of tomatoes by amplification of the modified DNA sequence by means of the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a DNA probe or restriction analysis of the PCR product, No. L 25.03.01. Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office, Loose leaf edition as of November 1999, Berlin, Koln, Beuth Verlag GmbH | |
| (Обнаружение генетически модифицированных томатов путем амплификации измененных последовательностей ДНК с использованием цепной реакции полимеразы (ПЦР) и гибридизации продуктов ПЦР с пробой ДНК или анализа рестрикции продуктов ПЦР, N L 25.03.01//Сборник официально утвержденных методов согласно ст.35 Федерального закона Германии о пищевых продуктах. Методы отбора проб и анализа пищевой продукции, табачной продукции, косметики и промышленных товаров/Федеральное ведомство здравоохранения, листовое издание по состоянию на ноябрь 1997 г.) | |
[16] | Busch, U., Muhlbauer, В., Schulze, М., and Zagon, J.: Screening- und spezifische Nachweismethode fur transgene Tomaten (Zeneca) mit der Polymerasekettenreaktion. Deutsche Lebensmittelrundschau, 1999, Heft 2, 52-56 | |
| (Скрининг и специальная методика обнаружения трансгенных томатов (Zeneca) с использованием цепной реакции полимеразы. Германское обозрение пищевых продуктов) | |
[17] | Gierson, Е., Tucker, G.A., Keen, J., Ray, J., Bird, C.R., and Schuch, W.: Sequencing and identification of a cDNA clone for tomato polygalacturonase. Nucleic Acid Research, 1986,14, pp.8595-8603 | |
| (Секвенирование и выявление клонированной кДНК полигалактуроназы томатов. Исследования нуклеиновых кислот) | |
[18] | Smith, C.J.S., Watson, C.F., Bird, C.R., Ray, J., Schuch, W., and Gierson, D.: Expression of a truncated tomato polygalacturonase gene inhibits expression of the endogenous gene in transgenic plants. /Wo/. Gen. Genet, 1990, 224, pp.477-481 | |
| (Подавление экспрессией укороченного гена полигалактуроназы томатов экспрессии эндогенного гена у трансгенных растений. Общая генетика) | |
[19] | Broll, H., Jansen, B., Spiegelberg, A., Leffke., A., Zagon, J., and Schauzu, M.: DNA-analytische Nachweismethoden fur gentechnisch veranderte Tomaten in Tomatenprodukten. Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 1999, 95, 48-51 | |
| (Основанные на анализе ДНК методы обнаружения генетически модифицированных томатов в продуктах переработки томатов//Германское обозрение пищевых продуктов) | |
[20] | Detection of a genetic modification of maize (Zea mays L.) by amplification of the modified DNA sequence by means of the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a DNA probe or restriction analysis of the PCR product, No. L 15.05-1. Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office, Loose leaf edition as of May 2002, Berlin, Koln, Beuth Verlag GmbH | |
| (Обнаружение генетически модифицированной кукурузы (Zea mays L.) путем амплификации измененной последовательности ДНК с использованием цепной реакции полимеразы (ПЦР) и гибридизации продуктов ПЦР с пробой ДНК или анализом рестрикции продуктов ПЦР, N L 15.05-1//Сборник официально утвержденных методов согласно ст.35 Федерального закона Германии о пищевых продуктах. Методы отбора проб и анализа пищевой продукции, табачной продукции, косметики и промышленных товаров/Федеральное ведомство здравоохранения, листовое издание по состоянию на май 2002 г.) | |
[21] | Ehlers, В., Strauch, Е., Goltz, М., Kubsch, D., Wagner, H., Maidhof, H., Bendiek, J., Appel, B. and Buhk, H.-J.: Nachweis gentechnischer Veranderungen in Mais mittels PCR. Bundesgesundhbl., 1997, 4, pp.118-121 | |
| (Обнаружение генетически модифицированной кукурузы с использованием ПЦР//Федеральный бюллетень по здравоохранению) | |
[22] | Pietsch, K., Waibunger, H.U., Brodmann, P. and Wurz, A.: Screening method for the detection of genetically modified plants, Dtsch Lebensm. Rundsch. 1997, 93, pp.35-38 | |
| (Обнаружение генетически модифицированных растений методом скрининга//Германское обозрение пищевых продуктов) | |
[23] | Hemmer, W.: Foods Derived from Genetically Modified Organisms and Detection Methods. In: BATS-report (Agency for Biosafety research and assessment of technology Impacts of the Swiss priority Programme Biotechnology of the Swiss National Science Foundation, Basel, Switzerland), 1997, 2/97, pp.40-44 | |
| (Пищевые продукты, полученные из генетически измененных организмов и методы их обнаружения: отчет BATS (Агентство по исследованиям в сфере биологической безопасности и оценке технологических угроз, действующее в рамках Швейцарской программы приоритетных разработок в области биотехнологии Швейцарского национального научного общества) | |
[24] | Screening procedure for the detection of genetically modified DNA sequences in foods by identification of DNA sequences that frequently occur in genetically modified organisms. No L 00.00-31. Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office, Loose leaf edition as of September 1998, revised version: state 05/2001; Berlin, K6ln, Beuth Verlag GmbH | |
| (Процедура скрининга для определения генетически измененных последовательностей ДНК в пищевых продуктах путем выявления последовательностей ДНК, часто встречающихся в генетически модифицированных организмах. N L 00.00-31//Сборник официально утвержденных методов согласно ст.35 Федерального закона Германии о пищевых продуктах. Методы отбора проб и анализа пищевой продукции, табачной продукции, косметики и промышленных товаров/Федеральное ведомство здравоохранения, листовое издание по состоянию на сентябрь 2002 г.) | |
[25] | Lipp, М., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J., and Anklam, E.: IUPAC Collaborative trial of a method to detect genetically modified soy beans and maize in dried powder, J. АО AC Int., 1999, 82, pp.923-928 | |
| (Межлабораторные сравнительные испытания МСТПХ метода обнаружения генетически модифицированных соевых бобов и кукурузы в сухом порошке//Журнал Международной ассоциации официальной аналитической химии) | |
[26] | Brunt, A., Crabtree, K., Dallwitz, M., Gibbs, A., Watson, L: Viruses of Plants: Descriptions and Lists from the VIDE Database. 1996, 1484 pp. C.A.B. International, U.K | |
| (Возбудители вирусных заболеваний растений: описания и перечни из базы данных) | |
[27] | Qiu, S.G., Wintermantel, W.M., Sha, Y. and Schoelz, J.E.: Light-Dependent Systemic Infection of Solanaceous Species by Cauliflower Mosaic Virus Can Be Conditioned by a Viral Gene Encoding an Aphid Transmission Factor. Virology, 1997, 227, pp.180-188 | |
| (Возможность связи светозависимого системного заражения растений семейства пасленовых мозаичным вирусом цветной капусты с кодированием вирусным геном фактора переноса растительными тлями. Вирусология) | |
[28] | Schweizerisches Lebensmittelhandbuch Kapitel 52В, Eidgenossische Drucksachen- und Materialienzentrale, Bern, 1998 | |
| (Швейцарское руководство по пищевым продуктам. Глава 52В. Швейцарский центр печатных изданий и материалов) | |
[29] | van den Eede, G., Lipp, M., Eyquem, F. and Anklam, E.: Validation of an analytical method for the detection of GMO-derived DNA in processed foodstuffs. EUR 19677 EN, Report issued by the IHCP ISPRA, 2000 | |
| (Валидация аналитического метода обнаружения генетически модифицированной ДНК в продуктах пищевой переработки) | |
[30] | Lipp, М., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., van den Eede, G. and Anklam, E. Validation of a method based on polymerase chain reaction for the detection of genetically modified organisms in various processed foodstuffs. Eur Food Res. Technol., 2001, 212, pp.497-504 | |
| (Валидация метода, основанного на цепной реакции полимеразы, для обнаружения генетически модифицированных организмов в различных продуктах пищевой переработки. Европейские исследования и технология в области пищевой продукции) | |
[31] | Padgette, S.R., Kolacz, K.Н., Delanny, X., Re, D.B., LaVellee, B.J., Tinius, C.N., Rhodes, W.K., Otero, Y.I., Bary, G.F., Eichholtz, DA, Peschke, V.M., Nida, D.L, Taylor, N.B., Kishore, G.M.: Development, identification and characterization of a glyphosate-tolerant soybean line. Crop Sci. 35, 1995, pp.1451-1461 | |
| (Создание, определение и характеристика глифозат-толерантной линии соевых бобов. Растениеводство) | |
[32] | Wurz, A., Willmund, R.: Identification of transgenic glyphosate-resistant soybeans. In: G.A.Schreiber, K.W.Bogl (Eds.). Foods produced by means of genetic engineering - 2nd status report. BgVV-Heft 1/1997 (BgW, Berlin), pp.115-117 | |
| (Определение трансгенных глифозат-устойчивых соевых бобов/Г.А.Шрайбер, К.В.Богль (ред.)//Пищевые продукты, полученные средствами генной инженерии: 2-й отчет о состоянии работ/Журнал Федерального ведомства по защите потребителей и ветеринарной медицине 1/1997) | |
[33] | Straub, J.A., Hertel, С. and Hammes, W.P.: Limits of a PCR-based detection method for genetically modified soya beans in wheat bread production. Z Lebensm Unters Forsch A, 208, 1999, pp.77-82 | |
| (Ограничения, основанные на ПЦР метода обнаружения генетически модифицированных соевых бобов при производстве белого хлеба//Испытания и исследования пищевых продуктов) | |
[34] | Zimmermann, A., Luthy, J., Pauli, U.: Event specific transgene detection in Bt 11 corn by quantitative PCR at the integration site. Lebensm. - Wiss. U. Technol., 33, 2000, pp.210-216 | |
| (Ситуативное обнаружение измененных генов в зерне Bt11 при помощи количественной ПЦР на сайте интеграции. Пищевые продукты//Наука и технология) | |
[35] | Hupfer, С., Hotzel, Н., Sachse, K., Engel, K.-Н.: Detection of the genetic modification in heat treated products of Bt maize by polymerase chain reaction. Lm. Unters. Forsch., 206 (Band A), 1998, pp.203-207 | |
| (Обнаружение генетических модификаций в продуктах тепловой обработки кукурузы Bt с использованием цепной реакции полимеразы//Испытания и исследования пищевых продуктов) | |
[36] | Vaitilingom, M., Pijnenburg, H., Gendre, F. and Brignon, P.: Real-time quantitative PCR detection of genetically modified maximizer maize and RoundupReady soybean in some representative foods. J. Agric. Food Chem. 47, 1999, pp.5261-5266 | |
| (Количественное определение с использованием ПЦР генетически модифицированной кукурузы-максимайзер и сои "Раундап Реди" в некоторых важных видах пищевых продуктов//Журнал сельскохозяйственной химии и химии пищевых продуктов) | |
[37] | Matsuoka, Т., Kawashima, Y., Akiyama, Н., Miura, Н., Goda,Y., Kusakabe.Y., Isshiki, K., Toyoda, M., Hino, A.: A method of detecting recombinant DNAs from four lines of genetically modified maize. Journal of Food Hygienic Society of Japan, 41, 2000, pp.137-143 | |
| (Метод обнаружения рекомбинантных ДНК в четырех линиях генетически модифицированной кукурузы//Журнал Японского общества гигиены пищевых продуктов) | |
[38] | Holck, A., Vaitilingom, М., Didierjean, L., Rudi, K.: 5’-Nuclease PCR for quantitative event-specific detection of the genetically modified Mon810 MaisGard maize. Eur Food Res Technol, 214, 2002, pp.449-454 | |
| (ПЦР 5’-нуклеазы при ситуативном количественном определении генетически модифицированной кукурузы Mon810 MaisGard. Европейские исследования и технология в области пищевой продукции) | |
[39] | ISO 5725-2:1994 | Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method |
|
| (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерения) |
[40] | ISO 5725-1 | Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 1: General principles and definitions |
|
| (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Общие принципы и определения) |
[41] | General requirements for the competence of testing and calibration laboratories | |
|
| (Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий)
|
[42] | ISO/TS 21098 | Foodstuffs - Nucleic acid based methods of analysis of genetically modified organisms and derived products - Information to be supplied and procedure for the addition of methods to ISO 2157, ISO or ISO |
|
| (Продукты пищевые. Методы анализа генетически модифицированных организмов и производных продуктов, основанные на нуклеиновой кислоте. Предоставляемая информация и порядок дополнения методов ISO 21569, ISO 21570 или ISO 21571) |
[43] | ISO 21570:2005 | Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods |
|
| (Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Методы количественного определения на основе анализа нуклеиновых кислот) |
[44] | DING J., JIA J., YANG L, WEN H., ZHANG C, LIU W., et al. Validation of a rice specific gene, sucrose phosphate synthase, used as the endogenous reference gene for qualitative and realtime quantitative PCR detection of transgenes J. Agric. Food Chem. 2004, 52 pp.3372-3377 | |
| (Валидация специфического для риса гена сахарозо-фосфат-синтазы, выступающего в качестве эндогенного референсного гена при качественном обнаружении материалов трансгенных растений средствами ПЦР и их количественном определении в реальном времени) | |
[45] | XU J., MIAO Н., WU Н., HUANG W., TANG R., QIU M. et al. Screening genetically modified organisms using multiplex-PCR coupled with oligonucleotide microarray. Biosens. Bioelectron. 2006, 22 pp.71-77 | |
| (Скрининг генетически модифицированных организмов с использованием мультиплексной ПЦР в сочетании с анализом олигонуклеотидных микроматриц) | |
[46] | YANG L., PAN A., JIA J., DING J., CHEN J., HUANG С et al. Validation of a tomato specific gene, LAT52, used as an endogenous reference gene in qualitative and real-time quantitative PCR detection of transgenic tomatoes. J. Agric. Food Chem. 2005, 53 pp.183-190 | |
| (Валидация специфического для томатов гена LAT52, выступающего в качестве эндогенного референсного гена при качественном обнаружении материалов трансгенных томатов средствами ПЦР и их количественном определении в реальном времени) | |
[47] | YANG L., ZHANG Н., GUO J., PAN L., ZHANG D. International collaborative study for the endogenous reference gene, LAT52, used for qualitative and quantitative analysis of genetically modified tomato. J. Agric. Food Chem. 2008, 56 pp.3438-3443 | |
| (Международные совместные исследования эндогенного референсного гена LAT52, используемого для качественного и количественного анализа генетически модифицированных томатов) | |
[48] | HORWITZ W. Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies. Pure Appl. Chem. 1995, 67 pp.331-343 | |
| (Протокол для разработки, проведения и интерпретации результатов исследований, посвященных оценке эффективности методов) | |
[49] | MA Z., MICHAILIDES T.J. Approaches for eliminating PCR inhibitors and designing PCR primers for the detection of phytopathogenic fungi. Crop Prot. 2007, 26 pp. 145-161 | |
| (Подходы, применяемые к удалению ингибиторов ПЦР и разработке ПЦР-праймеров для обнаружения фитопатогенных грибов) | |
[50] | CERA. GM crop database. Washington, DC: Center for Environmental Risk Assessment, 2010. Available (viewed 2013-03-25) at: http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database | |
| (База данных генетически модифицированных растений) | |
[51] | HOLDEN M.J., LEVINE M., SCHOLDBERG Т., HAYNES R.J., JENKINS G.R. The use of 35S and Tnos expression elements in the measurement of genetically engineered plant materials. Anal. Bioanal. Chem. 2010, 396 (6) pp.2175-2187 | |
| (Использование элементов регулирования экспрессии 35S и Tnos при измерениях растительных материалов, созданных методами генной инженерии) | |
[52] | REITING R., BROLL H., WAIBLINGER H.-U., GROHMANN L. Collaborative study of a T-nos Real-time PCR method for screening of genetically modified organisms in food products. J. Verbr. Lebensm. 2007, 2 pp.116-121 | |
| (Совместное исследование метода определения T-nos средствами ПЦР в реальном времени для скрининга генетически модифицированных организмов в пищевых продуктах) | |
[53] | WAIBLINGER H.U., GROHMANN L., MANKERTZ J., ENGELBERT D., PIETSCH K. A practical approach to screen for authorised and unauthorised genetically modified plants. Anal. Bioanal. Chem. 2010, 396 (6) pp.2165-2172 | |
| (Практический подход к проведению скрининговых исследований для выявления разрешенных и неразрешенных генетических модификаций растений) | |
[54] | HOLLAND P.M., ABRAMSON R.D., WATSON R., GELFAND D.H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’-3’ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991, 88 pp.357-362 | |
| (Обнаружение специфических продуктов цепной реакции полимеразы на основе активности 5’-3’экзонуклеазы в составе полимеразы ДНК Thermus aquaticu) | |
[55] | ARUMUGANATHAN K., EARLE E.D. Nuclear content of some important plant species. Plant Mol. Biol. Rep. 1991, 9 pp.208-21 | |
| (Состав клеточного ядра некоторых важнейших видов растений) | |
[56] | SCIENTIFIC PANEL ON GENETICALLY MODIFIED ORGANISMS. On a request from the Commission related to the safety of foods and food ingredients derived from herbicide-tolerant genetically modified maize NK603, for which a request for placing on the market was submitted under Article 4 of the Novel Food Regulation (EC) No 258/97 by Monsanto (2003) [Opinion]. Eur. Food Saf. Author. J. 2003, 9, pp.1-14. Available (viewed 2013-03-25) at: http://www.efsa. europa.eu/de/efsajournal/doc/9.pdf | |
| (О запросе Комиссии касательно безопасности пищевой продукции и компонентов пищевой продукции, полученных из устойчивой к гербицидам генетически модифицированной кукурузы NK603, в связи с поступлением заявки на ее размещение на рынке в соответствии со ст.4 Регламента (ЕС) No 258/97 "О новых видах пищевой продукции" от компании Monsanto (2003) [Заключение]) | |
[57] | PAN L., ZHANG S., YANG L., BROLL H., TIAN F., ZHANG D. Interlaboratory trial validation of an event-specific qualitative polymerase chain reaction-based detection method for genetically modified RT73 rapeseed. J. AOAC Int. 2007, 90 pp.1639-1646 | |
| (Межлабораторные испытания для валидации специфичного к трансформационным событиям метода качественного определения генетически модифицированного рапса RT73 с применением цепной реакции полимеразы) | |
[58] | BVL L 00.00-124, Untersuchung von Lebensmitteln - Nachweis einer bestimmten,  in gen-technisch  Organismen (GVO) verwendeten DNA-Sequenz aus dem bar-Gen von Streptomyces hygroscopicus in Lebensmitteln - Screening-Verfahren [Food analysis - Detection of a specific DNA sequence frequently used in genetically modified organisms (GMOs) and originating from the bar gene of Streptomyces hygroscopicus in foodstuffs - Screening method]. In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB [Official collection of analytical methods according to article 64 of the German Food and Feed Act (LFGB)]. Berlin: Beuth, 2008 | |
| (Анализ пищевых продуктов. Обнаружение специфической последовательности ДНК, часто применяемой в генетически модифицированных организмах (ГМО) и относящейся к гену bar Streptomyces hygroscopicus, в пищевых продуктах. Метод скрининга) | |
[59] | GROHMANN L.,  С., NEMETH A., WAIBLINGER H.-U. Collaborative trial validation studies of real-time PCR-based GMO screening methods for detection of the bar gene and the ctp2-cp4-epsps construct. J. Agric. Food Chem. 2009, 57 pp. 8913-8920 | |
| (Совместные сличительные испытания с целью валидации методов скрининга ГМО на основе ПЦР реального времени для обнаружения гена bar и конструкции ctp2-cp4-epsps) | |
[60] | EFSA PANEL ON GENETICALLY MODIFIED ORGANISMS. On an application (reference EFSA-GMO-UK-2004-04) for the placing on the market of glufosinate tolerant genetically modified rice LLRICE62 for food and feed uses, import and processing, under Regulation (EC) No1829/2003 from Bayer CropScience GmbH [Opinion]. Eur. Food Saf. Author. J. 2007, 588 pp. 1-25 Available (viewed 2013-03-25) at: http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/588.pdf | |
| (О заявке (см. EFSA-GMO-UK-2004-04) на размещение на рынке, импорт и переработку устойчивого к глуфосинату генетически модифицированного риса LLRICE62, предназначенного для производства пищевых продуктов и кормов, в соответствии с Регламентом (ЕС) No1829/2003, поступившей от компании Bayer CropScience GmbH [Заключение]) | |
[61] | SCIENTIFIC COMMITTEE ON PLANTS. Glufosinate tolerant, hybrid rape derived from genetically modified parental lines (MS8 RF3) notified by plant genetic systems (notification C/B/96/01) [Opinion]. Eur. Food Saf. Author. J. 2005, 281 pp.1-23 Available (viewed 2013-03-25) at: http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scp/out09_en.html | |
| (Устойчивый к глуфосинату гибридный рапс из генетически модифицированных родительских линий согласно уведомлению, поступившему от компании Plant Genetic Systems (Уведомление С/В/96/01) [Заключение]) | |
[62] | WAIBLINGER H.-U., ERNST В., ANDERSON A., PIETSCH K. Validation and collaborative study of a P35S and T-nos duplex real-time PCR screening method to detect genetically modified organisms in food products. Eur. Food Res. Technol. 2008, 226 pp. 1221-1228 | |
| (Валидация и совместное исследование метода скрининга P35S и T-nos на основе дуплексной ПЦР реального времени для обнаружения генетически модифицированных организмов в пищевых продуктах) | |
[63] | Bennett M.D., Leitch I.J., editors. Plant DNA C-values database. Kew: Royal Botanic Gardens. Available (viewed 2013-03-25) at:http://www.rbgkew.org.uk/cval/ | |
| (База данных гаплоидных величин ДНК растений. Кью: Королевский ботанический сад) | |
[64] | Hemmer W. Foods derived from genetically modified organisms and detection methods. In: BATS-report Vol.2, p.97. Basel: Agency for Biosafety research and assessment of technology Impacts of the Swiss priority Biotechnology Programme of the Swiss National Science Foundation, 1997 | |
| (Продукты пищевые из генетически модифицированных организмов и методы их выявления) | |
[65] | Brunt A., editor. Viruses of plants: Descriptions and lists from the VIDE database. Wallingford: CAB International, 1996, 1484 p. | |
| (Вирусы растений. Описания и перечни из базы данных VIDE) | |
[66] | QIU S.G., WINTERMANTEL W.M., SHA Y, SCHOELZ J.E. Light-dependent systemic infection of solanaceous species by cauliflower mosaic virus can be conditioned by a viral gene encoding an aphid transmission factor. Virology. 1997, 227 pp.180-188 | |
| (Светозависимое системное инфицирование видов семейства пасленовых вирусом мозаики цветной капусты может быть обусловлено вирусным геном, кодирующим фактор переноса вируса тлями) | |
[67] | WOLF С., SCHERZINGER М., WURZ A., PAULI U.,  PH.,  J. Detection of cauliflower mosaic virus by the polymerase chain reaction: testing of food components for false positive 35S-promoter screening results. Eur. Food Res. Technol. 2000, 210 pp.367-372 | |
| (Обнаружение вируса мозаики цветной капусты путем проведения цепной реакции полимеразы: проверка пищевых компонентов на ложноположительные результаты скрининга промотора 35S) | |
[68] | Screening-Tabelle  den GVO-Nachweis 2013 [Screening Table for GMO detection 2013]. German Federal Office of Consumer Protection and Food Safety. Available (viewed 2013-03-25) from http://www.bvl.bund.de/SharedDocs/Downloads/09_Untersuchungen/screening_tabelle_gvo-Nachweis_2013.html | |
| (Таблица данных скрининга по выявлению ГМО за 2013 г.) | |
[69] | BVL L 00.00-116, Nachweis einer bestimmten,  in gentechnisch Organismen (GVO) verwendeten DNA-Sequenz aus Agrobacterium tumefaciens (T-nos) in Lebensmitteln; Screening-Verfahren [Detection of specific DNA sequences frequently used in genetically modified organisms (GMOs) and originating from Agrobacterium tumefaciens (T-nos) in foodstuffs - Screening method]. In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB [Official collection of analytical methods according to article 64 of the German Food and Feed Act (LFGB)]. Berlin: Beuth, 2007 | |
| (Анализ пищевых продуктов. Обнаружение специфической последовательности ДНК, часто применяемой в генетически модифицированных организмах (ГМО) и относящейся к Agrobacterium tumefaciens (T-nos), в пищевых продуктах. Метод скрининга) | |
[70] | GODA Y., ASANO Т., SHIBUYA М., HINO A., TOYODA М. Detection of recombinant DNA from genetically modified papaya [in Japanese]. Shokuhin Eiseigaku Zasshi. 2001, 42 pp.231-236 | |
| (Обнаружение рекомбинантной ДНК в генетически модфицированной папайе) | |
[71] | BUSCH U., PECORARO S., POSTHOFF K., ESTENDORFER-RINNER S. Erster Nachweis einer gentechnisch Papaya in Europa - Beanstandung eines in der EU nicht zugelas-senen gentechnisch Organismus [First time detection of a genetically modified papaya in Europe - Official complaint of a non authorized genetically modified organism within the EU]. Deut. Lebensm.-Rundschau. 2004, 100 pp.370-380 | |
| (Первый случай обнаружения генетически модифицированной папайи в Европе. Официальная жалоба на поставки неразрешенных генетически модифицированных организмов в ЕС) | |
[72] | BVL L 29.00-9, Qualitativer Nachweis modifizierter DNA-Sequenzen in Papaya - Ring-Spot-Virus-resistenter Papaya (Carica papaya) - Konstruktspezifisches Verfahren [Qualitative detection of modified DNA sequences in papaya - Ringspot virus resistant papaya (Carica papaya) - Construct-specific method.]. In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB [Official collection of analytical methods according to article 64 of the German Food and Feed Act (LFGB)]. Berlin: Beuth, 2006 | |
| (Качественное обнаружение модифицированных последовательностей ДНК в папайе. Устойчивая к вирусу кольцевой пятнистости папайя (Carica papaya). Метод, специфичный к генетической конструкции) | |
[73] | XU W., BAI W., GUO F., LUO Y., YUAN Y., HUANG К. A papaya-specific gene, papain, used as an endogenous reference gene in qualitative and real-time quantitative PCR detection of transgenic papayas. Eur. Food Res. Technol. 2008, 228 pp. 301-309 | |
| (Специфичный для папайи ген папаин, используемый в качестве эндогенного референсно-го гена при качественном обнаружении материалов трансгенной папайи средствами ПЦР и их количественном определении в реальном времени) | |
[74] | WU, G., WU, Y., NIE, S., ZHANG, L, XIAO, L, CAO, Y., LU, С Oryza sativa Indica Group transgenic insect-resistant line TT51-1 integrated transgenes and flanking genomic sequence. Genbank accession number EU880444.1, 2008 | |
| (Интегрированные трансгены и фланкирующая геномная последовательность усточивой к поражению насекомыми линии ТТ51-1 риса Oryza sativa, тип "Индика") | |
[75] | MflDE D., DEGNER CH., GROHMANN L. Detection of genetically modified rice: a construct-specific real-time PCR method based on DNA sequences from transgenic Bt rice. Eur. Food Res. Technol. 2006, 224 pp.271-278 | |
| (Обнаружение генетически модифицированного риса. Специфичный к генетической конструкции метод ПЦР в реальном времени на основе последовательностей ДНК трансгенного Bt-риса) | |
[76] | Tu J., Datta K., Alam M.F., Fan Y., Knush G.S., Datta S.K. Expression and Function of a Hybrid Bt Toxin Gene in Transgenic Rice Conferring Resistance to Insect Pest. Plant Biotechnol. 1998, 15 pp.195-203 | |
| (Экспрессия и функция гибридного гена Bt-токсина в трансгенном рисе, обеспечивающего устойчивость к насекомым-вредителям) | |
[77] | GROHMANN, L.,  , D. (2008): Detection of genetically modified rice: collaborative validation study of a construct-specific real-time PCR method for detection of transgenic Bt rice. Eur. Food Res. Technol. 2009, 228 pp.497-500 | |
| (Обнаружение генетически модифицированного риса. Совместное исследование с целью валидации специфичного к генетической конструкции метода ПЦР в реальном времени для выявления трансгенного Bt-риса) | |
[78] | BVL L 15.06-1, Untersuchung von Lebensmitteln - Nachweis einer gentechnisch DNA-Sequenz in Reisprodukten crylA(c)- T-nos - Konstruktspezifisches Verfahren [Food analysis - Detection of a genetically modified DNA sequence in rice products - Construct-specific method]. In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB [Official collection of analytical methods according to article 64 of the German Food and Feed Act (LFGB)]. Beuth, Berlin, 2008 | |
| (Исследование пищевых продуктов. Обнаружение генетически модифицированной последовательности ДНК crylA(c)-T-nos в продуктах из риса. Метод, специфичный к генетической конструкции) | |
[79] | SAVINI C., QUERCI M., ERMOLLI M., MAZZARA M., CORDEIL S., VAN DEN EEDE G. (2008): Report on the verification of the performance of a method for the detection of "Bt 63" rice using real-time PCR. European Commission. Joint Research Centre. Institute for Health and Consumer Protection. Biotechnology & GMOs Unit. Available (viewed 2013-03-25) at: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/Bt63_Rice_verifi cation_report_final.pdf | |
| (Отчет о проверке эффективности метода обнаружения риса Bt 63 средствами ПЦР в реальном времени) | |
[80] | BVL L 00.00-125, Untersuchung von Lebensmitteln - Nachweis der ctp2-cp4-epsps-Gensequenz zum Screening auf Bestandteile aus gentechnisch Organismen (GVO) in Lebensmitteln - Konstrukt-spezifisches Verfahren [Analysis of foodstuffs - Detection of the ctp2-cp4-epsps gene sequence for screening for components of genetically modified organisms (GMOs) in foodstuffs - Construct-specific method]. In: Amtliche Sammlung von Unter-suchungsverfahren nach § 64 LFGB [Official collection of analytical methods according to article 64 of the German Food and Feed Act (LFGB)]. Berlin: Beuth, 2008 | |
| (Анализ пищевых продуктов. Обнаружение генетической последовательности ctp2-cp4-epsps для целей скрининга компонентов генетически модифицированных организмов (ГМО) в пищевых продуктах. Метод, специфичный к генетической конструкции) | |
[81] | WAIBLINGER H.U.,  М., PIETSCH К., RITTER W.,  J., KRECH A. et al. Die Untersuchung von transgenem Rapspollen in Honigen mittels Real-time PCR [The analysis of genetically modified rape pollen in honey by real-time PCR]. Deut. Lebensm.-Rundschau. 2005, 101 pp.543-549 | |
| (Анализ пыльцы генетически модифицированного рапса в составе меда средствами ПЦР реального времени) | |
[82] | Available (viewed 2013-03-25) at: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi | |
| (В открытом доступе (проверено 2013-03-25)) | |
[83] | Available (viewed 2013-03-25) at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| (В открытом доступе (проверено 2013-03-25)) | |
[84] | EURACHEM WORKING GROUP. The fitness for purpose of analytical methods: A laboratory guide to method validation and related topics. 61 p. Teddington: LGC. Available (viewed 2013-03-25) at: http://www.eurachem.org/images/stories/Guides/pdf/valid.pdf | |
| (Пригодность аналитических методов для целевого использования. Лабораторное руководство по валидации методов и сопутствующим вопросам). | |
Библиография (Измененная редакция, Изм. N 1).
Приложение Д.А
(справочное)
Сведения о соответствии межгосударственного стандарта ссылочному международному стандарту
Таблица Д.А.1
Обозначение и наименование международного стандарта | Степень соответствия | Обозначение и наименование межгосударственного стандарта |
ISO 21571:2005 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и их производных. Извлечение нуклеиновой кислоты | IDT | ГОСТ ИСО 21571-2009 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Экстрагирование нуклеиновых кислот
|
УДК [664:604.6]:543.61.061(083.74)(476) | МКС 67.050 | IDT |
| ||
Ключевые слова: продукты пищевые, генетически модифицированные организмы (ГМО), реакция ПЦР, праймер, целевая последовательность, гибридизация, амплификации | ||