ГОСТ Р 52815-2007 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus.
ГОСТ Р 52815-2007
Группа Н09
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus
Food products. Methods for detection and quantity determination of coagulase-positive staphylococci and Staphylococcus aureus
___________________________________________________________
ОКС 07.100.30
ОКСТУ 9109
Дата введения 2009-01-01
Предисловие
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" (ГНУ ВНИИКОП) на основе аутентичных переводов стандартов, указанных в пункте 4
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки фруктов, овощей и грибов"
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 декабря 2007 г. N 442-ст
4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к следующим международным стандартам:
- ИСО 6888-1:1999* "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета коагулазоположительных стафилококков (Staphylococcus aureus и другие виды). Часть 1. Метод с применением агаровой среды Байрд-Паркера" (ISO 6888-1:1999 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium", MOD);
- ИСО 6888-2:1999 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета коагулазоположительных стафилококков (Staphylococcus aureus и другие виды.) Часть 2. Метод с применением агаровой среды с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном" (ISO 6888-2:1999 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 2: Technique using rabbit plasma fibrinogen agar medium", MOD);
- ИСО 6888-3:2003 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета коагулазоположительных стафилококков (Staphylococcus aureus и другие виды). Часть 3. Выявление и НВЧ метод для малых количеств" (ISO 6888-3:2003 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 3: Detection and MPN technique for low numbers", MOD) в части пищевых продуктов. При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом.
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанных международных стандартов для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2004* (подраздел 3.5).
________________
* На территории Российской Федерации в части разд.8 и приложений Ж, И, К действует ГОСТ Р 1.7-2008.
Сравнение структуры настоящего стандарта со структурой указанных международных стандартов приведено в дополнительном приложении Б.
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам Российской Федерации, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок, указанным в приложении В
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
6 ИЗДАНИЕ (апрель 2010 г.) с Поправкой (ИУС 8-2009)
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus (S. aureus) посевом: в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на (в) агаризованные селективно-диагностические среды.
Допускается использование хромогенных средств предварительного выявления количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcous aureus в масложировой продукции.
(Поправка).
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р ИСО 7218-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 450-77 Кальций хлористый технический. Технические условия
ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе
ГОСТ 24104-2001* Весы лабораторные. Общие технические требования
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.
ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов
ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 коагулазоположительные стафилококки: Грамположительные, каталазоположительные микроорганизмы, которые образуют типичные и/или атипичные колонии на или в селективно-диагностической питательной среде, дающие положительную реакцию на коагулазу или специфичную для кроличьей плазмы реакцию на агаре с кроличьей плазмой и фибриногеном при определении по методам, приведенным в настоящем стандарте.
3.2 Staphylococcus aureus (S. аureus): Коагулазоположительные стафилококки, образующие ацетоин и ферментирующие мальтозу в аэробных условиях при определении этих биохимических тестов по методам, приведенным в настоящем стандарте.
3.3 выявление коагулазоположительных стафилококков и S. aureus: Определение присутствия или отсутствия коагулазоположительных стафилококков и S. aureus в определенной массе или объеме продукта по методам, приведенным в настоящем стандарте.
4 Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus*
4.1 Метод выявления и метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus с предварительным обогащением*
Сущность методов
Метод выявления и метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом с предварительным обогащением основаны на высеве навески продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.
При пересеве на агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном выросшие типичные колонии без подтверждения по биохимическим признакам относят к коагулазоположительным стафилококкам.
4.1.1 Метод выявления коагулазоположительных стафилококков и S. aureus
4.1.1.1 Определенное количество жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции вносят в жидкую селективную питательную среду.
Перед посевом анаэробные условия в среде создают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин, наслоением агара или парафина в каждую пробирку после посева, а также с помощью альтернативной процедуры - инкубирования пробирок в емкости или инкубаторе в анаэробных условиях.
4.1.1.2 Пробирки с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков на Жиолитти-Кантони бульоне определяется по редукции теллурита калия, а на глюкозном или солевом бульоне - по помутнению среды.
4.1.1.3 Поверхность одной из агаризованных селективно-диагностических сред (Байрд-Паркер агара, молочно-солевого агара, яично-желточно-азидного агара, яично-желточно-солевого агара, агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном) инокулируют из предположительно положительных пробирок (см. 4.1.1.3) после 24 ч и все оставшиеся пробирки после 48 ч.
4.1.1.4 Чашки Петри с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.
Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по редукции теллурита калия и яично-желточной реакции (лецитиназной активности).
На агаре с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном после инкубирования присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по типичным колониям, показавшим специфичную реакцию (бычий фибриноген/кроличья плазма).
4.1.1.5 Подтверждение принадлежности типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам проводят по изучению отношения выявленных микроорганизмов к окраске по Граму, определению присутствия у них каталазы и коагулазы.
Подтверждение принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению образования ацетоина, определению ферментации в аэробных условиях мальтозы и, при необходимости, определению термостабильной нуклеазы и гемолитической активности.
4.1.2 Метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S.aureus
4.1.2.1 Навески продукта и (или) серию разведений навески продукта вносят в жидкую селективную питательную среду. Инкубирование посевов и подтверждение присутствия в них коагулазоположительных стафилококков и S. aureus проводят по 4.1.1.3-4.1.1.6.
4.2 Методы определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на (в) агаризованные селективно-диагностические среды*
Сущность методов
Методы определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на (в) агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве навески продукта и/или разведения навески продукта на (в) агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных и (или) атипичных колоний, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.
4.2.1 Проводят посев определенного количества жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции на или в агаризованную селективно-диагностическую питательную среду на две параллельные чашки Петри.
Аналогично проводят посев десятикратных разведений испытуемого продукта.
4.2.2 Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.
При посеве в или на агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном определяют только типичные колонии и без подтверждения по биохимическим признакам их относят к коагулазоположительным стафилококкам.
5 Питательные среды, растворы реактивов, эмульсии и дефибринированная кровь
Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред, растворов реактивов, эмульсий, должны быть аналитического качества.
5.1 Агаризованная среда Байрд-Паркера
5.1.1 Основа среды
5.1.1.1 Состав:
|
|
ферментативный гидролизат казеина | 10,0 г; |
дрожжевой экстракт | 1,0 г; |
мясной экстракт | 5,0 г; |
пируват натрия | 10,0 г; |
L-глицин | 12,0 г; |
хлорид лития | 5,0 г; |
агар | от 12 до 22 г*; |
вода | 1000 см . |
________________
* В зависимости от желирующей способности агара.
5.1.1.2 Приготовление
При нагревании растворяют в воде все компоненты или дегидратированную основу. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (7,2±0,2) при температуре 25 °С.
Стерилизуют среду в автоклаве при температуре (121±1) °С в течение 15 мин.
5.1.2 Раствор теллурита калия
5.1.2.1 Состав:
|
|
теллурит калия (K  TeO  )
| 1,0 г; |
вода | 100 см . |
Примечание - Необходимо предварительно убедиться, что имеющийся в наличии теллурит калия пригоден для данного испытания.
5.1.2.2 Приготовление
Полностью растворяют теллурит калия в воде при минимальном нагревании.
Твердое вещество должно легко растворяться. Если в воде присутствует белый нерастворимый осадок, то такой порошок не используют.
Стерилизуют приготовленный раствор теллурита калия путем фильтрации через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
Раствор можно хранить не более 1 мес при температуре (3±2) °С.
Если при хранении раствора образуется белый осадок, то такой раствор не используют.
5.1.3 Эмульсия яичного желтка (приблизительно 20%-ной концентрации)
Свежие куриные яйца с неповрежденной скорлупой моют щеткой с применением жидких моющих средств, ополаскивают проточной водой, дезинфицируют погружением на 30 с в 70 %-ный (объем/объем) этиловый спирт с последующим просушиванием на воздухе или, после того как раствор спирта стечет, яйца фламбируют в пламени горелки. С соблюдением правил асептики разбивают скорлупу яйца и отделяют желток от белка, поочередно перенося желток из одной половинки скорлупы в другую. Желтки помещают в стерильную колбу и добавляют 4-кратное количество (по объему) стерильной воды. Смесь тщательно перемешивают, выдерживают на водяной бане при температуре (47±1) °С в течение 2 ч, а затем оставляют на 18-24 ч при температуре (3±2) °С для образования осадка.
Для использования собирают в асептических условиях в стерильную колбу надосадочную жидкость. Приготовленную эмульсию можно хранить при температуре (3±2) °С не более 72 ч.
Допускается использование готовой эмульсии промышленного производства, в этом случае эмульсию применяют в соответствии с инструкцией изготовителя.
Допускается проводить приготовление желточной эмульсии по ГОСТ 10444.1.
5.1.4 Раствор сульфаметазина (сульфамезатина, cульфадимидина)
Раствор используют только в случае подозрения присутствия в испытуемом продукте бактерий рода Proteus или при испытании сильно обсемененных продуктов, например, из сырого мяса.
5.1.4.1 Состав:
|
|
сульфаметазин | 0,2 г; |
раствор гидроксида натрия,  (NaOH)=0,1 моль/л | 10 см ; |
вода | 90 см . |
5.1.4.2 Приготовление
5.1.5 Готовая питательная среда
5.1.5.1 Состав:
|
|
основа среды (см. 5.1.1) | 100 см ; |
раствор теллурита калия (см. 5.1.2) | 1,0 см ; |
эмульсия яичного желтка (см. 5.1.3) | 5,0 см ; |
раствор сульфаметазина (см. 5.1.4) (если необходимо) | 2,5 см . |
5.1.5.2 Приготовление
Расплавляют основу, затем охлаждают до температуры примерно 47 °С на водяной бане. В асептических условиях добавляют два других раствора и, если необходимо, раствор сульфаметазина (см. 5.1.4). Предварительно каждый раствор подогревают на водяной бане при 47 °С, тщательно перемешивая среду после каждого прибавления раствора.
5.1.6 Приготовление чашек Петри с агаризованной средой Байрд-Паркера
Разливают соответствующее количество готовой среды (см. 5.1.5) в стерильные чашки Петри, чтобы получить агаровый слой толщиной примерно 4 мм, и дают застыть. Приготовленные чашки можно хранить до использования 24 ч при температуре (3±2) °С.
Перед применением среду в чашках подсушивают в сушильном шкафу при температуре от 25 °С до 50 °С до тех пор, пока с поверхности среды не исчезнут капельки влаги. Предпочтительней подсушивать среду при снятых крышках и поверхностью среды вниз.
5.2 Бульон на основе вытяжки из сердца и мозга
5.2.1 Состав:
|
|
продукт ферментативного гидролиза животных тканей | 10,0 г; |
дегидратированная вытяжка мозга теленка | 12,5 г; |
дегидратированная вытяжка сердца теленка | 5,0 г; |
глюкоза | 2,0 г; |
хлорид натрия | 5,0 г; |
двузамещенный фосфорнокислый натрий, безводный (Na HPO  ) | 2,5 г; |
вода | 1000 см . |
5.2.2 Приготовление
При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде.
Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °С (7,4±0,2).
5.3 Плазма крови кролика
Если в качестве антикоагулянта плазмы использовались цитраты калия или натрия, то к плазме добавляют раствор ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) до концентрации ЭДТА в плазме 0,1%. В плазму, содержащую оксалат или гепарин ЭДТА, не добавляется.
Если используется готовая обезвоженная плазма, то восстановление и использование такой плазмы проводят в соответствии с прилагаемой к ней инструкцией. Плазма готовится непосредственно перед применением.
Качество плазмы тестируется с помощью коагулазоположительных и коагулазоотрицательных штаммов стафилококков.
5.3.2 Раствор лимоннокислого натрия
5.3.2.1 Состав:
|
|
лимоннокислый натрий | 5,0 г; |
вода | 100 см . |
5.3.2.2 Приготовление
Лимоннокислый натрий помещают в колбу, растворяют в воде. Раствор доводят до метки, разливают по колбам или пробиркам и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.
5.4 Агаризованная среда с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном
Следует учитывать опыт использования готовых партий добавок. Рекомендуется каждую партию раствора бычий фибриноген/кроличья плазма подвергать тестированию путем постановки положительного и отрицательного контроля.
5.4.1 Основа среды
5.4.2 Раствор бычьего фибриногена
5.4.2.1 Состав:
|
|
бычий фибриноген | 5-7 г*; |
________________
* Зависит от чистоты бычьего фибриногена.
|
|
стерильная вода
| 100 см . |
5.4.2.2 Приготовление
С соблюдением правил асептики растворяют бычий фибриноген в воде непосредственно перед использованием.
5.4.3 Кроличья плазма и трипсин ингибирующий раствор
5.4.3.1 Состав:
|
|
кроличья плазма с ЭДТА для коагулазы (ЭДТА коагулазная плазма) | 30 см ; |
трипсин ингибитор | 30 мг. |
5.4.3.2 Приготовление
Раствор готовят с соблюдением правил асептики, растворяют компоненты в воде непосредственно перед использованием.
Если используют готовый раствор бычий фибриноген/кроличья плазма, то необходимо соблюдать инструкцию по приготовлению данного раствора и готовой среды. Особенно надо обращать внимание на температуру основы среды. При несоблюдении температуры среда может потерять свою активность.
5.4.4 Готовая среда
5.4.4.1 Состав:
|
|
основа среды (см. 5.4.1) | 90 см ; |
раствор теллурита калия (см. 5.1.2) | 0,25 см ; |
раствор фибриногена (см. 5.4.2) | 7,5 см ; |
кроличья плазма и трипсин ингибирующий раствор (см. 5.4.3) | 2,5 см . |
5.4.4.2 Приготовление
Расплавляют основу среды, охлаждают в водяной бане до температуры (47±1) °С. С соблюдением правил асептики прибавляют три раствора, предварительно подогретых до (47±1) °С в водяной бане. Тщательно перемешивают среду вращением после каждого прибавления, минимизируя вспенивание.
Используют готовую среду непосредственно после приготовления, тем самым избегая преципитации плазмы.
5.5 Модифицированный Жиолитти-Кантони бульон
5.5.1 Основа среды
5.5.1.1 Состав модифицированного Жиолитти-Кантони бульона приведен в таблице 1.
Таблица 1
|
|
|
Наименование компонента | Среда двойной концентрации | Среда нормальной концентрации |
Ферментативный гидролизат казеина | 20,0 г | 10,0 г |
Мясной экстракт | 10,0 г | 5,0 г |
Дрожжевой экстракт | 10,0 г | 5,0 г |
Хлористый литий | 10,0 г | 5,0 г |
Маннит | 40,0 г | 20,0 г |
Хлористый натрий | 10,0 г | 5,0 г |
Глицин | 2,4 г | 1,2 г |
Пируват натрия | 6,0 г | 3,0 г |
Полиоксиэтилен сорбитан моноолеат (твин-80) | 2,0 г | 1,0 г |
Вода | 1000 см | 1000 см |
Для получения доступа к полной версии без ограничений вы можете выбрать подходящий тариф или активировать демо-доступ.