ГОСТ ИСО 21569-2009 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Методы качественного обнаружения на основе анализа нуклеиновых кислот (с Изменением N 1).
ГОСТ ИСО 21569-2009
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Методы качественного обнаружения на основе анализа нуклеиновых кислот
Foodstuffs
Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Qualitative nucleic acid based methods
МКС 67.050
Дата введения*
Предисловие
Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации (ЕАСС) представляет собой региональное объединение национальных органов по стандартизации государств, входящих в Содружество Независимых Государств. В дальнейшем возможно вступление в ЕАСС национальных органов по стандартизации других государств.
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Порядок разработки, принятия, применения, обновления и отмены".
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт метрологии" (БелГИМ) на основе собственного аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Евразийским советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 36-2009 от 11 ноября 2009 г.)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения | AM | Минэкономики Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Казахстан | KZ | Госстандарт Республики Казахстан |
Кыргызстан | KG | Кыргызстандарт |
Молдова | MD | Молдова-Стандарт |
Таджикистан | TJ | Таджикстандарт |
Узбекистан | UZ | Узстандарт |
4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 21569:2005* Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Qualitative nucleic acid based methods (Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Методы качественного обнаружения на основе анализа нуклеиновых кислот).
Международный стандарт разработан CEN/TC 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы" Европейского комитета по стандартизации (CEN) совместно с ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO) в соответствии с Соглашением о техническом сотрудничестве между ISO и CEN (Венским соглашением).
Перевод с английского языка (en).
В разделе "Нормативные ссылки" и тексте стандарта ссылки на международные стандарты актуализированы.
Сведения о соответствии межгосударственного стандарта ссылочному международному стандарту приведены в дополнительном приложении Д.А.
Степень соответствия - идентичная (IDT)
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных (государственных) стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация также будет опубликована в сети Интернет на сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"
Зарегистрирован N 6007 7 сентября 2010 г.
ВНЕСЕНО Изменение N 1, принятое Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 116-П от 28.02.2019)*
Введение
Обнаружение генетически модифицированных источников в ингредиентах пищевых продуктов выполняется посредством описанных далее действий, выполняемых последовательно или одновременно. После отбора пробы из анализируемой порции проводят выделение нуклеиновых кислот. Выделенные нуклеиновые кислоты могут быть дополнительно очищены, одновременно с процессом выделения или после него. Дальнейшими действиями являются определение их концентрации (при необходимости), разведение (при необходимости) и использование в аналитических процедурах (например, в анализе ПЦР). Проведение этих действий подробно описано в настоящем стандарте, а также в группе международных стандартов, объединенных общим заголовком: "Пищевые продукты. Методы анализа для определения генетически модифицированных организмов и содержащих их продуктов":
- "Методы количественного определения на основе анализа нуклеиновых кислот" (ISO 21570);
- "Выделение нуклеиновых кислот" (ISO 21571).
Дополнительная информация об общих требованиях и определениях, включая описанные выше шаги, приводится в международном стандарте ISO 24276.
Качественное определение целевых последовательностей ДНК выполняется с целью получения ответа "да" или "нет" на вопрос о содержании или отсутствии целевой последовательности ДНК с учетом соответствующих контрольных проб в пределах обнаружения используемого метода анализа и для анализируемой части образца.
Специфичность методов, в соответствии с описаниями в приложениях А-D, варьируется от скрининга (определение типичных последовательностей ДНК, характерных для ГМО) до специфической идентификации генетической конструкции или специфического события генетической трансформации.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
1 Область применения
Настоящий стандарт содержит описание процедур качественного определения генетически модифицированных организмов (ГМО) и содержащих их продуктов путем анализа нуклеиновых кислот, выделяемых из исследуемого образца. Основное внимание уделено методам анализа на основе амплификации нуклеиновых кислот с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В настоящем стандарте приводятся общие требования к специфическому определению и идентификации целевых последовательностей нуклеиновой кислоты (ДНК) и к подтверждению идентичности амплифицированной последовательности ДНК.
Руководства, минимальные требования и критерии выполнения, установленные в настоящем стандарте, предназначены для обеспечения получения сопоставимых, точных и воспроизводимых результатов в различных лабораториях.
Настоящий стандарт был разработан для матриц пищевых продуктов, однако может быть также применен для анализа других матриц (например, корма для животных, образцы растений из окружающей среды).
Примеры конкретных методов приводятся в приложениях A-D.
2 Нормативные ссылки
Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные документы*. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного документа, для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного документа.
ISO 21571:2005 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и их производных. Извлечение нуклеиновой кислоты
ISO 24276:2006 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения, установленные в ISO 24276.
4 Принцип метода
4.1 Общие положения
Качественный анализ представляет собой специфическое определение целевых последовательностей нуклеиновой кислоты в анализируемых образцах. Каждый метод должен быть специфичен для целевой последовательности.
Качественный анализ должен четко показывать наличие или отсутствие исследуемого генетического элемента с учетом соответствующих контролей.
Примечание - Пределы обнаружения используемого метода анализа и размер анализируемой части образца представляют собой критические аспекты метода.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.2 ПЦР-амплификация
Амплификация целевой последовательности ДНК производится in vitro посредством реакции, катализируемой ДНК-полимеразой, в присутствии олигонуклеотидов-праймеров и дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в заданном реакционном буфере [1], [2]. Необходимым условием для проведения амплификации целевой последовательности является отсутствие ингибиторов полимеразы в реакционной смеси. Амплификация ДНК - это циклический процесс, состоящий из следующих этапов:
- денатурация двухнитевой ДНК в однонитевую нуклеиновую кислоту посредством нагрева;
- отжиг (специфическая гибридизация) праймеров к целевой последовательности при соответствующей температуре и
- элонгация праймеров, связанных с обеими одинарными спиралями, ДНК-полимеразой, применимой в ПЦР, при соответствующей температуре.
4.3 Обнаружение и подтверждение продуктов ПЦР
Обнаружение продуктов ПЦР производится с помощью электрофореза в агарозном геле или при необходимости альтернативными доступными методами после изоляции посредством соответствующей процедуры разделения.
Идентификация любой обнаруженной целевой последовательности может быть подтверждена соответствующей методикой (например, с помощью рестрикционного анализа ферментами рестрикции, гибридизации или анализа последовательности ДНК).
В случае использования анализа ПЦР в реальном времени амплификация и детектирование происходят одновременно.
5 Реактивы
Если это не оговаривается особо, растворы реактивов, используемых для анализа, обычно хранят приблизительно при минус 20°С.
Целесообразно разделить используемые для аналитического метода растворы реактивов на малые порции, это позволит избежать многократного повторения циклов размораживания/замораживания, а также снизить риск перекрестной контаминации.
5.1 Целевая ДНК/Контроль
5.2 Вода
5.3 Раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP), содержащий dATP, dCTP, dGTP и dTTP или dUTP.
Примечание - Использование dUTP может отрицательно повлиять на дальнейшее проведение анализа продуктов амплификации ПЦР с помощью рестрикционного анализа.
5.4 Буферный раствор для ПЦР
5.5 Термостабильная ДНК-полимераза
5.6 Прямой праймер
5.7 Обратный праймер
6 Инструменты и оборудование
Подробная информация по инструментам и оборудованию приводится в ISO 24276 и приложениях А-D.
7 Процедура анализа
7.1 Качество, целостность и амплифицируемость выделенной нуклеиновой кислоты
Раствор нуклеиновой кислоты должен быть достаточно чистым для последующего анализа [3]. Качество и количество выделенной с помощью заданного метода из определенного материала образца нуклеиновой кислоты должны быть повторяемы и воспроизводимы.
Примечание - Качество, целостность и количество образца ДНК влияет на выход ПЦР и, следовательно, на получаемые результаты анализа. Предел обнаружения конкретного метода может, таким образом, зависеть от того, был ли анализируемый материал обработан или очищен, а также от степени деградации (разрушения) ДНК в нем.
Нуклеиновые кислоты, используемые в ПЦР, не должны содержать ингибиторы ПЦР [4]. Необходимо использовать контроли ингибирования ПЦР, описанные в ISO 24276.
7.2 Критерии выполнения анализа
Общие критерии выполнения анализа описаны в ISO 24276.
Значения характеристик выполнения анализа приводятся для каждого метода и указаны в приложениях А-D; при этом следует учитывать размер генома, см. [5].
В оптимальной реакции требуется менее 40 циклов для амплификации 10 и более целевых молекул и получения продукта, который может быть легко обнаружен стандартными методами. По мере увеличения числа циклов возможно накопление неспецифических продуктов реакции. Оптимизированная ПЦР должна позволять получить за 40 циклов из чистого образца стандартного состава, в котором содержатся 100 копий матрицы ДНК, достаточное для обнаружения количество копий продукта ПЦР. Следует строго придерживаться заданных количества циклов, профиля кривой "температура - время" для каждой системы праймеров и реакционной смеси, учитывая используемое оборудование.
В целом следует максимально возможно увеличивать специфичность реакции (например, используя ПЦР с "горячим стартом"). ПЦР с "горячим стартом" рекомендуется как средство снижения побочных реакций (например, амплификация нецелевых последовательностей фоновой ДНК (ошибочная посадка праймеров) или олигомеризация праймеров) и, таким образом, увеличения специфичности метода.
Значения, полученные в ходе метрологической аттестации, могут быть не применимы к диапазонам концентраций анализируемого вещества и материалам образцов, отличающихся от перечисленных в соответствующих приложениях.
7.3 Аспекты подбора параметров ПЦР
7.3.1 Общие положения
Так как выполнение каждой индивидуальной ПЦР должно быть сопоставимо с другими специфическими ПЦР, следует учитывать приведенные далее аспекты подбора параметров ПЦР.
7.3.2 Размер ПЦР-продуктов
Размер целевой последовательности следует выбирать таким образом, чтобы он попадал в диапазон молекулярных масс, имеющихся в выделенной из анализируемого образца ДНК.
Пример - Для сильно деградировавшей ДНК из продуктов, прошедших термическую обработку, оптимальный размер ПЦР-продукта должен быть в диапазоне от 60 до 150 пар нуклеотидов (п.н.). Для сырья можно использовать более широкий диапазон, например вполне допустимо значение 250 п.н.
Однако, если в результате предварительно проведенных экспериментальных исследований по оценке соответствия наборов праймеров получены ПЦР-продукты различного размера, эти праймеры могут быть использованы для анализа образцов, материал которых был аттестован в таких исследованиях.
7.3.3 Праймеры
7.3.3.1 Общие положения
Информация о последовательности праймеров приводится в приложениях A-D.
7.3.3.2 Подбор праймеров
Последовательности праймеров должны по возможности иметь следующие характеристики:
- длина каждого праймера - от 18 до 30 нуклеотидов;
- по возможности соотношение GC:AT=50:50 или как можно ближе к этому соотношению;
- высокая внутренняя стабильность (не допускается концентрация нуклеотидов G и С в коротких сегментах праймеров);
- минимальная 3’-концевая комплементарность для предотвращения образования димеров праймеров;
- минимальная вторичная структура;
- минимальное образование димеров со специфическими зондами для детектирования, разработанными для ПЦР.
Для облегчения подбора праймеров разработаны специализированные программы.
7.3.3.3 Метрологическая аттестация праймеров
7.3.3.3.1 Общие положения
Следует подтвердить способность праймеров обнаруживать целевую последовательность.
Аттестацию праймеров следует проводить в два этапа: первый этап заключается в теоретической оценке, а второй - в экспериментальных испытаниях.
7.3.3.3.2 Теоретическая оценка специфичности
7.3.3.3.3 Экспериментальная оценка специфичности
Вне зависимости от использованных критериев подбора праймеров их специфичность обязательно должна быть установлена экспериментальным путем. Такая оценка должна подтвердить способность праймеров различать целевую и нецелевую, но схожую последовательности.
Следует подтвердить, что праймеры, подобранные для обнаружения целевых последовательностей, специфичных к таксону, способны достоверно обнаруживать эти последовательности в соответствующем количестве различных членов таксона.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
7.4 Описание целей ПЦР
Для качественного обнаружения и идентификации ГМО можно провести различные ПЦР-исследования, зависящие от типа материалов исследуемых образцов и/или от требований к анализу. Эти исследования могут быть направлены на последовательности, специфичные для целевых таксонов, генетических конструкций и трансформационных событий, а также для элементов, пригодных для задач скрининга.
7.5 Контроли
Из-за существования риска получения ложноположительных и/или ложноотрицательных результатов в каждое исследование ПЦР следует включить соответствующие контроли (см. ISO 24276).
При условии наличия на рынке соответствующих сертифицированных образцов стандартного состава (референсные образцы стандартного состава) их следует использовать в качестве положительных и отрицательных контрольных проб.
7.6 Проведение ПЦР, обнаружение и подтверждение продуктов ПЦР
В приложениях А-D приводится подробное описание конкретных этапов последовательности ПЦР-анализа.
Примечание - Если для обнаружения продуктов ПЦР используется электрофорез в агарозном геле, размер продуктов ПЦР может быть оценен с помощью соответствующих маркеров длины ДНК, которые следует запустить параллельно с исследуемыми ПЦР-продуктами.
В некоторых случаях желательно подтвердить положительный или отрицательный результат для определенной генетической модификации. Такое подтверждение может быть проведено с помощью применения праймеров к альтернативной целевой последовательности; этот способ бывает особенно полезен при подтверждении результатов скрининга.
Положительная идентификация специфической последовательности целевой ДНК может быть подтверждена соответствующим методом (но не определением размера ПЦР-продукта), например:
- путем гибридизации ПЦР-продукта со специфичными зондами, или
- путем проведения рестрикционного анализа ПЦР-продуктов; длина полученных фрагментов должна соответствовать ожидаемой длине целевой последовательности ДНК после рестрикции, или
- путем секвенирования (определения последовательности) ПЦР-продукта, или
- другим эквивалентным методом подтверждения.
Если используемые праймеры подобраны для обнаружения последовательностей, полученных из инфекционных организмов (встречающиеся в природе генетически немодифицированные организмы, например вирусы или бактерии), рекомендуется убедиться в том, что обнаруженная ДНК действительно происходит из ГМО. Такое подтверждение может быть выполнено путем проверки отсутствия другой ДНК, произошедшей из инфекционного организма.
Пример - 35S-промотор, полученный из вируса мозаики цветной капусты (CaMV); соответственно, обнаружение этого промотора может быть обусловлено наличием ДНК, произошедшей из ГМО или из CaMV [6]. Проверив наличие другой ДНК из вируса мозаики цветной капусты, можно удостовериться в происхождении 35S-промотора и последовательности ГМО (если не обнаружена другая последовательность ДНК из CaMV).
8 Интерпретация результатов
8.1 Общие положения
Результат ПЦР может быть:
a) положительным, если обнаружен специфический ПЦР-продукт, а все контрольные пробы дают результаты в соответствии с ISO 24276:2006, таблица 2, или
b) отрицательным, если не обнаружен специфический ПЦР-продукт, а все контрольные пробы дают результаты в соответствии с ISO 24276:2006, таблица 2.
Примечание - Специфичные для трансформационных событий целевые последовательности иногда обнаруживаются вместе с другими специфичными последовательностями трансформационных событий в одном ГМО (например, из-за наложения генов [7]).
Если получен неопределенный (позволяющий проводить двоякую интерпретацию) результат, анализ следует повторить, см. ISO 24276.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
8.2 Подтверждение
Подтверждение положительных или отрицательных результатов может быть выполнено в соответствии с 7.6.
9 Представление результатов и контроль качества
9.1 Общие положения
Результаты должны быть представлены определенно, т.е. не в виде "±".
Отрицательный результат никогда не следует предоставлять в виде "ГМО отсутствует".
В идеале в протоколе должен быть указан предел обнаружения, определенный по соответствующему исследуемому образцу. Однако это требует определенных материалов, ДНК исключительно высокого качества и/или использования сложного лабораторного оборудования, которое имеется не у всех лабораторий. Такой анализ может стать очень трудоемким и/или дорогостоящим, а следовательно, не может быть применен в обычных лабораторных условиях.
В протоколе следует указать по крайней мере предел обнаружения, определенный для образца стандартного состава, и относительное значение для конкретного материала образца (предпочтительно заданное количество раствора геномной ДНК, например 100 нг 0,01% ДНК GTS 40-3-2).
9.2 Представление отрицательного результата
В протоколе испытаний должен присутствовать следующий текст:
"Целевая последовательность Y не обнаружена в образце X.
Предел обнаружения метода x % определен по ABC (укажите референсный образец стандартного состава)".
Если невозможно доказать, что количество целевой ДНК, использованное в ПЦР, было достаточным для применения предела обнаружения, в протокол следует добавить следующее предложение:
"Однако количество целевой ДНК, выделенной из образца X, может быть/было недостаточным для применения предела обнаружения в этом образце".
Примечание - Предел обнаружения в образце определяется по количеству ДНК вида, использованному в аналитической реакции (число копий), и соотношению к абсолютному пределу обнаружения целевой генетической модификации (число копий) [7].
9.3 Представление положительного результата
В протоколе испытаний должен присутствовать следующий текст:
"В образце X обнаружена целевая последовательность Y".
Можно также указать ГМО, если доступна такая информация.
9.4 Требования к контролю качества
Результаты, полученные для одной и той же анализируемой части образца, должны быть непротиворечивыми. В случае +/- результатов для двух повторений необходимо повторить две ПЦР для соответствующей анализируемой части образца. Если результаты двух новых повторных испытаний дают +/- или -/-, анализируемой части образца приписывается отрицательный результат.
Результаты испытаний всех анализируемых частей образца должны соответствовать друг другу. Если как минимум одна анализируемая часть образца дает положительный результат и еще как минимум одна анализируемая часть дает отрицательный результат, анализ следует повторить.
В случае если как минимум одно повторение процедуры, начиная с экстрагирования нуклеиновых кислот, дает неоднозначные результаты, например один - положительный и один - отрицательный, результат для образца в протоколе должен быть обозначен как отрицательный на пределе обнаружения (LOD).
(Измененная редакция, Изм. N 1).
10 Протокол испытаний
Протокол испытаний должен быть оформлен в соответствии с требованиями ISO 24276 и должен содержать по крайней мере следующую дополнительную информацию:
- предел обнаружения и материал образца, использованный для определения предела обнаружения;
- специфичность аналитического метода (специфичность к трансформационным событиям, специфичность к генетической конструкции либо метод скрининга);
- результат, представленный в соответствии с требованиями раздела 9.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
Приложение А
(справочное)
Методы, специфичные к целевым таксонам
А.1 Метод, специфичный к целевому таксону, для определения компонентов, полученных из соевых бобов
А.1.1 Общие положения
Описана стандартная процедура определения видоспецифичного однокопийного гена, встречающегося в соевых бобах (Glycine max).
Этот метод используется для оценки амплифицируемости ДНК-продуктов, в состав которых входят соевые бобы.
А.1.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
А.1.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод был метрологически аттестован в совместных сличительных испытаниях [8], [9], организованных рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV) в соответствии со статьей 35 Федерального закона Германии о пищевых продуктах. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3 (однако вес анализируемой части образца составлял 100 мг).
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице А.1.
Таблица А.1 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1997 [8] | 1998/1999 [9] |
Количество лабораторий | 25 | 27 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 22 | 20 |
Количество образцов на лабораторию | 10 | 3 |
Количество принятых результатов | 220 | 60 |
Количество образцов, содержащих соевые бобы | 220 | 50 |
Ложноположительные результаты | 0 | 1 (2%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 | 1 (2%) |
А.1.2.2 Молекулярная специфичность
А.1.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
_______________
А.1.2.2.2 Теоретическая часть
В качестве целевой последовательности из баз данных генов был выбран ген соевого лектина Le1 [10].
_______________
Количество копий целевой последовательности не определяли, однако предполагалось, что это однокопийный ген.
А.1.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из других сельскохозяйственных растений (бобовых, зерновых и овощных культур), а также из говядины и свинины, не наблюдали амплификацию. Метод ПЦР для соевых бобов показал свою высокую специфичность к ДНК соевых бобов [10], [11].
А.1.2.3 Предел обнаружения
Не был определен абсолютный предел обнаружения, однако с помощью флуорометрического анализа было показано, что метод способен обнаруживать по меньшей мере 0,1 нг ДНК соевых бобов.
А.1.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
А.1.4 Принцип
Принцип метода заключается в амплификации фрагмента ДНК из соевых бобов длиной 118 п.н. с использованием ПЦР и разделении с помощью электрофореза в агарозном геле.
А.1.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
А.1.5.1 Вода
_______________
А.1.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
А.1.5.5 Олигонуклеотиды
А.1.5.5.1 Прямой праймер
Ген лектина соевых бобов (позиция базы данных GenBank® N K00821).
Праймер GM03: 5’-gCC СТС ТАС ТСС АСС ССС АТС С-3’.
А.1.5.5.2 Обратный праймер
Ген лектина соевых бобов (позиция базы данных GenBank® N К00821).
Праймер GM04: 5’-gCC CAT CTg САА gCC ТТТ TTg Tg-3’.
А.1.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
А.1.5.7 Зонд для гибридизации (GM)
5’-ggT AgC gTT gCC AgC ТТС g-3’.
Пятикратный буферный раствор SSC - это раствор, содержащий 0,75 моль/л NaCI и 0,075 моль/л цитрата натрия.
А.1.5.9 Прегибридизационный раствор
_______________
А.1.5.10 Раствор для гибридизации
Содержит 10 пмоль зонда для гибридизации в 2,5 мл прегибридизационного раствора (А.1.5.9). Температура гибридизации - 50°С. Дополнительная информация по условиям гибридизации приводится в ссылке [12].
А.1.6 Оборудование
А.1.6.1 Амплификатор
А.1.6.2 Камера для электрофореза, с источником питания.
А.1.7 Процедура анализа
А.1.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице А.2. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице А.2.
Таблица А.2 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 1 |
Вода |
| 15,9 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор  , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,8 ммоль/л | 2 |
Праймер GM03, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
Праймер GM04, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 0,5 IU | 0,1 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 1,5 ммоль/л. | ||
А.1.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава GTS 40-3-2, производимые Институтом референсных материалов и измерений (IRMM), Гиль, Бельгия (IRMM-410).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
А.1.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица А.3 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 30 с/95°С |
| 30 с/60°С |
| 60 с/72°С |
Количество циклов | 35 |
Завершающая полимеризация | 3 мин/72°С |
А.1.8 Специфичность продукта ПЦР
Так как представленный метод может рассматриваться исключительно как контрольный метод для определения качества выделенной ДНК, проверка специфичности основывается только на размере продукта ПЦР.
Если метод используется в целях, отличающихся от упомянутых выше, проверка специфичности продукта амплификации может быть выполнена с помощью гибридизации по Саузерну с использованием олигонуклеотидного зонда GM, меченного дигоксигенином (А.1.5.7-А.1.5.10), или путем секвенирования (определения последовательности) продукта ПЦР и сравнения результатов с данными базы данных GenBank®, перечисленными в А.1.5.5.
А.1.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных образцов стандартного состава, приготовленных из сои линии GTS 40-3-2 (например, серия стандартов IRMM-410 производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в А.1.8.
Обнаружение фрагментов с размером 118 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК, происходящую из соевых бобов, в пределах установленных параметров специфичности, описанных в А.1.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
А.2 Метод, специфичный к целевому таксону, для определения многокопийных последовательностей ДНК, обычно присутствующих в хлоропластах растений
А.2.1 Общие положения
Описана стандартная процедура определения многокопийных последовательностей ДНК, обычно присутствующих в хлоропластах растений (интронгенахлоропластов trnL).
Этот метод пригоден для проверки успешности выделения ДНК из образца пищевого продукта, а также для оценки наличия амплифицируемой растительной ДНК. При анализе образцов продуктов, прошедших обработку, применение этого метода зависит от степени деградации ДНК.
Растительная клетка обычно содержит много копий этой последовательности ДНК, а размер целевой последовательности значительно превышает размеры последовательностей ДНК, используемых для обнаружения определенных генетических модификаций. Поэтому этот метод не может использоваться в качестве контроля при количественном определении.
Количество копий в клетке может быть различным у разных видов и тканей растений.
А.2.2 Порядок метрологической аттестации и критерии выполнения
А.2.2.1 Совместное сличительное испытание
Этот метод был метрологически аттестован в совместном сличительном испытании [13], организованном рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV) в соответствии со статьей 35 Федерального закона Германии о пищевых продуктах. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3 (однако вес анализируемой части образца составлял 100 мг).
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице А.4.
Таблица А.4 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1995 |
Количество лабораторий | 18 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 18 |
Количество образцов на лабораторию | 10 |
Общее количество образцов | 180 |
Количество принятых результатов | 180 |
Количество образцов, содержащих картофель B33-INV | 71 |
Количество образцов, содержащих генетически немодифицированный картофель | 109 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
А.2.2.2 Молекулярная специфичность
А.2.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевых последовательностей, описанных в [14], например доступы базы данных GenBank® N Z00044, S54304, Х15901.
А.2.2.2.2 Теоретическая часть
При поиске в базах данных (поиск NCBI BlastN®, база данных EMBL, по состоянию на 28 сентября 2001 г.) не была обнаружена значимая схожесть с последовательностями ДНК нерастительного происхождения.
Были разработаны праймеры, предназначенные для амплификации уникальной последовательности ДНК хлоропластов (интрон, входящий в состав последовательности гена trnL); показано отсутствие схожести с нецелевыми последовательностями.
А.2.2.2.3 Экспериментальная часть
При использовании в ПЦР ДНК, выделенной из животных, грибов или бактерий, амплификация не была обнаружена [14].
Была показана амплификация ДНК, выделенной из водорослей, цианобактерий, мхов, птеридофитов, покрытосеменных и голосеменных растений [14].
Целевая последовательность была многокопийна и количество копий зависело от вида и типа тканей растений.
А.2.2.3 Предел обнаружения
Не был определен абсолютный предел обнаружения, однако с помощью флуорометрического анализа было показано, что метод способен обнаруживать по меньшей мере 0,1 нг ДНК соевых бобов.
А.2.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
А.2.4 Принцип
Принцип метода заключается в амплификации находящегося в гене тРНК хлоропластов фрагмента [14] длиной от 500 до 600 п.н. с использованием ПЦР и разделении с помощью электрофореза в агарозном геле.
А.2.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
А.2.5.1 Вода
А.2.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
А.2.5.5 Олигонуклеотиды
А.2.5.5.1 Прямой праймер
Ген тРНК хлоропластов (позиция базы данных GenBank® N Z00044, Х15901).
Праймер с [14]: 5’-CgA ААТ Cgg TAg ACg СТА Cg-3’.
А.2.5.5.2 Обратный праймер
Ген тРНК хлоропластов (позиция базы данных GenBank® N Z00044, Х15901).
Праймер d [14]: 5’-ggg gAT AgA ggg ACT TgA AC-3’.
A.2.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза, 5 IU/мкл.
A.2.6 Оборудование
В соответствии с А.1.6.
А.2.7 Процедура анализа
А.2.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице А.5. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице А.5.
Таблица А.5 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 1 |
Вода |
| 13,9 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,8 ммоль/л | 2 |
Праймер с, 10 мкмоль/л | 0,8 мкмоль/л | 2 |
Праймер d, 10 мкмоль/л | 0,8 мкмоль/л | 2 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 0,5 IU | 0,1 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 1,5 ммоль/л. | ||
А.2.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава GTS 40-3-2, производимые Институтом референсных материалов и измерений (IRMM), Гиль, Бельгия (IRMM-410).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно ISO 24276.
А.2.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица А.6 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 4 мин/94°С |
Амплификация | 30 с/95°С |
| 30 с/55°С |
| 120 с/72°С |
Количество циклов | 35 |
Завершающая полимеризация | 5 мин/72°С |
А.2.8 Специфичность продукта ПЦР
Так как представленный метод может рассматриваться исключительно как контрольный метод для определения качества выделенной ДНК, точный размер фрагмента не играет большой роли. Таким образом, проверка специфичности основывается только на размере продукта ПЦР в пределах ожидаемого диапазона: от 500 до 600 п.н.
А.2.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных образцов стандартного состава, приготовленных из сои линии GTS 40-3-2 (например, серия стандартов IRMM-410 производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в А.2.8.
Обнаружение фрагментов с размером 500-600 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК растительного происхождения в пределах установленных параметров специфичности, описанных в А.2.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
А.3 Метод, специфичный к целевому таксону, и метод скрининга ГМО для обнаружения ДНК, полученной из томатов и/или генетически модифицированных томатов Zeneca®
А.3.1 Общие положения
Описана стандартная процедура определения видоспецифичной однокопийной последовательности ДНК, встречающейся в томатах (Lycopersicon esculentum Mill).
Метод может быть также использован в качестве метода скрининга для обнаружения генетически модифицированных томатов с замедленным созреванием (Zeneca; Lycopersicon esculentum Mill, сорт Alisa Craig, линия Nema 282F).
He описан способ проверки идентичности ПЦР-продукта. Поэтому этот метод не может рассматриваться как метод идентификации. Он может быть использован для оценки амплифицируемости ДНК, выделенной из томатов.
А.3.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
А.3.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод был метрологически аттестован в совместных сличительных испытаниях [15], организованных рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV) в соответствии со статьей 35 Федерального закона Германии о пищевых продуктах. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3.
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице А.7.
Таблица А.7 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1998 |
Количество лабораторий | 19 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 18 |
Количество образцов на лабораторию | 5 |
Количество принятых результатов | 90 |
Количество образцов, содержащих Lycopersicon esculentum Mill, сорт Alisa Craig, линия Nema 282F (Zeneca) | 43 |
Количество образцов, содержащих Lycopersicon esculentum Mill, сорт Alisa Craig, линия Nema 282C (немодифицированный сорт) | 47 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
Кроме того, в рамках европейского проекта SMT4-CT96-2072 Немецким федеральным институтом защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV) было проведено еще одно совместное сличительное испытание, соответствующее критериям, заданным в ISO 5275-2. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3 (однако вес анализируемой части образца составлял 100 мг).
Таблица А.8 - Результаты второго совместного сличительного испытания
Год проведения испытаний | 1998 |
Количество лабораторий | 21 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 19 |
Количество образцов на лабораторию | 10 |
Количество принятых результатов | 190 |
Количество образцов, содержащих Lycopersicon esculentum Mill, сорт Alisa Craig, линия Nema 282F (Zeneca) | 88 |
Количество образцов, содержащих Lycopersicon esculentum Mill, сорт Alisa Craig, линия Nema 282C (немодифицированный сорт) | 102 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
А.3.2.2 Молекулярная специфичность
А.3.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевых последовательностей, описанных, например, в базе данных GenBank®, доступ N Х04583.
А.3.2.2.2 Теоретическая часть
При поиске по базам данных (NCBI BlastN®, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), по состоянию на 28 сентября 2001 г.) не было обнаружено сходство с последовательностями ДНК других видов растений. Оба праймера на 100% совпадали со следующими пунктами базы данных: Х14074 (ген томатов, кодирующий полигалактуроназу, разрушающую клеточную стенку), Х05656 (мРНК полигалактуроназы томатов), М37304 [ген полигалактуроназы томатов (PG)], Х04583 (мРНК полигалактуроназы-2а томатов), А24194 (клон полигалактуроназы L. esculentum), А15981 (мРНК полигалактуроназы-2а L. esculentum), I01809 (последовательность нуклеотидов 1 из патента US4801540) и АХ062336 (последовательность 1 из патента WO0078982).
А.3.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из других сельскохозяйственных растений, амплификация не была обнаружена [16].
Количество копий целевой последовательности не определяли, однако предполагалось, что это однокопийный ген.
А.3.2.3 Предел обнаружения
Не был определен абсолютный предел обнаружения, однако была показана возможность амплификации фрагмента ДНК по крайней мере из 0,1 нг ДНК, выделенной из свежих помидоров (значение определено флуорометрическим методом).
А.3.3 Адаптация
Анализ образцов, прошедших глубокую переработку, может дать отрицательный результат в связи с возможным отсутствием целевых фрагментов ДНК длиной не менее 383 п.н.
Обнаружение фрагментов длиной 383 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК томатов, в то время как обнаружение фрагментов длиной 180 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК генетически модифицированных томатов (Zeneca; Lycopersicon esculentum Mill, сорт Alisa Craig, линия Nema 282F).
A.3.4 Принцип
Ген полигалактуроназы (ген PG) кодирует фермент полигалактуроназу, связанный с созреванием. Этот метод основан на амплификации эндогенного гена (гена дикого типа) PG [17] с размером фрагмента 383 п.н. В генетически модифицированных томатах Zeneca с этой же парой праймеров будет амплифицироваться второй фрагмент длиной 180 п.н., так как эти томаты трансформировались к ДНК гена PG [18], [19].
А.3.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
А.3.5.1 Вода
А.3.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
А.3.5.5 Олигонуклеотиды
А.3.5.5.1 Прямой праймер
Ген PG (позиция базы данных GenBank® N Х04583).
Праймер PG34L: 5’-ggA ТСС ТТА gAA gCA ТСТ AgT-3’.
А.3.5.5.2 Обратный праймер
Ген PG (позиция базы данных GenBank® N Х04583).
Праймер PG34R: 5’-CgT Tgg TgC АТС ССТ gCA Tgg-3’.
А.3.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
А.3.6 Оборудование
В соответствии с А.1.6.
А.3.7 Процедура анализа
А.3.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице А.9. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице А.9.
Таблица А.9 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 1 |
Вода |
| 16,8 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,4 ммоль/л | 1 |
Праймер PG34L, 10 мкмоль/л | 0,4 мкмоль/л | 1 |
Праймер PG34R, 10 мкмоль/л | 0,4 мкмоль/л | 1 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 1 IU | 0,2 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 1,5 ммоль/л. | ||
А.3.7.2 Контроли ПЦР
_______________
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
А.3.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица А.10 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 30 с/94°С |
| 60 с/60°С |
| 60 с/72°С |
Количество циклов | 35 |
Завершающая полимеризация | 6 мин/72°С |
А.3.8 Специфичность продукта ПЦР
К настоящему моменту проверка специфичности основывается только на размере продукта ПЦР.
А.3.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из образцов стандартного состава, приготовленных из томатов.
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в А.3.8.
Обнаружение фрагментов с размером 383 п.н. и 180 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК, происходящую соответственно из томатов и генетически модифицированных томатов Zeneca, в пределах установленных параметров специфичности, описанных в А.3.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
А.4 Метод, специфичный к целевому таксону, для определения компонентов, полученных из кукурузы
А.4.1 Общие положения
Описана стандартная процедура определения видоспецифичного однокопийного гена инвертазы, встречающегося в кукурузе (Zea mays).
Не описан способ проверки идентичности ПЦР-продукта. Поэтому этот метод не может рассматриваться как метод идентификации. Он может быть использован для оценки амплифицируемости ДНК, выделенной из кукурузы.
А.4.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
А.4.2.1 Совместные сличительные испытания
_______________
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице А.11.
Таблица А.11 - Результаты совместных сличительных испытаний [20]
Год проведения испытаний | 1999 |
Количество лабораторий | 18 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 16 |
Количество образцов на лабораторию | 6 |
Количество принятых результатов | 96 |
Количество образцов, содержащих кукурузу Bt-176 | 32 |
Количество образцов, содержащих кукурузу Bt-11 | 32 |
Количество образцов, содержащих немодифицированную кукурузу | 32 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
А.4.2.2 Молекулярная специфичность
А.4.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевой последовательности, описанной в базе данных GenBank®, доступ N U16123.
А.4.2.2.2 Теоретическая часть
В качестве целевой последовательности из базы данных последовательностей ДНК был выбран ген инвертазы кукурузы.
При поиске по базам данных (NCBI BlastN®, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), по состоянию на 28 сентября 2001 г.) была обнаружена некоторая гомология с последовательностями ДНК других сельскохозяйственных культур (бобовые, зерновые культуры, овощи) и ДНК человека и насекомых.
Результаты поиска гомологии по праймеру IVR1-F:
- AF171874 - растворимая кислая инвертаза IVR1 Zea mays (100%-ное совпадение);
- АХ033517 - последовательность 25 из патента DE19906169 (совпадение по 21 смежному нуклеотиду);
- АХ033514 - последовательность 22 из патента DE19906169 (совпадение по 21 смежному нуклеотиду).
Результаты поиска гомологии по праймеру IVR1-R:
- AF171874 - растворимая кислая инвертаза IVR1 Zea mays (100%-ное совпадение);
- АХ150234 - последовательность 30 из патента WO0132919 (100%-ное совпадение);
- AJ224681 - мРНК бета-фруктозидазы Triticum aestivum (совпадение по 20 смежным нуклеотидам);
- AF062735 - растворимая кислая инвертаза Saccharum officinarum (совпадение по 19 смежным нуклеотидам);
- AF062734 - растворимая кислая инвертаза Saccharum robustum (совпадение по 19 смежным нуклеотидам).
Количество копий целевой последовательности не определяли, однако предполагалось, что это однокопийный ген.
А.4.2.2.3 Экспериментальная часть
Метод ПЦР для кукурузы показал свою высокую специфичность к ДНК кукурузы [21].
А.4.2.3 Предел обнаружения
А.4.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
А.4.4 Принцип
Ген инвертазы кукурузы кодирует фермент метаболизма углеводов.
Принцип метода заключается в амплификации фрагмента ДНК длиной 226 п.н. от гена инвертазы кукурузы с использованием ПЦР и разделении с помощью электрофореза в агарозном геле.
А.4.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
А.4.5.1 Вода
А.4.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
А.4.5.5 Олигонуклеотиды
А.4.5.5.1 Прямой праймер
Ген инвертазы кукурузы (позиция базы данных GenBank® N U16123).
Праймер IVR1-F: 5’-CCg CTg ТАТ САС AAG ggC Tgg ТАС С-3’.
А.4.5.5.2 Обратный праймер
Ген инвертазы кукурузы (позиция базы данных GenBank® N U16123).
Праймер IVR1-R: 5’-ggA gCC CgT gTA gAg CAT gAC gAT С-3’.
А.4.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
А.4.6 Оборудование
В соответствии с А.1.6.
А.4.7 Процедура анализа
А.4.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице А.12. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице А.12.
Таблица А.12 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 2 |
Вода |
| 15,3 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,4 ммоль/л | 1 |
Праймер IVR1-F, 10 мкмоль/л | 0,5 мкмоль/л | 1,25 |
Праймер IVR1-R, 10 мкмоль/л | 0,5 мкмоль/л | 1,25 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 1 IU | 0,2 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 1,5 ммоль/л. | ||
А.4.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава, например кукуруза Bt 11 (IRMM-412) или кукуруза Event 176 (Bt 176) (IRMM-411).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
А.4.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица А.13 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 12 мин/95°С |
Амплификация | 30 с/95°С |
| 30 с/64°С |
| 60 с/72°С |
Количество циклов | 35 |
Завершающая полимеризация | 10 мин/72°С |
А.4.8 Специфичность продукта ПЦР
К настоящему моменту проверка специфичности основывается только на размере продукта ПЦР.
А.4.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных образцов стандартного состава, приготовленных из кукурузы (например, IRMM-412 (кукуруза Bt 11) или IRMM-411 (кукуруза Event 176), производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в А.4.8.
Обнаружение фрагментов с размером 226 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК, происходящую из кукурузы, в пределах установленных параметров специфичности, описанных в А.4.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
А.5 Метод, специфичный к целевому таксону, для определения ДНК, выделенной из риса
А.5.1 Назначение, важность и научное обоснование
Лабораторией по выявлению ГМО при Шанхайском университете Джао Тонг (GMDL-SJTU) были организованы совместные сличительные испытания, посвященные оценке применимости метода, специфичного к целевому таксону, с использованием рисового гена сахарозо-фосфат-синтазы (SPS) в качестве эндогена для качественного анализа генетически модифицированного (ГМ) или генетически не модифицированного риса. В указанном исследовании приняли участие 12 лабораторий из Испании, Кореи, Литвы, Словении, Японии, Италии и Китая.
Рабочий процесс совместных сличительных испытаний включал в себя следующие этапы:
- ПЦР, проводимую качественным методом для подтверждения гетерогенности гена SPS у селекционных сортов риса, различных по своему географическому и филогенетическому происхождению;
- ПЦР, проводимую качественным методом для подтверждения видовой специфичности гена SPS для риса;
- ПЦР, проводимую качественным методом для оценки предела обнаружения осуществляемого качественным методом ПЦР-анализа SPS.
Совместные сличительные испытания проводились в соответствии с [44].
Результаты совместных сличительных испытаний и соответствующий протокол представлены в А.5.3.
А.5.2 Принцип
Метод был оптимизирован для использования с семенами риса, а также с переработанными продуктами, такими как рисовая мука. Применимость гена SPS в рамках данных совместных сличительных испытаний оценивалась с использованием образцов ДНК, полученных из семян риса и других растительных материалов.
Организатор совместных сличительных испытаний предоставил остальным участникам специфичные к методу реактивы (праймеры, зонды, исходную реакционную смесь) и образцы ДНК для исследования, выделенные из рисовых продуктов.
А.5.3 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
А.5.3.1 Робастность метода
Робастность проверялась на системе ПЦР для качественного анализа гена SPS при трех различных значениях температуры отжига (56°С, 58°С и 60°С), с тремя различными образцами ДНК, содержащими известные количества ДНК риса (10; 1; 0,1 нг образцов ДНК генома риса), из расчета три повторения на каждый образец. Системы ПЦР для качественного анализа продемонстрировали ожидаемый уровень робастности и хорошо показали себя при всех трех температурах отжига и трех концентрациях образцов ДНК риса.
_______________
А.5.3.2 Внутрилабораторные испытания
Ген SPS риса был описан как пригодный к использованию в качестве референсного эндогена при идентификации и количественном определении риса (см. [44]). Данные технического характера были уточнены и откорректированы в соответствии с информацией, приведенной в [44].
В процессе пробоподготовки при проведении совместных сличительных испытаний все образцы ДНК были получены GMDL-SJTU по методу СТАВ, описанному в ISO 21571:2005 (раздел А.3). Спектрофотометрическое количественное определение выделенных ДНК осуществлялось в соответствии с методом, описанным в ISO 21571:2005 (раздел В.1). По завершении количественной оценки ДНК проводилась ПЦР с применением качественной системы ПЦР на основе гена 18S (см. [45]) с целью получения данных о возможном ингибировании ПЦР.
Испытания системы ПЦР для анализа гена SPS с применением ДНК генома риса проводились силами трех специалистов GMDL-SJTU. Были получены удовлетворительные результаты; в частности, при проведении ПЦР качественным методом было показано, что ген SPS является специфичным для риса, а значение предела обнаружения составляет приблизительно 0,1%.
А.5.3.3 Выполнение совместных сличительных испытаний
Для целей совместных сличительных испытаний каждому участнику было передано 12 образцов ДНК риса для исследований на гетерогенность, 10 образцов ДНК растений, отличных от риса, для исследований на видовую специфичность и 10 последовательно разведенных рисовых образцов для оценки предела обнаружения. Предусмотрены были также положительные и отрицательные контроли.
Гетерогенность гена SPS у селекционных сортов риса оценивалась на примере 12 возделываемых в Китае сортов этой культуры, различных по географическому и филогенетическому происхождению, таких как Najing14, Taibei309, Shengnong265, Jinyinbao, Minghui78, Huke3, Guangluai4, Zhe733, Hejiang19, Baizhehu, Xiangwanxian9 и Nipponbare. Данные, представленные 12 лабораториями, свидетельствуют, что из всех 144 (12х12) образцов ДНК риса, исследованных с применением системы ПЦР для анализа гена SPS, 143 дали положительные результаты. Это означает, что доля ложноотрицательных заключений при использовании системы ПЦР для анализа гена SPS составляет 0,69% (1/144) (см. таблицу А.14). Отсюда следует сделать вывод, что в целевом регионе ген SPS имеет низкую гетерогенность.
Видовая специфичность гена SPS подтверждалась путем сравнения образца ДНК генома риса (Guangluai4) и ДНК 10 других видов, полученной из плодовых частей растений, эволюционно близких к рису, распространенных сельскохозяйственных культур или модельных растений, таких как бамбук (род Phyllostachys), щетинник зеленый (Setaria viridis (L.) Beauv.), ячмень (Hordeum vulgare), пшеница (Triticum aestivum), просо итальянское (Setaria italica), рапс (Brassica napus), томаты (Lycopersicon esculentum), картофель (Solanum tuberosum), соя (Glycine max) и резуховидка Таля (Arabidopsis thaliana). Данные, представленные 12 лабораториями, свидетельствуют, что из всех 120 (10х12) образцов ДНК растений, отличных от риса, исследованных с применением системы ПЦР для анализа гена SPS, 118 дали отрицательные результаты. Это означает, что доля ложноположительных заключений при использовании системы ПЦР для анализа гена SPS на материале 10 других видов растений составила 1,67% (2/120) (см. таблицу А.14). Отсюда следует сделать вывод, что ген SPS является видоспецифичным для определения риса.
Таблица А.14 - Результаты испытаний на гетерогенность и специфичность с применением качественного метода ПЦР
Параметр (сличительные испытания 2007 г.) | Значение |
Количество лабораторий | 12 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 12 |
Количество образцов на лабораторию | 22 |
Количество принятых результатов | 264 |
Количество образцов, содержащих рис | 144 |
Количество образцов, не содержащих рис | 120 |
Ложноположительные результаты | 2 (1,67%) |
Ложноотрицательные результаты | 1 (0,69%) |
Предел обнаружения системы ПЦР для анализа гена SPS был подтвержден с использованием смесовой муки, в которой содержались кукуруза и различные количества риса, определяемые на основе качественного метода ПЦР: все 12 лабораторий смогли выявить ген SPS в образце ДНК, выделенном из смесовой муки с содержанием риса 0,1% или более высоким, и лишь двум лабораториям из 12 удалось выявить его в смесовой муке с массовым содержанием риса 0,01%. Эти данные указывают на то, что предел обнаружения системы ПЦР, предназначенной для анализа гена SPS, следует принять равным 0,1% массовой доли продукта (см. таблицу А.15).
Таблица А.15 - Результаты контроля предела обнаружения для качественного метода ПЦР
Параметр (сличительные испытания 2007 г.) | Массовое отношение риса и кукурузы  | ||||
| 10% | 1% | 0,1% | 0,05% | 0,01% |
Количество лабораторий | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Количество образцов из расчета на лабораторию | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
Количество лабораторий с принятыми результатами | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Положительные результаты | 12 (100%) | 12 (100%) | 12 (100%) | 4 (33,33%) | 2 (16,67%) |
А.5.3.4 Молекулярная селективность
А.5.3.4.1 Общие положения
Для подтверждения специфичности гена SPS для риса качественным методом был выбран фрагмент консервативного участка гена SPS размером 279 п.н., амплицифированный с применением соответствующих праймеров.
А.5.3.4.2 Экспериментальная часть
Образцы ДНК, выделенные из 11 различных растительных продуктов (включая рис), подверглись исследованию с применением системы ПЦР для анализа гена SPS в установленном порядке (см. [44]). Положительные результаты в группе из 11 образцов были получены только для образца риса. Остальные 10 образцов (см. А.5.3.3) дали отрицательные результаты.
Образцы ДНК, выделенные из 12 различных селекционных сортов риса, подверглись исследованию с применением системы ПЦР для анализа гена SPS, как описано в [44]. Все 12 образцов дали положительные результаты.
А.5.3.4.3 Теоретическая часть
Теоретическая специфичность праймера гена SPS оценивалась путем поиска гомологических последовательностей с использованием программы BLASTN 2.0MP-WashU (см. [82], дата поиска: 2010-01-09). Искомая последовательность размером 279 п.н. представлена в базе данных NCBI как часть последовательности с идентификатором U33175 (нуклеотиды 1055-1333). Результаты применения программы BLAST (basic local alignment search tool - средство поиска основного локального выравнивания) показали полную идентичность искомой последовательности и последовательности SPS-гена риса, а также отсутствие гомологии с другими генами и видами.
А.5.4 Принцип и выводы
Данный метод представляет собой процедуру ПЦР-анализа с целью определения пригодности гена SPS для использования в качестве эндогена при качественном выявлении генетически модифицированного или генетически не модифицированного риса. Гетерогенность и видовая специфичность гена SPS, а также соответствующий предел обнаружения были подвергнуты оценке в рамках метрологической аттестации метода. Визуализация продукта ПЦР размером 279 п.н. осуществлялась путем электрофореза в агарозном геле.
А.5.5 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения согласно ISO 5725-1 [40] и ISO 24276.
А.5.6 Типы и количество образцов
Далее в качестве примера представлены данные сличительных испытаний по типам образцов и их количеству, достаточному для реализации описываемого метода.
Образцы ДНК, использовавшиеся в ходе сличительных испытаний, были выделены из семян 12 селекционных сортов риса, из 10 других растительных материалов (см. А.5.3.3), а также из смесовой муки, содержащей различные массовые доли риса и кукурузы.
Участники получили в свое распоряжение следующие образцы:
- 12 образцов ДНК, выделенных из 12 различных селекционных сортов риса, широко возделываемых в различных регионах Китая (Najing14, Taibei309, Shengnong265, Jinyinbao, Minghui78, Huke3, Guangluai4, Zhe733, Hejiang19, Baizhehu, Xiangwanxian9, и Nipponbare), концентрацией 20 нг/мкл, объемом 50 мкл каждый. Эти образцы ДНК были предназначены для подтверждения гетерогенности гена SPS у селекционных сортов риса;
- 11 образцов ДНК риса (Guangluai4) и 10 образцов ДНК других растительных материалов, родственных рису (т.е. бамбука, щетинника зеленого, ячменя, пшеницы, проса итальянского), распространенных генетически модифицированных культур (т.е. рапса, томатов, картофеля и сои) или модельных растений (т.е. резуховидки Таля) концентрацией 20 нг/мкл, объемом 50 мкл каждый. Эти образцы ДНК были предназначены для подтверждения видовой специфичности SPS-гена риса;
- 10 образцов ДНК из смесовой муки, содержащей кукурузу и различные массовые доли риса, концентрацией 20 нг/мкл, объемом 50 мкл каждый. Эти образцы ДНК представляли собой двойные слепые репликации серии из пяти концентраций риса и служили для контроля предела обнаружения системы ПЦР, предназначенной для анализа SPS-гена;
- отрицательная контрольная проба для целевой ДНК (обозначается как N): ДНК из молок лососевых рыб (20 нг/мкл);
- положительная контрольная проба для целевой ДНК (обозначается как Р): ДНК генома риса (Guangluai4) (20 нг/мкл). Все образцы ДНК были подвергнуты очистке в соответствии с методом СТАВ, применяемым GMDL-SJTU. Отрицательные и положительные результаты контроля использовались для каждого ПЦР-планшета;
- реактивы, праймеры, применяемые в системе ПЦР для анализа гена SPS, а именно:
- пара праймеров для стандартной ПЦР: SPS-F/SPS-R;
- разбавляющий раствор для ДНК (0,1x трис-ЭДТА, 1,2 мл).
А.5.7 Предел обнаружения и диапазон применения
ДНК выделялась из пяти образцов смесовой муки, содержащих разное количество риса. Эти образцы исследовались при помощи описанной системы ПЦР для анализа гена SPS (см. [44]). Положительные результаты были получены на образцах, содержащих по массе 10%, 1% и 0,1% риса соответственно. Два других образца (с массовой долей 0,05% и 0,01%) дали отрицательные результаты.
Таким образом, для разработанного метода относительный предел обнаружения при использовании качественного метода ПЦР соответствует массовой доле 0,1%. Система ПЦР для анализа гена SPS может быть использована для специфичного выявления и идентификации рисовых примесей в других растительных материалах.
А.5.8 Расчет неопределенности измерения
Оценка воспроизводимости метода дается исходя из результатов сличительных испытаний (см. А.5.3.3).
А.5.9 Помехи
В ходе проведенных исследований не было получено дополнительной информации о возможных помехах.
А.5.10 Физические условия и условия окружающей среды
Подробнее см. в ISO 24276. В частности:
- должно обеспечиваться строгое разделение рабочих зон для подготовки ДНК, проведения ПЦР, амплификации и электрофореза;
- перед повторным использованием оборудования с него должны удаляться все остаточные следы ДНК;
- во избежание загрязнения для пипеток должны использоваться аэрозольустойчивые наконечники с фильтром;
- должны использоваться неопудренные перчатки и должна обеспечиваться их частая смена.
А.5.11 Инструменты и оборудование
А.5.11.1 Микроцентрифуга.
А.5.11.2 Морозильник, обеспечивающий температуру минус 20°С, и холодильник, обеспечивающий температуру 4°С.
А.5.11.3 Микропипетки.
А.5.11.4 Мешалка, например вихревая.
А.5.11.5 Пробирки для микроцентрифуги вместимостью 0,2; 1,5 и 2,0 мл.
А.5.11.6 Наконечники, в том числе с защитой от аэрозолей, для микропипеток.
А.5.11.7 Штатив для реакционных пробирок.
А.5.11.8 Перчатки, ПВХ или латексные.
А.5.11.9 Оборудование для амплификации ДНК (термоблок или аналогичное устройство).
А.5.11.10 Оборудование для электрофореза с блоком питания.
А.5.11.11 Система визуализации для гелевого анализа.
А.5.11.12 Микроволновая печь (не обязательно).
А.5.12 Реактивы и материалы
А.5.12.1 Общие положения
Если не указано иное, использовались только реактивы, отвечающие требованиям ISO 24276, и только вода категории "для молекулярной биологии" или сопоставимой степени чистоты.
А.5.12.2 Качественный метод ПЦР
А.5.12.2.3 Раствор dNTP, 2,5 ммоль/л.
А.5.12.2.4 Праймер (см. таблицу А.16).
А.5.12.2.5 Полимераза ДНК термостабильная.
А.5.12.3 Электрофорез
Подробнее см. в ISO 21571:2005 (раздел В.1).
А.5.12.3.1 Загрузочный буфер (10 г/л натрия додецил сульфата, 500 г/л глицерина, 0,5 г/л бромфенолового синего), 10x.
А.5.12.3.2 Размерный стандарт ДНК.
А.5.13 Отбор, транспортировка, консервация и хранение образцов
Растворы ДНК могут храниться при температуре 4°С в течение не более чем 1 нед или при температуре минус 20°С в течение более длительного времени.
А.5.14 Подготовка испытуемого образца
Репрезентативность испытуемого образца по отношению к лабораторному образцу может обеспечиваться, например, путем размола или гомогенизации. Порядок выполнения измерений и пошаговые процедуры, которым необходимо следовать, описаны в ISO 21571 и ISO 24276.
А.5.15 Калибровка приборов
Используемые приборы, например амплификаторы и пипетки, должны калиброваться, как указано в ISO/IEC 17025 [41].
А.5.16 Этапы проведения анализа
А.5.16.1 Подготовка ДНК для проведения ПЦР качественным методом
ДНК выделяют из образцов в соответствии с подходящим методом экстрагирования, например методом СТАВ, описанным в ISO 21571:2005 (раздел А.3). Перед проведением ПЦР образцы ДНК оттаивают, осторожно перемешивают и обрабатывают в центрифуге. Размороженные реактивы сохраняют на льду при температуре от 1°С до 4°С.
А.5.16.2 Реактивы для ПЦР
А.5.16.2.1 Реакционная смесь для стандартной ПЦР
А.5.16.2.2 Праймеры
См. таблицу А.16.
Таблица А.16 - Олигонуклеотидные последовательности праймеров для проведения ПЦР качественным методом
Название | Олигонуклеотидные последовательности ДНК (5’-3’) |
Последовательности праймеров для проведения ПЦР качественным методом | |
SPS-праймер F | TTg CgC CTg AAc ggA TAT |
SPS-праймер R | ggA gAA gCA CTg gAC gAgg |
А.5.16.3 Процедура анализа
А.5.16.3.1 Общие положения
Качественный метод ПЦР для гена SPS риса рассчитан на общий объем смеси 30 мкл из расчета на одну реакцию. Рекомендуется использовать 100 нг матричной ДНК на каждую реакционную лунку.
Перед проведением ПЦР исходную реакционную смесь оттаивают, осторожно перемешивают и обрабатывают в центрифуге. Размороженные реактивы сохраняют на льду при температуре от 1°С до 4°С.
Осторожно перемешивают содержимое пробирок для ПЦР и обрабатывают их в микроцентрифуге при 1000g в течение 10 с.
Устанавливают планшет в амплификатор.
Запускают программу ПЦР в режиме качественного анализа.
А.5.16.4 Контроли ПЦР
См. 7.5 и ISO 24276.
А.5.16.5 Программа "температура - время"
_______________
Таблица А.17 - Программа для проведения ПЦР качественным методом
Шаг | Этап | Температура, °С | Время | Количество циклов | |
1 | Активация и начальная денатурация | 94 | 900 | 1х | |
2a | Амплификация | Денатурация | 94 | 30 | 35x |
2b |
| Отжиг | 58 | 30 |
|
2c |
| Элонгация | 72 | 30 |
|
3 | Окончательная элонгация | 72 | 420 | 1х | |
А.5.16.6 Обнаружение
По завершении программы ПЦР помещают по 3 мкл 10x загрузочного буфера в каждую реакционную пробирку и смешивают с продуктами ПЦР.
Наносят по 10 мкл каждого продукта ПЦР на гель для электрофореза (20 г/л агарозы, 0,5 мкг/мл бромистого этидия).
Обрабатывают гель в оборудовании для электрофореза при 5 В/см в течение 20 мин.
Фиксируют результаты разделения в геле с помощью средств УФ-визуализации или аналогичной системы.
Искомым продуктом является фрагмент размером 279 п.н.; все остальные полосы, наблюдаемые при электрофорезе в агарозном геле, относятся к побочным продуктам.
А.5.16.7 Критерии приемки или отбраковки
Для оценки результатов сличительных испытаний применяются следующие требования к эффективности метода.
Фрагмент размером 279 п.н. должен быть выявлен в положительной контрольной пробе для риса (образец Р), при этом целевой фрагмент не должен обнаруживаться в отрицательной контрольной пробе (образец N) и холостой пробе. Выявление фрагментов размером 279 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК SPS, таким образом, результат признается положительным, в противном случае результат признается отрицательным.
А.5.17 Идентификация образцов
Все образцы должны быть четко идентифицированы.
А.5.18 Интерпретация и расчет результатов
Ожидаемая длина ампликона SPS составляет 279 п.н.
Фрагмент размером 279 п.н. должен быть выявлен в контрольной пробе для риса (образец Р), при этом целевой фрагмент не должен обнаруживаться в отрицательной контрольной пробе (образец N) и холостой пробе. Выявление фрагментов размером 279 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК SPS, таким образом, результат признается положительным, в противном случае результат признается отрицательным.
А.6 Метод, специфичный к целевому таксону, для определения ДНК, полученных из томатов
А.6.1 Назначение, важность и научное обоснование
Ген LAT52 кодирует устойчивый к нагреванию гликозилированный цистеин-богатый белок, необходимый для образования пыльцы у томатов. Доказано, что система обнаружения LAT52 в качестве видоспецифичного гена может быть использована для идентификации и количественного определения генетически модифицированных томатов (см. [46]). Лабораторией по выявлению ГМО при Шанхайском университете Джао Тонг (GMDL-SJTU) были организованы совместные сличительные испытания, посвященные оценке применимости гена томатов LAT52 как видоспецифичного для качественного анализа генетически модифицированных (ГМ) или генетически не модифицированных томатов. В указанном исследовании приняли участие 13 лабораторий из США, Сингапура, Кореи, Литвы, Словении, Норвегии, Италии и Китая (см. [47]). Результаты представлены в таблицах А.18 и А.19.
Рабочий процесс совместных сличительных испытаний включал в себя следующие этапы:
a) ПЦР, проводимую качественным методом для подтверждения гетерогенности гена LAT52 у селекционных сортов томатов, различных по своему географическому и филогенетическому происхождению;
b) ПЦР, проводимую качественным методом для подтверждения видоспецифичности гена LAT52 для томатов;
c) ПЦР, проводимую качественным методом для оценки предела обнаружения осуществляемого качественным методом ПЦР-анализа LAT52.
Совместные сличительные испытания проводились в соответствии со следующими признаваемыми международными руководствами:
ISO 5725-2 [39], в особенности что касается требований к мере прецизионности (т.е. повторяемости и воспроизводимости) и правильности;
протоколом IUPAC, посвященным планированию, проведению и интерпретации результатов исследований с целью оценки эффективности метода (см. [48]).
А.6.2 Принцип
Данный метод описывает порядок обнаружения ДНК томатов средствами качественной ПЦР.
Метод был оптимизирован для использования с семенами томатов, плодами томатов, томатным кетчупом, томатным соком и другими переработанными продуктами, получаемыми из томатов.
Применимость гена LAT52 в рамках данных совместных сличительных испытаний оценивалась с использованием образцов ДНК, выделенных из семян томатов и других растительных материалов.
А.6.3 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
А.6.3.1 Робастность метода
Робастность проверялась разработчиком метода на системе ПЦР для качественного анализа гена LAT52 при трех различных значениях температуры отжига (56°С, 58°С и 60°С), с тремя различными образцами ДНК, содержащими известные количества ДНК из семян томатов (10; 1; 0,1 нг образцов ДНК генома томатов, из расчета три повторения на каждый образец). Системы ПЦР для качественного анализа продемонстрировали ожидаемый уровень робастности и показали себя удовлетворительно при всех трех температурах отжига и трех концентрациях образцов ДНК томатов.
_______________
А.6.3.2 Внутрилабораторные испытания
Ген томатов LAT52 был признан пригодным к использованию в качестве видоспецифичного гена при идентификации и количественном определении генетически модифицированных томатов (см. [46]). Данные технического характера были уточнены и откорректированы в соответствии с информацией в документе по ссылке [46].
В процессе пробоподготовки в целях метрологической аттестации образцы ДНК выделялись GMDL-SJTU по методу СТАВ, описанному в ISO 21571:2005 (раздел А.3). Спектрометрическое определение общего количества выделенной ДНК осуществлялось по методу, описанному в ISO 21571:2005 (раздел В.1). По завершении количественной оценки ДНК выполнялась ПЦР с применением качественного метода ПЦР на основе гена 18S с целью получения данных о возможном ингибировании ПЦР.
Система ПЦР для анализа гена LAT52 была испытана в GMDL-SJTU при участии трех операторов с использованием ДНК генома томатов и обеспечила получение удовлетворительных и непротиворечивых результатов; в частности, для ПЦР, выполняемой качественным методом, результаты показали, что ген LAT52 является специфическим для томатов и что относительный предел обнаружения соответствует массовой доле, не превышающей 0,1%.
А.6.3.3 Совместные сличительные испытания
Гетерогенность гена LAT52 у селекционных сортов томатов оценивалась на примере 12 возделываемых в Китае сортов этой культуры, таких как Shengnong2, Jifan4, Zhongsu5, Yashu6, Jiafen1, Shenfeng2, Hongza9, R144, Nongyou30, Dongnong704, Lichun и Zaokui. Данные, представленные 13 лабораториями, свидетельствуют, что из всех 156 (12х13) образцов ДНК томатов, исследованных с применением системы ПЦР для анализа гена LAT52, 155 дали положительные результаты. Это означает, что доля ложноотрицательных заключений при использовании системы ПЦР для анализа гена LAT52 составляет 0,64% (1/156) (см. таблицу А.18). Отсюда следует сделать вывод, что ген LAT52 имеет низкую гетерогенность у селекционных сортов томатов, возделываемых в Китае.
Видовая специфичность гена LAT52 подтверждалась путем сравнения образца ДНК генома томатов (Jiafen1) и ДНК 10 других видов, полученной из плодовых частей растений, эволюционно близких к томатам, распространенных генетически модифицированных сельскохозяйственных культур или модельных растений, таких как баклажан (Solanum melongena), картофель (Solanum tuberosum), сладкий перец (Capsicum annuum), кукуруза (Zea mays), соевые бобы (Glycine max), рапс (Brassica rapa), рис (Oryza sativa), а также из листьев петунии (Petunia hybrida), табака (Nicotiana tabacum) и резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana). Данные, представленные 13 лабораториями, свидетельствуют, что из всех 130 (10x13, без учета томатов) образцов ДНК различных растений, исследованных с применением системы ПЦР для анализа гена LAT52, 126 дали положительные результаты. Это означает, что доля ложноположительных заключений при использовании системы ПЦР для анализа гена LAT52 составила 3,08% (4/130) (см. таблицу А.14). Отсюда следует сделать вывод, что ген LAT52 является видоспецифичным для определения томатов.
Таблица А.18 - Результаты проведения ПЦР качественным методом
Параметр (сличительные испытания в 2007 г.) | Значение |
Количество лабораторий | 13 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 13 |
Количество образцов из расчета на лабораторию | 22 |
Количество принятых результатов | 286 |
Количество образцов, содержащих томаты | 156 |
Количество образцов, не содержащих томаты | 130 |
Ложноположительные результаты | 4 (3,08%) |
Ложноотрицательные результаты | 1 (0,64%) |
Предел обнаружения системы ПЦР для анализа гена SPS был подтвержден с использованием смесовой муки, в которой содержались кукуруза и семена томатов, присутствие которых определялось на основе качественного метода ПЦР: все 13 лабораторий справились с выявлением образца ДНК, выделенной из смесовой муки с массовой долей томатов 0,1% или более высокой. Эти данные указывают на то, что предел обнаружения системы ПЦР для анализа гена LAT52 следует принять равным 0,1% массовой доли продукта (см. таблицу А.19).
Таблица А.19 - Результаты контроля предела обнаружения для качественного метода ПЦР
Параметр (сличительные испытания в 2007 г.) | Массовое отношение томатов и кукурузы  | ||||
| 2% | 0,5% | 0,1% | 0,05% | 0,01% |
Количество лабораторий | 13 | 13 | 13 | 13 | 13 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 13 | 13 | 13 | 13 | 13 |
Количество образцов из расчета на лабораторию | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
Количество образцов | 26 | 26 | 26 | 26 | 26 |
Положительные результаты | 25 (96,2%) | 25 (96,2%) | 26 (100%) | 0 (0%) | 2 (15,4%) |
А.6.3.4 Молекулярная селективность
А.6.3.4.1 Общие положения
Метод LAT52 ориентирован на определение гена LAT52, который постоянно присутствует в количестве одной копии на каждый гаплоидный геном в различных селекционных сортах томатов. Специфические праймеры (см. таблицу А.20) амплифицируют фрагмент длиной 92 п.н.
А.6.3.4.2 Экспериментальная часть
Образцы ДНК, выделенные из 11 различных растительных продуктов (включая томаты), были исследованы разработчиком метода с применением соответствующей системы ПЦР для анализа гена LAT52. Из всех 11 образцов только для ДНК томатов были получены положительные результаты. Остальные 10 образцов (см. А.6.3.3) дали отрицательные результаты.
Образцы ДНК, выделенные из 12 различных селекционных сортов томатов, были исследованы разработчиком метода с применением соответствующей системы ПЦР для анализа гена LAT52 (см. А.6.6). Все образцы дали положительные результаты.
А.6.3.4.3 Теоретическая часть
Теоретическая специфичность праймеров LAT52 оценивалась путем поиска гомологических последовательностей с использованием программы BLASTN 2,0MP-WashU (см. [82], дата поиска: 2010-01-20). Искомая последовательность размером 92 п.н. представлена в базе данных NCBI как часть последовательности с идентификатором Х15855 (нуклеотиды 1385-1476). Результаты применения программы BLAST показали полную идентичность искомой последовательности и специфичной для пыльников томатов последовательности гена LAT52, а также отсутствие гомологии данной последовательности с другими генами и видами.
А.6.4 Принцип и выводы
Данный метод представляет собой процедуру ПЦР-анализа, выполняемого качественным методом с целью определения пригодности гена LAT52 для использования в качестве видоспецифичного для томатов гена при качественном выявлении генетически модифицированных или немодифицированных томатов. Обнаружение продукта ПЦР длиной 92 п.н. осуществлялось путем электрофореза в агарозном геле.
А.6.5 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения согласно ISO 5725-1 [40] и ISO 24276.
А.6.6 Типы и количество образцов
Для сличительных испытаний использовались следующие образцы:
- 12 образцов ДНК, выделенных из 12 различных селекционных сортов томатов, широко возделываемых в различных регионах Китая (Shengnong2, Jifan4, Zhongsu5, Yashu6, Jiafen1, Shenfeng2, Hongza9, Nongyou30, R144, Dongnong704, Lichun, и Zaokui), концентрацией 20 нг/мкл, объемом 50 мкл каждый. Эти образцы ДНК служили для подтверждения гетерогенности целевой последовательности LAT52 у селекционных сортов томатов;
- 11 образцов ДНК семян томатов (Jiafen1) и листьев 10 других растительных материалов, родственных томатам (т.е. баклажана, картофеля, петунии и стручкового перца), а также относящихся к широко распространенным генетически модифицированным сельскохозяйственным растениям (т.е. кукурузы, сои, рапса и риса) либо модельным растениям (т.е. табака и кресс-салата), концентрацией 20 нг/мкл, объемом 50 мкл каждый. Эти образцы ДНК служили для подтверждения специфичности метода LAT52;
- 10 образцов ДНК из смесовой муки, содержащей кукурузу и различное количество томатов, концентрацией 20 нг/мкл, объемом 50 мкл каждый. Эти образцы ДНК представляли собой двойные слепые репликации серии из пяти концентраций томатов и служили для контроля предела обнаружения системы ПЦР, предназначенной для анализа гена LAT52.
А.6.7 Предел обнаружения и диапазон применения
Предел обнаружения метода соответствовал приблизительно 0,1% массовой доли томатных продуктов. Метод, основанный на выявлении LAT52, может использоваться для специфичного обнаружения и определения томатных продуктов в образце.
Образцы ДНК, выделенные из пяти разновидностей смесовой муки с различными массовыми долями продуктов из семян томатов, были исследованы с применением системы ПЦР для анализа гена LAT52. Положительные результаты были получены только на образцах муки, содержащих по массе 0,1% томатов или более (т.е. 2%, 0,5% и 0,1% соответственно). Два других образца (с массовой долей 0,05% и 0,01%) дали отрицательные результаты.
А.6.8 Расчет неопределенности измерения
Общая неопределенность метода оценивается исходя из результатов совместных сличительных испытаний (см. А.6.3.3).
А.6.9 Помехи
В ходе проведенных исследований не было представлено дополнительной информации о наблюдаемых помехах.
А.6.10 Физические условия и условия окружающей среды
Подробнее см. в ISO 24276.
А.6.11 Инструменты и оборудование
А.6.11.1 Оборудование для амплификации ДНК (термоблок или аналогичное устройство).
А.6.11.2 Оборудование для электрофореза с блоком питания.
А.6.11.3 Система документирования для гелевого анализа.
А.6.11.4 Микроволновая печь (не обязательно).
А.6.12 Реактивы и материалы
Если не указано иное, использовались только реактивы, отвечающие требованиям ISO 24276, и только вода категории "для молекулярной биологии" или сопоставимой степени чистоты.
А.6.11.3 Реакционная смесь для стандартной ПЦР (см. А.6.16.2).
А.6.12.2 Олигонуклеотиды (см. таблицу А.20).
А.6.12.3 Загрузочный буфер.
А.6.12.4 Электрофорезный буфер.
А.6.12.5 Агароза.
А.6.12.6 Размерный стандарт ДНК.
А.6.13 Отбор, транспортировка, консервация и хранение образцов
Растворы ДНК могут храниться при температуре 4°С в течение не более чем 1 нед или при температуре минус 20°С в течение более длительного времени.
А.6.14 Подготовка испытуемого образца
Репрезентативность испытуемого образца по отношению к лабораторному образцу может обеспечиваться, например, путем размола или гомогенизации. Порядок выполнения измерений и пошаговые процедуры, которым необходимо следовать, описаны в ISO 21571.
Образцы ДНК выделялись GMDL-SJTU по методу СТАВ в соответствии с ISO 21571:2005 (раздел А.3).
А.6.15 Калибровка приборов
Используемые приборы, например амплификаторы и пипетки, подлежат калибровке, в частности, согласно ISO/IEC 17025 [41].
А.6.16 Этапы проведения анализа
А.6.16.1 Подготовка ДНК для проведения ПЦР качественным методом
При выделении ДНК из испытуемого образца должны соблюдаться общие инструкции и меры, описанные в ISO 21571. Рекомендуется выбирать для выделения ДНК методы, представленные в ISO 21571:2005 (приложение А).
А.6.16.2 Реакционная смесь для стандартной ПЦР
Таблица А.20 - Олигонуклеотидные последовательности праймеров для проведения ПЦР качественным методом
Название | Олигонуклеотидные последовательности ДНК (5’-3’) |
LAT52-праймер F | A gAC CAC gAg AAC gAT ATT TgC |
LAT52-праймер R | TT CTT gCC TTT TCA TAT CCAg ACA |
А.6.16.3 Процедура анализа
Данный способ проведения ПЦР рассчитан на общий объем смеси 30 мкл на реакцию. Рекомендуется использовать 100 нг матричной ДНК на реакционную лунку.
Перед проведением стандартной ПЦР исходную реакционную смесь оттаивают, осторожно перемешивают и обрабатывают в центрифуге. Размороженные реактивы сохраняют на льду при температуре от 1°С до 4°С.
Осторожно перемешивают содержимое пробирок для ПЦР и в течение непродолжительного времени обрабатывают их в микроцентрифуге для объединения всех имеющихся капель раствора.
Устанавливают планшет в прибор.
Запускают программу ПЦР для качественного анализа с параметрами, описанными в А.6.16.5.
А.6.16.4 Контроли ПЦР
Положительные и отрицательные контроли должны использоваться в соответствии с ISO 24276.
А.6.16.5 Программа "температура - время"
_______________
Таблица А.21 - Программа для проведения ПЦР качественным методом
Шаг | Этап | Температура, °С | Время | Количество циклов | |
1 | Активация и начальная денатурация | 94 | 900 | 1х | |
2a | Амплификация | Денатурация | 94 | 30 | 35x |
2b |
| Отжиг | 56 | 30 |
|
2c |
| Элонгация | 72 | 30 |
|
3 | Окончательная элонгация | 72 | 420 | 1х | |
А.6.16.6 Обнаружение
По окончании ПЦР помещают по 2 мкл загрузочного буфера в каждую реакционную пробирку и смешивают с продуктами ПЦР.
Наносят по 10 мкл каждого продукта ПЦР на гель для электрофореза (30 г/л агарозы, 0,5 мкг/мл бромистого этидия).
Обрабатывают гель в оборудовании для электрофореза при 5 В/см в течение 20 мин.
Визуализация и фиксация результатов осуществляются с применением соответствующей системы визуализации для гелевого анализа.
Ввиду малой длины ампликона в качестве электрофорезного буфера должна использоваться ТБЭ.
Фрагмент 92 п.н. должен представлять собой специфический продукт; присутствие других фрагментов ДНК свидетельствует о неспецифической амплификации.
А.6.16.7 Критерии приемки или отбраковки
Фрагмент размером 92 п.н. должен быть выявлен в положительной контрольной пробе для томатов (образец Р), при этом продукты ПЦР не должны обнаруживаться в отрицательной контрольной пробе (образец N) и холостой пробе. Выявление фрагментов размером 92 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК LAT52, таким образом, результат признается положительным, в противном случае результат признается отрицательным.
А.6.17 Идентификация образцов
Образцы должны четко идентифицироваться по признаку "обнаружено - не обнаружено".
А.6.18 Интерпретация и расчет результатов
Выявление фрагментов размером 92 п.н. свидетельствует о том, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК LAT52, таким образом, результат записывается как "обнаружено", в противном случае результат записывается как "не обнаружено".
Наличие продукта ПЦР длиной 92 п.н. может быть проверено аналитически путем секвенирования ДНК.
Разделы А.5, А.6 (Введены дополнительно, Изм. N 1).
Приложение В
(справочное)
Методы скрининга
В.1 Метод скрининга для обнаружения ДНК генетически модифицированных растений (промотор 35S вируса мозаики цветной капусты)
В.1.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения различного количества копий последовательности ДНК промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Так как промотор 35S присутствует во многих генетически модифицированных растениях, этот метод может быть использован для скрининга наличия ДНК из генетически модифицированного растения [22], [23].
В.1.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.1.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод был метрологически аттестован в нескольких совместных сличительных испытаниях с использованием различных материалов пищевых продуктов (как сырье, так и переработанные продукты) [24], [25].
Этот метод был метрологически аттестован в совместном сличительном испытании [24], проведенном под руководством рабочей группы "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV). Количество участников, а также количество образцов устанавливали в соответствии с критериями ISO 5725-2. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3 (однако вес анализируемой части образца составлял 100 мг).
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице В.1.
Таблица В.1 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1999 |
Количество лабораторий | 27 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 23 |
Количество образцов на лабораторию | 5 |
Количество принятых результатов | 115 |
Количество образцов, содержащих сою линии GTS 40-3-2 | 59 |
Количество образцов, содержащих немодифицированную сою | 56 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
В.1.2.2 Молекулярная специфичность
В.1.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевой последовательности, описанной, например, в базе данных GenBank®, доступ N V00141.
Список генетически модифицированных растений, содержащих промотор 35S CaMV, приводится в приложении к ссылке [24].
Не исключается возможность получения ложноположительных результатов из-за того, что амплифицируемая последовательность получена из вируса мозаики цветной капусты, поражающего цветную капусту, а также другие растения семейств Brassicaceae (Cruciferae), а также Resedaceae и Solanaceае [26], [27].
В связи с этим следует с особенной тщательностью рассматривать положительные результаты, полученные при анализе образцов из растений семейств Brassicaceae, Resedaceae и Solanaceae.
Положительные результаты могут означать наличие продукта, полученного из генетически модифицированных растений, однако не могут быть интерпретированы как доказательство наличия генетически модифицированного продукта без дополнительного подтверждения.
Для того чтобы различить инфицирование вирусом и генетическую модификацию, можно использовать методы обнаружения вируса мозаики цветной капусты [6].
В.1.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (NCBI BlastN®, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), по состоянию на 28 сентября 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированными сельскохозяйственными растениями. Однако оба праймера совпадали с одним доступом базы данных, не относящимся ни к вирусу мозаики цветной капусты, ни к рекомбинантным векторам или патентам: S70105 ср (белок оболочки) вируса мозаики огурцов. Кроме того, праймеры соответствовали более чем 100 позициям базы данных, относящимся к вирусу мозаики цветной капусты и рекомбинантным векторам и патентам.
В.1.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированных сельскохозяйственных растений в отсутствие вируса мозаики цветной капусты, не наблюдали амплификации [22], [24], [25], [28].
Успешная амплификация была обнаружена при проведении ПЦР на ДНК, выделенной из различных генетически модифицированных растений, например GTS-40-3-2 (соевые бобы RoundUp Ready®), линий кукурузы Event 176 (Bt 176), Bt 11, MON 810, MON 809, а также томатов с замедленным созреванием (Zeneca) [22], [24], [25], [28].
Количество копий последовательности ДНК может варьироваться.
В.1.2.3 Предел обнаружения
Не был определен абсолютный предел обнаружения. Был показан относительный предел обнаружения, составляющий 0,1% генетически модифицированной сои в соевой муке IRMM-410 и 0,1% генетически модифицированной кукурузы Event 176 (Bt 176) IRMM-411 в кукурузной муке (массовая фракция) (сертифицированные образцы стандартного состава) [25].
В.1.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
В.1.4 Принцип
Принцип метода заключается в амплификации фрагмента ДНК длиной 195 пн из промотора 35S вируса мозаики цветной капусты с использованием ПЦР и обнаружением после разделения с помощью электрофореза в агарозном геле. Для проверки специфичности продукта ПЦР следует выполнить этап подтверждения.
Промоторы - это последовательности распознавания или связывающие последовательности для РНК-полимераз, которые отвечают за экспрессию генов. Промотор 35S из вируса мозаики цветной капусты наиболее часто используется при генетической модификации растений [24].
В.1.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
В.1.5.1 Вода
В.1.5.4 Раствор dNTP, концентрация dNTP=2,5 ммоль/л (каждого).
В.1.5.5 Олигонуклеотиды
В.1.5.5.1 Прямой праймер
Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, 35s-1: [24], [28] 5’-gCT ССТ АСА ААТ gCC АТС А-3’.
Подобран вместе с соответствующим обратным праймером для амплификации последовательностей, описанных, например, в позиции N V00141.
В.1.5.5.2 Обратный праймер
Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, 35s-2: [24], [28] 5’-gAT AgT ggg ATT gTg CgT CA-3’.
Подобран вместе с соответствующим прямым праймером для амплификации последовательностей, описанных, например, в позиции N V00141.
В.1.5.6 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
В.1.5.7 Рестриктаза: Xmn I (= Asp 700).
В.1.6 Оборудование
В.1.6.1 Амплификатор
В.1.6.2 Камера для электрофореза, с источником питания.
В.1.7 Процедура анализа (проведение ПЦР)
В.1.7.1 Общие положения
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице В.2. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице В.2.
Таблица В.2 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца | От 10 до 50 нг | 1 |
Вода |
| 15,9 |
10 буфер для ПЦР (без ) | 1 | 2,5 |
Раствор , 25 ммоль/л , 25 ммоль/л | 1,5 ммоль/л | 1,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,8 ммоль/л | 2 |
Праймер 35s-1, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
Праймер 35s-2, 5 мкмоль/л | 0,2 мкмоль/л | 1 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 0,5 IU | 0,1 |
Если буферный раствор для ПЦР уже содержит , конечную концентрацию в реакционной смеси доводят до 1,5 ммоль/л. | ||
В.1.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава GTS 40-3-2 (материал, содержащий 0,1% компонентов генетически модифицированных растений), производимые Институтом референсных материалов и измерений (IRMM), Гиль, Бельгия (IRMM-410).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли, согласно описанию в ISO 24276.
В.1.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица В.3 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 20 с/ 94°С |
| 40 с/ 54°С |
| 60 с/ 72°С |
Количество циклов | 40 |
Завершающая полимеризация | 3 мин/72°С |
В.1.8 Специфичность продукта ПЦР
Проверка специфичности продукта ПЦР может быть выполнена с помощью его рестрикционного анализа рестриктазой Xmn I. В результате такой рестрикции ожидается получение двух фрагментов (длиной 115 и 80 п.н.) [22], [24].
В.1.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных образцов стандартного состава (приготовленных, например, из серии стандартов IRMM-410 (соя линии GTS 40-3-2) производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в В.1.8.
Обнаружение фрагментов с размером 195 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК из вируса мозаики цветной капусты или из генетически модифицированного растения в пределах установленных параметров специфичности, описанных в В.1.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
В.2 Альтернативный метод скрининга для обнаружения ДНК генетически модифицированных растений (промотор 35S вируса мозаики цветной капусты)
В.2.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения различного количества копий последовательности ДНК промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) в образцах продуктов, прошедших переработку. Так как промотор 35S присутствует во многих генетически модифицированных растениях, этот метод может быть использован для скрининга наличия ДНК из генетически модифицированного растения [22], [23], [29].
Не описан способ проверки специфичности ПЦР-продукта. Поэтому этот метод не может рассматриваться как метод идентификации. Он может быть использован для оценки амплифицируемости ДНК, содержащей целевую последовательность.
В.2.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.2.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод прошел метрологическую аттестацию в соответствии с критериями, заданными ISO 5725-2. В совместных сличительных испытаниях, координируемых объединенным центром исследований ЕС JRC, участвовали 23 европейские лаборатории [29], [30]. Оценивали способность метода обнаруживать ГМО в различных материалах образцов переработанной пищевой продукции (готовые продукты из кукурузы, детское питание, печенье, продукты из квашеных соевых бобов), каждый из которых содержал 0%, 2% и 100% (для печенья использовали 10% вместо 100%) сои линии GTS-40-3-2 или кукурузы Event 176. Каждый участник получал 4 контрольных образца и 30 образцов неизвестного состава в независимых повторностях, из которых 10 содержали 0% ГМО, а 20 - ингредиенты с различным процентом содержания генетических модификаций. Все участники получили подробное описание метода выделения ДНК с помощью методики ЦТАБ или коммерчески доступного набора для выделения. Однако лаборатории имели право использовать их собственные методы выделения ДНК; в то же время условия ПЦР должны были быть оптимизированы индивидуально для имеющегося у участников оборудования. От лабораторий требовали провести анализ каждого образца один раз и определить, содержит ли образец ГМО или нет. Так как большинство лабораторий предоставили правильные результаты (результаты 14 лабораторий попали в диапазон от 90% до 100% от истинного значения; результаты 3 лабораторий - от 80% до 90% от истинного значения) и ни одна лаборатория не предоставила правильные результаты в диапазоне от 70% до 80%, было установлено значение среза правильных результатов, равное 80%. Вследствие этого результаты 5 лабораторий были исключены из дальнейшей статистической обработки. Для не содержащих ГМО образцов было определено среднее значение правильных результатов, составившее 96,1% (3,9% ложноположительных результатов); для образцов, содержащих ГМО, было определено среднее значение правильных результатов, равное 98,1% (1,9% ложноотрицательных результатов) [30].
Результаты совместных сличительных испытаний приводятся в таблице В.4.
Таблица В.4 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1999 |
Количество лабораторий | 30 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 18 |
Количество образцов на лабораторию | 12 |
Общее количество образцов | 360 |
Количество принятых результатов | 540 |
Ложноположительные результаты | 3,9% |
Ложноотрицательные результаты | 1,9% |
В.2.2.2 Молекулярная специфичность
В.2.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевой последовательности, описанной, например, в базе данных GenBank®, доступ N V00141. Список генетически модифицированных растений, содержащих промотор 35S CaMV, приводится в ссылках [23] и [24].
Не исключается возможность получения ложноположительных результатов из-за того, что амплифицируемая последовательность получена из вируса мозаики цветной капусты, поражающего цветную капусту, а также другие растения семейств Brassicaceae (Cruciferae), а также Resedaceae и Solanaceае [26], [27].
В связи с этим следует с особенной тщательностью рассматривать положительные результаты, полученные при анализе образцов из растений семейств Brassicaceae, Resedaceae и Solanaceae. Положительные результаты могут означать наличие продукта, полученного из генетически модифицированных растений, однако не могут быть интерпретированы как доказательство наличия генетически модифицированного продукта без дополнительного подтверждения.
Для того чтобы различить инфицирование вирусом и генетическую модификацию, можно использовать методы обнаружения вируса мозаики цветной капусты [6].
В.2.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (NCBI BlastN®, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), по состоянию на 28 сентября 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированными сельскохозяйственными растениями. Праймеры соответствовали значительному количеству позиций базы данных, относящихся к вирусу мозаики цветной капусты и рекомбинантным векторам и патентам.
В.2.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированных соевых бобов в ходе предварительных совместных сличительных исследований, не наблюдали амплификации [29].
В.2.2.3 Предел обнаружения
Для этого метода не был определен абсолютный предел обнаружения, однако была показана способность обнаружения по крайней мере 50 копий ДНК сои линии GTS 40-3-2 [29].
Также не был определен и относительный предел обнаружения, но в ходе совместных сличительных испытаний [28] была показана возможность обнаружения 2% ГМО GTS 40-3-2 (соевые бобы RoundUp Ready®) и/или кукурузы Event 176 (кукуруза Bt 176) в печенье, детском питании и квашеных соевых бобах с 100% правильных результатов [30].
В.2.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
В.2.4 Принцип
Принцип метода заключается в амплификации фрагмента ДНК длиной 123 п.н. из промотора 35S вируса мозаики цветной капусты с использованием ПЦР и обнаружении с помощью электрофореза в агарозном геле. Для проверки специфичности продукта ПЦР можно, например, использовать секвенирование ДНК. Однако ни одна из процедур подтверждения идентичности не прошла метрологической аттестации.
Промоторы - это последовательности распознавания или связывающие последовательности для РНК-полимераз, которые отвечают за экспрессию генов. Промотор 35S из вируса мозаики цветной капусты наиболее часто используется при генетической модификации растений [22].
В.2.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
В.2.5.1 Вода
В.2.5.3 Раствор dNTP, концентрация dNTP=4 ммоль/л (каждого).
В.2.5.4 Олигонуклеотиды
В.2.5.4.1 Прямой праймер
Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, 35s-cf3: 5’-ССА CgT СТТ САА AgC AAg Tgg-3’.
Подобран для амплификации промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, например позиция N V00141.
В.2.5.4.2 Обратный праймер
Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, 35s-cr4: 5’-ТСС ТСТ ССА ААТ gAA ATg ААС ТТС С-3’.
Подобран для амплификации промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, например позиция N V00141.
В.2.5.5 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
В.2.6 Оборудование
В соответствии с описанием в В.1.6.
В.2.7 Процедура анализа
В.2.7.1 Проведение ПЦР
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице В.5. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице В.5.
Таблица В.5 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца |
| 5 |
Вода |
| 14,84 |
10 буфер для ПЦР (с  15 ммоль/л) | 1 | 2,5 |
Раствор dNTP, 16 ммоль/л | 0,64 ммоль/л | 1 |
Праймер 35s-cf3, 20 мкмоль/л | 0,6 мкмоль/л | 0,75 |
Праймер 35S-cr4, 20 мкмоль/л | 0,6 мкмоль/л | 0,75 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 0,8 IU | 0,16 |
Если используется буферный раствор для ПЦР без , следует соответственно довести концентрации и объемы. | ||
В.2.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава GTS 40-3-2 (материал, содержащий 0,1% компонентов генетически модифицированных растений), производимые Институтом референсных материалов и измерений (IRMM), Гиль, Бельгия (IRMM-410).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
В.2.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица В.6 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 25 с/95°С |
| 30 с/62°С |
| 45 с/72°С |
Количество циклов | 50 |
Завершающая полимеризация | 7 мин/72°С |
В.2.8 Специфичность продукта ПЦР
Рекомендуется проверить специфичность продукта ПЦР, полученного из неизвестного образца путем, например, рестрикционного анализа, секвенирования ДНК и ДНК-гибридизации.
В.2.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных образцов стандартного состава (приготовленных, например, из серии стандартов IRMM-410 производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в В.2.8.
Обнаружение фрагментов с размером 123 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК промотора 35S вируса мозаики цветной капусты в пределах установленных параметров специфичности, описанных в В.2.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
В.3 Метод скрининга для обнаружения ДНК генетически модифицированных растений (терминатор NOS Agrobacterium tumefaciens)
В.3.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения различного количества копий последовательности ДНК терминатора нопалин синтазы (NOS) из Agrobacterium tumefaciens. Так как терминатор NOS присутствует во многих генетически модифицированных растениях, этот метод может быть использован для скрининга наличия ингредиентов, полученных из генетически модифицированных растений [22], [23], [29], [30].
Не описан способ проверки специфичности продукта ПЦР. Поэтому этот метод не может рассматриваться как метод идентификации. Он может быть использован для оценки амплифицируемости ДНК, содержащей целевую последовательность.
В.3.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.3.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод прошел метрологическую аттестацию в соответствии с критериями, заданными ISO 5725-2. В совместных сличительных испытаниях, координируемых объединенным центром исследований ЕС JRC, участвовали 23 европейские лаборатории [29], [30]. Оценивали способность метода обнаруживать ГМО в различных материалах образцов переработанной пищевой продукции (готовые продукты из кукурузы, детское питание, печенья, продукты из квашеных соевых бобов), каждый из которых содержал 0%, 2% и 100% (для печенья использовали 10% вместо 100%) сои линии GTS 40-3-2 или кукурузы Event 176. Так как линия Event 176 не содержит последовательности терминатора NOS, образцы, содержащие компоненты, изготовленные из этой линии, не должны анализироваться этим методом. Однако в связи с тем, что совместные сличительные испытания были организованы для оценки метода обнаружения промотора 35S, лаборатории получили все образцы и провели их анализ. Результаты анализа готовых продуктов из кукурузы были исключены из дальнейшей статистической обработки.
Каждый участник получал 4 контрольных образца и 30 образцов неизвестного состава в независимых повторностях, из которых 10 содержали 0% ГМО, а 20 - ингредиенты с различным процентом содержания генетических модификаций. Все участники получили подробное описание метода выделения ДНК с помощью методики ЦТАБ или коммерчески доступного набора для выделения. Однако лаборатории имели право использовать их собственные методы выделения ДНК; в то же время условия ПЦР должны были быть оптимизированы индивидуально для имеющегося у участников оборудования. От лабораторий требовали провести анализ каждого образца один раз и определить, содержит ли образец ГМО или нет. Так как большинство лабораторий предоставили правильные результаты (результаты 14 лабораторий попали в диапазон от 90% до 100% от истинного значения; результаты 3 лабораторий - от 80% до 90% от истинного значения) и ни одна лаборатория не предоставила правильные результаты в диапазоне от 70% до 80%, было установлено значение нижнего предела правильных результатов, равное 80%. Вследствие этого результаты 5 лабораторий были исключены из дальнейшей статистической обработки. Так как линия Event 176 не содержит последовательности терминатора NOS, результаты анализа готовых продуктов из кукурузы должны быть отрицательными. Эти результаты имели высокий процент (100%) правильных результатов и были исключены из дальнейшей статистической обработки.
Для не содержащих ГМО образцов было определено среднее значение правильных результатов, составившее 98,2% (1,8% ложноположительных результатов); для образцов, содержащих ГМО, было определено среднее значение правильных результатов, равное 97,9% (2,1% ложноотрицательных результатов) [29]. Результаты совместных сличительных испытаний приводятся в таблице В.7.
Таблица В.7 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1999 |
Количество лабораторий | 30 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 18 |
Количество образцов на лабораторию | 12 |
Общее количество образцов | 360 |
Количество принятых результатов | 540 |
Ложноположительные результаты | 1,8% |
Ложноотрицательные результаты | 2,1% |
В.3.2.2 Молекулярная специфичность
В.3.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевой последовательности терминатора нопалин синтазы Agrobacterium tumefaciens, описанной в базе данных GenBank®, доступ N V00087.
Не исключается возможность получения ложноположительных результатов из-за того, что амплифицируемая последовательность получена из Agrobacterium tumefaciens - почвенной бактерии, распространенной в природе. Положительные результаты могут означать наличие компонента, произведенного из генетически модифицированного растения, однако интерпретация результатов не должна проводиться без дополнительного подтверждения. Следует принять в расчет возможность контаминации образца Agrobacterium или родственными микроорганизмами.
В.3.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (NCBI BlastN®, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), по состоянию на 28 сентября 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированными сельскохозяйственными растениями. Следует учесть, что обратный праймер обнаружил 100%-ное совпадение с доступом AF015682 (полимераза вируса рваных листьев риса). Оба праймера соответствовали значительному количеству позиций базы данных, относящихся к векторам клонирования и патентам, а также к нопалин синтазе.
В.3.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированных сельскохозяйственных растений, в ходе предварительных совместных сличительных исследований не наблюдали амплификации [30].
В.3.2.3 Предел обнаружения
Для этого метода не был определен абсолютный предел обнаружения, однако была показана способность обнаружения по крайней мере 50 копий ДНК сои линии GTS 40-3-2 [29].
В ходе совместных сличительных испытаний была показана возможность обнаружения 2% GTS 40-3-2 (соевые бобы RoundUp Ready®) в печенье, детском питании и квашеных соевых бобах с 96,4% правильных результатов [29].
В.3.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
В.3.4 Принцип
Принцип метода заключается в амплификации фрагмента ДНК длиной 118 п.н. из терминатора NOS с использованием ПЦР и обнаружении с помощью электрофореза в агарозном геле. Для проверки специфичности продукта ПЦР можно, например, использовать секвенирование ДНК. Однако ни одна из процедур подтверждения специфичности продукта не прошла метрологической аттестации.
В.3.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
В.3.5.1 Вода
В.3.5.3 Раствор dNTP, концентрация dNTP=4 ммоль/л (каждого).
В.3.5.4 Олигонуклеотиды
В.3.5.4.1 Прямой праймер
Терминатор NOS Agrobacterium tumefaciens, HA-nos118f: 5’-gCA TgA CgT TAT TTA TgA gAT ggg-3’.
Подобран для амплификации последовательности, описанной в доступе N V00087.
В.3.5.4.2 Обратный праймер
Терминатор NOS Agrobacterium tumefaciens, HA-nos118r: 5’-gAC ACC gCg CgC gAT AAT TTA TCC-3’.
Подобран для амплификации последовательности, описанной в доступе N V00087.
В.3.5.5 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
В.3.6 Оборудование
В соответствии с В.1.6.
В.3.7 Процедура анализа (проведение ПЦР)
В.3.7.1 Общие положения
Описанный метод рассчитан на общий объем ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице В.8. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице В.8.
Таблица В.8 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца |
| 5 |
Вода |
| 14,84 |
10 буфер для ПЦР (с 15 ммоль/л) | 1 | 2,5 |
Раствор dNTP, 16 ммоль/л | 0,64 ммоль/л | 1 |
Праймер HA-nos118f, 20 мкмоль/л | 0,6 мкмоль/л | 0,75 |
Праймер HA-nos118r, 20 мкмоль/л | 0,6 мкмоль/л | 0,75 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 0,8 IU | 0,16 |
Если используется буферный раствор для ПЦР без , следует соответственно довести концентрации и объемы. | ||
В.3.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительных контролей можно использовать сертифицированные образцы стандартного состава GTS 40-3-2 (материал, содержащий 0,1% компонентов генетически модифицированных растений), производимые Институтом референсных материалов и измерений (IRMM), Гиль, Бельгия (RMM-410).
Кроме того, следует использовать и другие соответствующие исследованию контроли согласно описанию в ISO 24276.
В.3.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица В.9 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 25 с/95°С |
| 30 с/62°С |
| 45 с/72°С |
Количество циклов | 50 |
Завершающая полимеризация | 7 мин/72°С |
В.3.8 Специфичность продукта ПЦР
Рекомендуется проверить идентичность продукта ПЦР, полученного из неизвестного образца путем, например, рестрикционного анализа, секвенирования ДНК и ДНК-гибридизации.
В.3.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из сертифицированных образцов стандартного состава (приготовленных, например, из серии стандартов IRMM-410 производства IRMM, Гиль, Бельгия).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в В.3.8.
Обнаружение фрагментов с размером 118 п.н. показывает, что раствор образца ДНК содержит амплифицируемую ДНК терминатора NOS в пределах установленных параметров специфичности, описанных в В.3.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
В.4 Метод скрининга для обнаружения ДНК генетически модифицированных растений (ген npt ll)
В.4.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения гена, кодирующего неомицин фосфотрансферазу (npt II). Так как этот ген вставлен в интегральные конструкции большинства генетически модифицированных растений, этот генетический элемент может быть использован для скрининга продуктов, в состав которых входят компоненты из ГМО.
В.4.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.4.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод был метрологически аттестован в совместном сличительном испытании на сырьевых продуктах [24], проведенном под руководством рабочей группы "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV). Количество участников, а также количество образцов устанавливали в соответствии с критериями ISO 5725-2.
Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3 (однако вес анализируемой части образца составлял 100 мг).
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице В.10.
Таблица В.10 - Результаты совместных сличительных испытаний
Образец | Томаты Zeneca |
Праймер | АРН2 short/APH2 reverse |
Год | 1998 |
Количество лабораторий | 10 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 9 |
Количество образцов на лабораторию | 5 |
Количество принятых результатов | 45 |
Количество образцов, содержащих ген неомицин фосфотрансферазы (томаты Zeneca) | 22 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
В.4.2.2 Молекулярная специфичность
В.4.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевой последовательности, описанной в базе данных GenBank®, доступ N AF269238.
Неомицин фосфотрансфераза получена из Е. coli K12 и присутствует в некоторых ГМО.
Ген npt II получен из E.coli K12 и присутствует в некоторых ГМО.
Не исключается возможность получения ложноположительных результатов из-за того, что целевая последовательность получена из Е. coli K12. Положительные результаты не должны служить доказательством наличия компонента, произведенного из генетически модифицированного растения.
В.4.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (NCBI BlastN®, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), по состоянию на 28 сентября 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированными сельскохозяйственными растениями. Праймеры обнаружили совпадение только с транспозоном Tn5, синтетическими и патентованными последовательностями.
B.4.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированных сельскохозяйственных растений и произведенных из них готовых продуктов, не наблюдали амплификации.
В.4.2.3 Предел обнаружения
Метрологическую аттестацию проводили только с образцами, содержащими 0% и 100% ГМО.
В.4.3 Адаптация
Отсутствует конкретная информация.
В.4.4 Принцип
Принцип метода заключается в амплификации фрагмента ДНК длиной 225 п.н. из последовательности гена неомицин фосфотрансферазы с использованием ПЦР и обнаружением с помощью электрофореза в агарозном геле. Для проверки специфичности продукта ПЦР можно, например, использовать рестрикционный анализ.
Неомицин фосфотрансфераза обеспечивает бактериям устойчивость к антибиотикам - неомицину/канамицину; ген добавляют в конструкции только в качестве маркера.
В.4.5 Реактивы
Информация по качеству используемых реактивов приводится в ISO 24276.
В.4.5.1 Вода
В.4.5.3 Раствор dNTP, концентрация dNTP = 2,5 ммоль/л (каждого).
В.4.5.4 Олигонуклеотиды
В.4.5.4.1 Прямой праймер
АРН2 short: 5’-СТС АСС TTg СТС CTg CCg AgA-3’.
В.4.5.4.2 Обратный праймер
АРН2 reverse: 5’-CgC СТТ gAg ССТ ggC gAA CAg-3’.
В.4.5.5 Термостабильная ДНК-полимераза (для ПЦР с "горячим стартом"), 5 IU/мкл.
В.4.5.6 Рестриктаза: Rsa I
В.4.6 Оборудование
В соответствии с описанием в В.1.6.
В.4.7 Процедура анализа (проведение ПЦР)
В.4.7.1 Общие положения
Описанный метод рассчитан на общий объем смеси ПЦР 25 мкл на реакцию; используемые реактивы перечислены в таблице В.11. ПЦР можно проводить и в больших объемах при условии соблюдения соответствующих пропорций для растворов реактивов. Доказано получение корректных результатов при использовании конечных концентраций реактивов, перечисленных в таблице В.11.
Таблица В.11 - Добавление реактивов
Реактив | Конечная концентрация | Объем на образец, мкл |
ДНК из образца |
| 5 |
Вода |
| 14,6 |
10 буфер для ПЦР (с 15 ммоль/л) | 1 | 2,5 |
Раствор dNTP, 10 ммоль/л | 0,2 ммоль/л | 0,5 |
Праймер АРН2 short, 10 мкмоль/л | 0,4 мкмоль/л | 1 |
Праймер АРН2 reverse, 10 мкмоль/л | 0,4 мкмоль/л | 1 |
ДНК-полимераза Taq, 5 IU/мкл | 2 IU | 0,4 |
В.4.7.2 Контроли ПЦР
_______________
В.4.7.3 Программа "температура - время"
_______________
Таблица В.12 - Программа "температура - время"
Активация/начальная денатурация | 10 мин/95°С |
Амплификация | 25 с/95°С |
| 30 с/60°С |
| 45 с/72°С |
Количество циклов | 35 |
Завершающая полимеризация | 7 мин/72°С |
В.4.8 Специфичность продукта ПЦР
Рекомендуется проверить идентичность продукта ПЦР, полученного из неизвестного образца путем, например, рестрикционного анализа, секвенирования ДНК и ДНК-гибридизации. Рестрикция продукта ПЦР ферментом Rsa I должна привести к образованию двух фрагментов (длиной 122 и 93 п.н. соответственно) [24].
В.4.9 Общий контроль качества и интерпретация результатов
Предполагается, что целевая последовательность обнаружена, если размер продукта ПЦР соответствует ожидаемой длине целевой последовательности ДНК, определенной путем сравнения с продуктами реакции, полученными из соответствующих референсных материалов (например, коммерческих плазмид, содержащих целевую последовательность ДНК).
Проверка специфичности продукта ПЦР описана в В.4.8.
Обнаружение фрагментов с размером 215 п.н. показывает, что раствор ДНК образца содержит амплифицируемую ДНК гена npt II в пределах установленных параметров специфичности, описанных в В.4.2.2.
Подробная информация об этапах электрофореза приводится в ISO 21571:2005, В.2.
В.5 Метод скрининга для обнаружения ДНК, выделенной из генетически модифицированных томатов (Zeneca® 282F)
Метод подробно описан в А.3.
В.6 Метод скрининга на основе ПЦР-анализа в реальном времени для обнаружения ДНК генетически модифицированных растений (терминатор NOS Agrobacterium tumefaciens, T-nos)
В.6.1 Назначение, важность и научное обоснование
Испытания на наличие последовательности Agrobacterium tumefaciens T-nos обычно проводятся при скрининге для обнаружения продуктов, в состав которых входят компоненты из генетически модифицированных организмов (ГМО), поскольку многие такие организмы, используемые в коммерческих целях, содержат данный генетический элемент. Поиск в базе данных CERA (см. [50]) дает по крайней мере 43 генетические модификации, содержащие элемент T-nos (см. [51]). Подробная техническая информация, касающаяся использования ПЦР в реальном времени для анализа T-nos качественным методом, и результаты совместных сличительных испытаний были соответствующим образом опубликованы (см. [52]). В указанном исследовании приняли участие 24 лаборатории из Германии, Австрии и Швейцарии. Исследование было спланировано и проведено согласно протоколу IUPAC (см. [48]) на материале 12 слепых образцов ДНК с целевой анализируемой последовательностью T-nos, представленной на двух различных уровнях (шестью образцами с массовой долей ДНК кукурузы NK603 0,5% и шестью с массовой долей 0,1%), а также шести слепых образцов ДНК без целевой последовательности T-nos (шести образцов ДНК генетически не модифицированных сортов кукурузы). Результаты совместных сличительных испытаний для целевой последовательности T-nos были использованы для определения доли ложноположительных и ложноотрицательных заключений. В дополнение к этому были опубликованы подтверждающие данные по специфичности и применимости соответствующих методов на практике при выполнении скрининга для обнаружения растительной продукции из генетически модифицированных сельскохозяйственных культур (см. [53]).
В.6.2 Принцип
Данный метод описывает порядок обнаружения последовательности ДНК из области терминатора гена нопалин-синтазы (T-nos) Agrobacterium tumefaciens с применением качественной ПЦР в реальном времени. T-nos используется как регулирующий элемент во многих генетически модифицированных растениях, что делает данный метод пригодным для скрининга с целью выявления растительной продукции из генетически модифицированных сельскохозяйственных культур. Он может использоваться для анализа ДНК, выделяемой из пищевых продуктов, а также из иного рода продукции (кормов, семян). Применение метода предполагает возможность извлечения из соответствующей матрицы достаточного количества амплифицируемой ДНК для ее последующего изучения.
Примечание - Последовательность ДНК T-nos из Agrobacterium tumefaciens также может быть обнаружена в образцах, содержащих ДНК этих бактерий, однако не включающих в себя каких-либо генетически модифицированных последовательностей ДНК. В этой связи исследования должны дополняться анализом на основе методов, специфичных к генетической конструкции или к трансформационным событиям, для подтверждения вероятных положительных результатов.
В.6.3 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.6.3.1 Робастность метода
_______________
В.6.3.2 Внутрилабораторные испытания
В.6.3.3 Совместные сличительные испытания
_______________
_______________
Результаты совместных сличительных испытаний для определения T-nos по методу ПЦР в реальном времени представлены в таблице В.13.
Таблица В.13 - Результаты совместных сличительных испытаний
Количество лабораторий-участниц | 24 |
Количество лабораторий после исключения выбросов | 23 |
Количество образцов из расчета на лабораторию | 18 |
Количество принятых результатов | 414  |
Количество положительных образцов T-nos | 276 |
Количество отрицательных образцов T-nos | 138 |
Ложноположительные результаты | 3  (2,2%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
Данные, представленные одной из лабораторий, были исключены из сравнения ввиду загрязнения образцов посторонней ДНК, содержащей T-nos , что повлекло за собой получение ложноположительных результатов. Три лаборатории представили ложноположительные результаты (  26,6, 38,9 и 39,6 соответственно) для одного из испытуемых образцов ДНК, не содержащего T-nos . В этих лабораториях при проведении ПЦР в реальном времени использовались такие приборы, как ABI 5700 или LightCycler 1.2. | |
_______________
В.6.3.4 Молекулярная селективность
В.6.3.4.1 Общие положения
Для обнаружения последовательности T-nos в образцах ДНК был выбран и амплифицирован при помощи специфических праймеров фрагмент длиной 84 п.н. из З’-терминального участка гена нопалин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
Ввиду того что амплифицируемая последовательность была позаимствована у Agrobacterium tumefaciens - почвенной бактерии, распространенной в естественной среде, в данной ситуации нельзя исключать получение ложноположительного результата. Соответственно, хотя положительные результаты могут указывать на присутствие продуктов из генетически модифицированных растений, их не следует интерпретировать подобным образом без соответствующего подтверждения. Необходимо учитывать вероятность загрязнения исследуемого материала Agrobacterium tumefaciens или родственными ей видами бактерий.
В.6.3.4.2 Экспериментальная часть
Образцы ДНК, выделенные из имеющихся образцов стандартного состава (см. [53]), были подвергнуты анализу и прошли проверку на наличие T-nos по методу ПЦР в реальном времени с положительным результатом для перечисленных ниже модификаций:
- рисовая мука Bt63
- плоды папайи SunUp (55-1);
- картофельная мука ЕН92-527-1 (BPS-25271-9);
В.6.3.4.3 Теоретическая часть
В.6.4 Принцип и выводы
_______________
В.6.5 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют термины и определения согласно ISO 5725-1 [40] и ISO 24276.
В.6.6 Типы и количество образцов (аналит и матрица)
Далее в качестве примера представлены данные сличительных испытаний по типам образцов и их количеству, достаточному для реализации описываемого метода.
Были использованы образцы ДНК, выделенные из соевой, кукурузной, рисовой и картофельной муки, а также из других растительных материалов (см. [53]). В ходе совместных сличительных испытаний участники получили в свое распоряжение образцы ДНК, выделенные из кукурузной муки с массовой долей NK603 (ERM BF-415) 0,1% и 0,5% соответственно, и генетически не модифицированной кукурузной муки (см. [54]). Значение концентрации ДНК было приведено к 20 нг/мкл. Конечная масса ДНК добавляемого образца из расчета на одну реакцию не превышала 200 нг.
В.6.7 Предел обнаружения и диапазон применения
_______________
В целом предел обнаружения метода при его практическом применении зависит от размера генома целевого таксона и от количества ДНК в пробе, использованной для ПЦР-анализа.
В.6.8 Расчет неопределенности измерения
Оценка воспроизводимости метода дается исходя из результатов сличительных испытаний (см. В.6.3.3).
В.6.9 Помехи
Количество, качество, а также способность к амплификации матрицы нуклеиновых кислот оказывают непосредственное влияние на получаемый аналитический результат (см. ISO 21571). Отсюда следует необходимость контроля нуклеиновых кислот, используемых для анализа, например, с применением специфичного к целевому таксону метода ПЦР.
В.6.10 Физические условия и условия окружающей среды
Для получения доступа к полной версии без ограничений вы можете выбрать подходящий тариф или активировать демо-доступ.