ГОСТ 34105-2017 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Серологические методы.
ГОСТ 34105-2017
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
Животные
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
Серологические методы
Animals. Laboratory diagnostics of brucellosis. Serological methods
МКС 11.220
Дата введения 2018-07-01
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2017 г. N 99-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения | AM | Минэкономики Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Казахстан | KZ | Госстандарт Республики Казахстан |
Киргизия | KG | Кыргызстандарт |
Россия | RU | Росстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 июня 2017 г. N 582-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34105-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.
5 ВЗАМЕН ГОСТ 25385-91 в части серологических методов диагностики
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза:
- реакция агглютинации с S- и R-бруцеллезными антигенами;
- пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба);
- реакция связывания комплемента;
- реакция длительного связывания комплемента на холоде;
- реакция непрямой гемагглютинации;
- реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном;
- реакция иммунодиффузии в геле агара с R-бруцеллезным антигеном;
- кольцевая реакция с молоком;
- иммуноферментный анализ;
- иммунохроматографический анализ.
Примечание - Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.0.004-2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2651-78 Натрия бихромат технический. Технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ ISO 7218-2015 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16445-2012 Сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента. Технические условия
ГОСТ 16446-2012 Комплемент сухой для реакции связывания комплемента. Технические условия
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия
ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия
ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия
ГОСТ 25134-2013 Бруцеллин ВИЭВ. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования
ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные
ГОСТ 33675-2015 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины, определения и сокращения
3.1 В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями по ГОСТ 33675.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:
- РА - реакция агглютинации;
- РСК - реакция связывания комплемента;
- РБП - пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном;
- РДСК - реакция длительного связывания комплемента;
- РИД - реакция иммунодиффузии;
- ЛПС - липополисахаридный антиген;
- О-ПС - олигополисахаридный антиген;
- РНГА - реакция непрямой гемагглютинации;
- КР с молоком - кольцевая реакция с молоком;
- ИФА - иммуноферментный анализ;
- ИХА - иммунохроматографический анализ;
- PKг-G - раствор конъюгата, конъюгированного с пероксидазой;
- ФСБ-Т - фосфатно-солевой буферный раствор с твином;
- РБР-С - разводящий буферный раствор для сывороток;
- ТМБ-субстрат - тетраметилбензидин-субстрат;
- К+ - инактивированная сыворотка крови животных, содержащая специфические антитела класса G к бактериям рода Brucella (положительный контрольный образец);
- К- - инактивированная сыворотка крови животных, не содержащая специфических антител к бактериям рода Brucella (отрицательный контрольный образец).
4 Условия выполнения исследований и требования безопасности
4.1 Условия выполнения исследований
4.1.1 Общие требования к помещениям - по ГОСТ ISO 7218.
4.1.2 Требования к персоналу - по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ИСО/МЭК 17025.
4.1.3 К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами II группы патогенности*, изучившие методики микробиологических работ. В зонах неблагополучных по бруцеллезу сотрудники должны быть вакцинированы против бруцеллеза.
________________
* Группу патогенности устанавливают в соответствии с нормативными правовыми актами, действующими на территории государства, принявшего стандарт.
4.2 Требования безопасности
4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ с микроорганизмами - согласно ГОСТ 12.1.008.
4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.
4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005.
4.2.4 Обучение персонала безопасности труда - в соответствии с ГОСТ 12.0.004.
4.2.5 Обеззараживание материала после исследований, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 1 ч при давлении 2 атм (0,2) МПа и температуре (132±2)°С.
5 Средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животные
При проведении исследований используют следующие средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животных:
- pH-метр с точностью калибровки ±0,1 ед.pH при температуре от 20°С до 55°С;
- спектрофотометр с диапазоном длины волны от 198 до 1000 нм, разрешением 1 нм и точностью ±2 нм;
- колбы мерные по ГОСТ 1770 исполнения 2 различной вместимости 1-го класса точности;
- центрифуга лабораторная со скоростью вращения ротора 2000-3000 об/мин;
- автоклав лабораторный;
- термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20°С до 50°С;
- баня водяная с терморегулятором с температурой нагрева до 100°С;
- холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0°С до 10°С по ГОСТ 16317;
- насос вакуумный;
- иглы препаровальные;
- штамп для формирования лунок в агаре;
- осветитель настольный с пределом поворота фонаря вокруг горизонтальной и вертикальной осей 0-360 и источником света - лампой В/Ватт-8/20;
- чашки биологические (Петри) с крышками ЧБН 2 по ГОСТ 25336;
- чашка и ступка фарфоровые по ГОСТ 9147;
- комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез, в который входят:
1) шприц-полуавтомат (капельница) для дозирования сыворотки;
2) пипетка-капельница для дозирования антигена;
3) ручной смеситель на 25 лунок диагностической пластины;
4) аппарат для автоматического покачивания диагностических пластин;
- пластины с лунками 72-гнездные полистироловые (планшеты);
- штативы 100-гнездные для пробирок Флоринского;
- групповые дозаторы Флоринского;
- пробирки серологические Флоринского;
- дозаторы одноканальные пипеточные переменного объема;
- фильтры бумажные из бумаги фильтровальной по ГОСТ 12026;
- бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;
- салфетки марлевые;
- спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;
- вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
- кислота соляная по ГОСТ 3118 х.ч;
- фенол по ГОСТ 23519 - 5%-ный раствор;
- формалин по ГОСТ 1625 - 1%-ный и 10%-ный растворы;
- натрий хлористый по ГОСТ 4233;
- кислота борная по ГОСТ 18704 - 3%-ный раствор;
- натрия бихромат по ГОСТ 2651;
- калий двухромовокислый по ГОСТ 4220;
- кислота серная по ГОСТ 4204;
- натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
- сыворотка гемолитическая по ГОСТ 16445;
- комплемент сухой для РСК по ГОСТ 16446;
- кровь барана-донора;
- свинки морские массой 300-400 г;
- сыворотки крови животных;
- набор для ИФА, содержащий в своем составе:
1) планшет полистироловый 96-луночный с адсорбированной в лунках планшета смесью специфических антигенов Brucella;
7) флакон N 6 - ТМБ-субстрат;
- тест-система для определения антител к ЛПС антигену В.abortus и В.melitensis в сыворотке крови крупного рогатого скота и овец методом ИФА, содержащая в своем составе компоненты:
- негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных);
- антиген бруцеллезный для РА и РСК (РДСК);
- роз бенгал антиген для РБП;
- антиген бруцеллезный для КР с молоком;
- 0,85%-ный раствор хлористого натрия;
- 0,85%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;
- 5%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;
- 10%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;
- раствор хлорамина 5%-ный;
- взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;
- молоко от здоровой коровы (буйволицы);
- набор для РИД, содержащий в своем составе:
1) О-ПС бруцеллезный антиген;
2) натрий хлористый по ГОСТ 4233;
3) микробиологический агар-агар по ГОСТ 17206;
- набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота, содержащий в своем составе:
1) антиген бруцеллезный эритроцитарный для РНГА;
2) взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;
3) сыворотку бруцеллезную;
4) сыворотку негативную.
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов, дезинфицирующих средств и материалов по качеству не ниже указанных. Допускается использование посуды одноразового применения.
6 Отбор проб
6.1 Забор крови у животных для получения сыворотки проводят:
- из яремной, ушной или хвостовой вены у свиней;
- головной вены, вены предплечья или латеральной подколенной вены голени у собак;
- из бедренной вены у лисиц и песцов;
- путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста у норок.
6.1.1 Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30°С-38°С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8-10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4°С-10°С. Через 20-24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3-4 ч и повторно через 10-12 ч).
6.1.2 Консервирование сывороток проводят:
- сухой борной кислотой (3-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;
- путем однократного замораживания.
Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 2°С до 8°С.
Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут, замороженные сыворотки - в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки к исследованию на бруцеллез не пригодны.
6.2.2 При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.
6.2.3 Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.
6.3 На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ.
7 Методы серологической диагностики бруцеллеза
7.1 Сущность методов заключается в выявлении в сыворотке крови животных специфических антител к бруцеллезным антигенам.
7.2 Пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (РБП)
7.2.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови животных, основанном на способности антител сыворотки агглютинировать бруцеллезный антиген, результатом чего является формирование выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде крупных или мелких хлопьев розового цвета.
7.2.2 Подготовка к исследованию
7.2.2.1 Приготовление 5%-ного раствора хлорамина
Примечание - Могут применяться другие растворы дезинфицирующих средств, эффективные в отношении бактерий рода Brucella, которые готовят в соответствии с инструкциями к ним.
7.2.2.2 Для массовых диагностических исследований используют комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез в соответствии с разделом 5.
Перед постановкой реакции роз бенгал антиген и исследуемые сыворотки выдерживают 30-40 мин при комнатной температуре и встряхивают для получения однородной смеси.
Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных диагностических пластинах с лунками при температуре не ниже 18°С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки.
7.2.3 Проведение исследования
7.2.3.1 РБП применяют как экспресс-метод диагностики бруцеллеза у не иммунизированного противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота, овец, коз, верблюдов, лошадей, северных оленей (маралов), свиней и собак.
Для исследования применяют тест-системы, используемые для диагностики бруцеллеза животных в РБП.
Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи аппарата, предназначенного для этой цели. При положительной реакции в течение 4 мин появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.
По окончании работы диагностические пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 5%-ный раствор хлорамина либо другого дезинфицирующего средства в концентрации и экспозиции, определенной для возбудителя данного вида, затем обрабатывают любым моющим средством, промывают водопроводной, затем дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в термостате при температуре 37°С-38°С и используют повторно.
7.2.4 Обработка результатов
Учет результатов реакции проводят визуально в течение 4 мин после смешивания сывороток с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.
Реакцию считают положительной при наличии агглютината в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.
Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенная и равномерно окрашенная).
При не четко выраженной агглютинации проводят повторное исследование сыворотки и по его результатам дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).
При получении отрицательных результатов РБП по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.
Сыворотки крови животных стада (фермы, населенного пункта), положительно реагирующие в РБП, исследуют на бруцеллез в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА, или в ИХА.
7.3 Кольцевая реакция (КР) с молоком
Сущность метода состоит в выявлении антигеном специфических антител в молоке больных бруцеллезом или иммунизированных агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами коров. Положительная реакция проявляется в образовании синего кольца в верхнем слое сливок.
КР с молоком применяют с целью определения благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота (буйволов) и для проверки молока при продаже его на рынках.
Исследование молока на бруцеллез в КР можно проводить в лабораториях или непосредственно в хозяйствах.
7.3.1 Подготовка к исследованию
Для постановки КР с молоком применяют тест-системы или наборы для диагностики бруцеллеза в кольцевой реакции (КР), используемые на территории государств, принявших стандарт, в состав которых входят антиген бруцеллезный для КР с молоком и сыворотка бруцеллезная. Реакцию ставят в серологических пробирках Флоринского, которые нумеруют в соответствии с описью проб молока, пробы которого отбирают по 6.1.
7.3.2 Проведение исследования
При исследовании каждой партии молока ставят контрольные пробы:
- молоко от заведомо здоровой коровы (буйволицы);
Штативы с исследуемыми контрольными пробами молока выдерживают на водяной бане при температуре 37°С-38°С в течение 1 ч или в термостате в течение 2 ч.
Результаты реакции учитывают визуально через 30-40 мин после извлечения штативов из водяной бани (термостата) и оценивают в крестах по следующей схеме:
"+++" (три креста) - четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;
"++" (два креста) - четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый цвет;
"+" (один крест) - синее кольцо в слое сливок выражено слабо, и весь столбик молока имеет синий цвет;
"-" (минус) - столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после смешивания с антигеном, а слой сливок - белого или слегка желтоватого цвета.
7.3.3 Обработка результатов
Все пробы молока с оценкой в "+++" (три креста) и "++" (два креста) считают положительными, "+" (один крест) - сомнительными.
При получении отрицательных результатов КР по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.
Сыворотку крови животных стада (группы, населенного пункта), в котором выявлены особи, сомнительно или положительно реагирующие в КР, исследуют на бруцеллез в РБП, или в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА. При этом проводят клинический осмотр животных и исключают их заболевание маститами.
7.4 Реакция агглютинации (РА) в пробирках
7.4.1 РА в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.
7.4.2 Приготовление фенолизированных растворов хлористого натрия с содержанием фенола 0,5%
7.4.3 Проведение исследования
7.4.3.1 При исследовании в РА сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок и антиген разводят фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; овец и коз - фенолизированным 5%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; оленей (маралов) - фенолизированным 10%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2.
- для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов - в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
- для овец, коз, оленей (маралов) и собак - в разведениях 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;
- для собак с R-бруцеллезным антигеном (B.canis) - в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
- для пушных зверей и морских свинок - в разведениях 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
Исследование каждой сыворотки проводят в пяти пробирках.
7.4.3.3 Получение исходного разведения проб сыворотки:
В пробирки второго ряда раствор хлористого натрия не вносят.
После внесения антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается.
В пробирки первого ряда антиген не вносят, они служат контролем сыворотки на самоагглютинацию. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.
После добавления к исследуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками интенсивно встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при температуре 37°С-38°С на 16-20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.
При получении положительных или сомнительных результатов РА при массовом исследовании эти сыворотки исследуют в четырех разведениях.
Массовые исследования пушных зверей и морских свинок не проводят.
7.4.4 Обработка результатов
Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:
"++++" (четыре креста) - полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде "зонтика", при легком встряхивании "зонтик" разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);
"+++" (три креста) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный "зонтик" агглютината (75% агглютинации);
"++" (два креста) - неполное просветление жидкости, "зонтик" агглютината умеренно выражен (50% агглютинации);
"+" (один крест) - едва заметное просветление жидкости, "зонтик" агглютината выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);
"-" (минус) - просветления жидкости и образования "зонтика" агглютината не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.
Для более объективной оценки результатов РА готовят образцы сравнения мутности, соответствующие 75%, 50%, 25% и 0% просветления жидкости.
При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на два креста ("++") в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.
Результаты исследования исследуемой и контрольных сывороток, серию антигена, срок его годности записывают в журнал серологических исследований.
7.5 Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)
7.5.1 РСК применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.
Сущность реакции состоит в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело.
7.5.2 РДСК применяют вместо РСК, в том числе для исследования сывороток, обладающих антикомплементарными свойствами.
Сущность реакции состоит в образовании иммунного комплекса антиген - антитело в присутствии комплемента на холоде в течение нескольких часов.
7.5.3 Подготовка к исследованию
7.5.3.1 Приготовление 0,85%-ного раствора хлористого натрия
7.5.3.2 Приготовление 5%-ного раствора натрия гидроокиси
7.5.3.3 Образцы сыворотки крови и компоненты РСК и РДСК разводят 0,85%-ным раствором хлористого натрия по 7.5.3.1. Сухой комплемент регидратируют и титруют по ГОСТ 16446.
Берут такое количество флаконов (ампул), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта количество комплемента. В каждый флакон (ампулу) вносят 0,85%-ный раствор хлористого натрия в объеме, указанном на этикетке, и, не встряхивая, помещают в холодильник на 20-30 мин. Растворившийся комплемент осторожно перемешивают путем легкого встряхивания флаконов (ампул), сливают в одну пробирку, смешивают и помещают в холодильник при температуре от 4°С до 10°С. Непосредственно перед внесением в пробирки для титрования регидратированный комплемент разводят 0,85%-ным раствором хлористого натрия в соотношении 1:20, а остальной - хранят в холодильнике. Рабочее разведение комплемента также готовят непосредственно перед внесением в пробирки при постановке реакции. Рабочий титр комплемента должен быть на два интервала больше его титра.
В - количество пробирок в опыте, шт;
20 - исходное разведение комплемента (1:20).
Пример - |  |
Гемолитическую сыворотку титруют по ГОСТ 16445 при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности.
Рабочий титр гемолитической сыворотки для РСК и РДСК составляет удвоенную дозу от титра. Так, если титр сыворотки равен 1:1500, то рабочий титр в РСК и РДСК будет 1:750.
Гемолитическую систему готовят перед каждой постановкой РСК. Для этого 2,5%-ную взвесь отмытых эритроцитов и раствор гемолитической сыворотки в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37°С-38°С в течение 15-35 мин (в зависимости от объема и толщины стенок сосуда) при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК - в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолитической сыворотки вносят во взвесь эритроцитов.
Исследуемые и контрольные (бруцеллезная и негативная) сыворотки крови крупного рогатого скота в исходном разведении 1:5 инактивируют в день постановки реакции в водяной бане: для РСК - при 60°С-62°С в течение 30 мин (сыворотки крови ослов и мулов - 64°С-65°С, буйволов - 62°С-64°С, свиней - 58°С-60°С); для РДСК - сыворотки крови животных всех видов - при 63°С-64°С в течение 30 мин.
Рабочие разведения всех компонентов для РСК (РДСК) готовят перед постановкой реакции и проверяют их на антикомплементарные и гемотоксические свойства по следующей схеме, представленной в таблице 1.
Таблица 1 - Проверка антикомплементарных и гемотоксических свойств компонентов реакций
Наименование и объем компонентов реакции, см | Антиком- племен- тарность | Гемотоксичность
| |||
|
| компле- мента | гемоли- тической сыворотки | антигена | 0,85%-ный раствор хлористого натрия |
Комплемент в разведении 1:20 | 0,2 | 0,2 | - | - | - |
Гемолитическая сыворотка в рабочем разведении | 0,2 | - | 0,2 | - | - |
Антиген в рабочем разведении | 0,4 | - | - | 0,4 | - |
Эритроциты, 2,5%-ная взвесь | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
0,85%-ный раствор хлористого натрия | - | 0,6 | 0,6 | 0,4 | 0,8 |
Водяная баня 10 мин при 37°С-38°С | |||||
Результат | Гемолиз | Полная задержка гемолиза эритроцитов | |||
В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.
7.5.4 Проведение исследования в РСК
При массовом исследовании постановку реакции проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном, при постановке в трех пробирках исследуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сывороток), (таблица 2).
Необходимые разведения сывороток готовят следующим образом:
Инактивирование разведенных сывороток проводят в порядке, указанном в 7.5.3.3.
Сыворотку, 0,85%-ный раствор хлористого натрия и другие компоненты реакции вносят при помощи индивидуальных пипеток, (дозаторов), групповых дозаторов Флоринского или одноканальных пипеточных дозаторов с наконечником.
Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.
Таблица 2
Компоненты реакции | При массовом исследовании | При исследовании в двух разведениях | ||
| пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение) | пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение) | ||
| 1 (1:5) | 1 (1:5) | 2 (1:5) | 3 (1:10) |
Исследуемая сыворотка, см | 0,05 | 0,1 | 0,2 | 0,1 |
0,85%-ный раствор хлористого натрия, см | 0,2 | 0,4 | - | 0,1 |
Водяная баня 30 мин при 58°С-65°С | ||||
0,85%-ный раствор хлористого натрия, см | - | 0,2 | - | - |
Антиген в рабочем разведении, см | 0,2 | - | 0,2 | 0,2 |
Комплемент в рабочем разведении, см | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С | ||||
Гемолитическая система, см | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 |
Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С | ||||
Примечание - Допускается смешивание равных объемов рабочих разведений антигена и комплемента непосредственно перед внесением в пробирки. | ||||
При постановке реакции ставят следующие контроли:
- негативной и бруцеллезной сывороток в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме реакции);
7.5.5 Реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)
7.5.5.1 Подготовка к исследованию
Сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном. Инактивирование разведенных сывороток крови и приготовление гемолитической системы проводят по 7.5.3.3.
Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:20 при титре 0,06-0,1 или в разведении 1:20-1:15 при титре 0,1-0,14.
Одновременно определяют титр гемолитической системы с использованием свежей или консервированной сыворотки по схеме, приведенной в таблице 3.
Учет результатов титрования проводят немедленно после выемки штатива из водяной бани.
Таблица 3
Компоненты реакции | Ряды пробирок в штативе | Номера пробирок
| |||||||||
|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
Сыворотка в разведении 1:5, см | первый | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| второй | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
Водяная баня 30 мин при 63°С-64°С | |||||||||||
0,85%-ный раствор хлористого натрия, см | первый | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| второй | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
Антиген в рабочем разведении, см | первый | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| второй | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
Комплемент в рабочем разведении, см | первый | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| второй | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
Холодильник 16-18 ч при 2°С-6°С | |||||||||||
Гемолитическая система, см | первый | 0,1 | 0,2 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,6 | 0,7 | 0,8 | 0,9 | 1,0 |
| второй | 0,1 | 0,2 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,6 | 0,7 | 0,8 | 0,9 | 1,0 |
Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С | |||||||||||
Примерный результат | первый | ПГ | ПГ | ПГ | ПГ | ПГ | ПГ | ПГ | ЗГ | НГ | НГ |
| второй | ПГ | ПГ | ПГ | ПГ | ПГ | ПГ | ПГ | ЗГ | ЗГ | НГ |
7.5.5.2 Проведение исследования
Внесение компонентов и последовательность постановки реакции проводят по схеме, приведенной в таблице 4.
Таблица 4
Компонентыреакции | При массовом исследовании | При исследовании в трех пробирках | ||
| пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение) | пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение) | ||
| 1 (1:5) | 1 (1:5) | 2 (1:5) | 3 (1:10) |
Исследуемые сыворотки | 0,05 | 0,1 | 0,2 | 0,1 |
0,85%-ный раствор хлористого натрия | 0,2 | 0,4 | - | 0,1 |
Водяная баня 30 мин при 63°С-64°С | ||||
0,85%-ный раствор хлористого натрия | - | 0,2 | - | - |
Антиген в рабочем раведении | 0,2 | - | 0,2 | 0,2 |
Комплемент в рабочем разведении | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
Холодильник 2-6°С 16-18 ч и 20 мин при комнатной температуре | ||||
Гемолитическая система в рабочей дозе | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 |
Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С | ||||
При постановке реакции ставят контроли:
- негативная и бруцеллезная сыворотки в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена;
7.5.6 Обработка результатов РСК и РДСК
Реакцию связывания комплемента и реакцию длительного связывания комплемента учитывают визуально. При постановке реакции в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один раз - сразу после извлечения штативов из водяной бани. При исследовании в трех пробирках - через 3-4 ч, когда в контрольных пробах с бруцеллезной сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (в этом случае штативы с пробирками оставляют в холодильнике).
Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:
"++++" (четыре креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная, осадок 100% эритроцитов на дне пробирки;
"+++" (три креста) - гемолиз 25% эритроцитов, осадок 75% эритроцитов;
"++" (два креста) - гемолиз 50% эритроцитов, осадок 50% эритроцитов;
"+" (один крест) - гемолиз 75% эритроцитов, осадок 25% эритроцитов;
"-" (минус) - гемолиз 100% эритроцитов, осадок эритроцитов отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.
Степень гемолиза эритроцитов при необходимости определяют по шкале, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из штатива выбирают пять пробирок с полным гемолизом, сливают их содержимое в одну и разводят по схеме, представленной в таблице 5.
Таблица 5
Наименование компонентов | Номера пробирок | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
Гемолизированная жидкость, см | 1,0 | 0,75 | 0,5 | 0,25 | - |
0,85%-ный раствор хлористого натрия, см | - | 0,25 | 0,5 | 0,75 | 1,0 |
Гемолиз, % | 100 | 75 | 50 | 25 | - |
Оценка в крестах | "-" | "+" | "++" | "+++" | "++++" |
Процент гемолиза эритроцитов в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со шкалой.
Реакцию считают:
- положительной - при задержке гемолиза на два-четыре креста в одном или в двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);
- сомнительной - при задержке гемолиза с оценкой в один крест в одном или двух разведениях сыворотки и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);
- отрицательной - при полном гемолизе эритроцитов в двух или трех пробирках.
7.6 Реакция иммунодиффузии (РИД) с О-полисахаридным антигеном (О-ПС)
7.6.1 Сущность метода состоит в выявлении бруцеллезных антител, основанном на способности антител и антигена диффундировать в агаровом геле и при взаимодействии образовывать комплекс антиген-антитело, наблюдаемый в виде линии преципитации.
7.6.2 Приготовление 0,8%-ного агар-агара и подготовка чашек Петри
При помощи штампа в геле агара делают отверстия (лунки). В каждой чашке прорезают не менее шести семилуночных розеток, каждая из которых состоит из семи лунок: одна лунка в центре диаметром 3 мм, остальные шесть лунок диаметром 5 мм по окружности, расстояние между центральной и периферическими лунками - 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенной с вакуумным или водоструйным насосом (или любым другим способом).
7.6.3 Проведение исследования
7.6.3.1 В РИД с О-ПС антигеном исследуют на бруцеллез сыворотку крови крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей с целью дифференциации животных, инфицированных от вакцинированных; для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе иерсиниями.
Для исследования используют сыворотки крови животных неконсервированные и консервированные. Не консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 4°С до 8°С. Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут; замороженные сыворотки - в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.
На каждой чашке Петри ставят контроль с положительной бруцеллезной сывороткой (преципитирующей).
После внесения компонентов чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру (эксикатор) и выдерживают при температуре от 18°С до 26°С.
7.6.4 Обработка результатов
7.6.4.1 Учет результатов проводят визуально в косом проходящем свете с помощью осветителя через 24 и 48 ч после постановки реакции.
Линии преципитации между лунками с антигеном и исследуемой сывороткой, сформировавшиеся через 24 ч, свидетельствует о положительной реакции.
Сыворотки крови, давшие линию преципитации через 48 ч, подлежат повторному исследованию.
Линии преципитации, сформировавшиеся через 24 или 48 ч при повторном исследовании, свидетельствуют о положительной реакции.
При получении положительного результата в реакции иммунодиффузии, животное признают больным бруцеллезом.
7.6.4.2 Применение РИД с О-ПС антигеном при диагностике бруцеллеза
а) крупного рогатого скота в случаях:
1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых не применяли вакцины против бруцеллеза, исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);
2) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:
- для контроля эпизоотического состояния по бруцеллезу животных не ранее чем через 1,5 мес после вакцинации;
- для дифференциации положительных реакций, полученных в РА (не выше 200 ME) или (и) РСК (РДСК) не выше чем в разведении 1:10 по истечении 6 мес после введения вакцины;
3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:
- через 1,5 мес и далее один раз в месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;
- через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;
б) северных оленей в случаях:
1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых противобруцеллезные вакцины не применяют. Исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);
2) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, где животных иммунизируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:
- для контроля эпизоотического состояния по бруцеллезу животных не ранее чем через 1,5 мес после вакцинации;
3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:
- через 1,5 мес и далее один раз в месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;
- через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;
в) овец и коз в случаях:
1) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где противобруцеллезные вакцины не применяют:
- при исследовании сыворотки крови животных, сомнительно и положительно реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);
2) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация животных противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами:
- для дифференциальной диагностики бруцеллеза овец и коз не ранее чем через 5 мес, только после однократной их иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;
- для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями;
3) в неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах:
- с целью более раннего выявления больных бруцеллезом животных не ранее чем через 5 мес, только после однократной иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;
- при снятии ограничений с неблагополучных по бруцеллезу хозяйств одновременно с РБП или РА, РСК (РДСК).
7.7 Реакция иммунодиффузии (РИД) с R-бруцеллезным антигеном при диагностике бруцеллеза собак, вызываемым B.canis
7.7.1 Подготовка к исследованию
7.7.1.1 Приготовление 0,85%-ного раствора хлористого натрия
7.7.1.2 Приготовление 0,8%-ного геля агара по 7.6.2
7.7.1.3 Пробы сыворотки крови от собак исследуют в РИД в свежем или консервированном виде.
7.7.2 Проведение исследования
Для постановки реакции иммунодиффузии используют биологические чашки Петри разного диаметра. Для исследования до четырех проб - диаметром 40 мм, для исследования 6-40 проб - диаметром 90 мм.
В каждой чашке ставят контроль антигена с негативной и R-бруцеллезной сывороткой для РИД.
Внутрь крышки каждой чашки вкладывают фильтровальной бумагу, вырезанную по размеру ее наружного диаметра, которую увлажняют фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия. Чашку плотно прикрывают крышкой и оставляют при температуре от 18°С до 26°С.
7.7.3 Обработка результатов - по 7.6.4.
7.8 Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)
7.8.1 Сущность метода
Метод основан на выявлении бруцеллезным эритроцитарным антигеном специфических антител в сыворотке крови больных бруцеллезом животных или иммунизированных вакцинами против бруцеллеза животных.
7.8.2 Подготовка к исследованию
7.8.2.1 Приготовление 1%-ного раствора хлорамина
7.8.2.2 Приготовление хромовой смеси
7.8.2.3 Подготовка планшетов
Планшеты подготавливают к работе следующим образом: новые, погружают на 20-30 мин в теплый раствор с моющим средством и каждую лунку моют в этом растворе вращательным движением ватной или ватно-марлевой пробки. Ершом не пользуются, во избежание повреждения поверхности лунки. Затем планшеты не менее 6 раз промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат при комнатной температуре или в термостате.
Допускается обработка планшетов хромовой смесью в течение одних суток, затем их промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат.
При работе лицо, руки, одежду защищают от попадания хромовой смеси.
Реакцию ставят на 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Сыворотку бруцеллезную сухую регидратируют дистиллированной водой или 0,85%-ным раствором хлористого натрия.
7.8.3 Проведение исследования
Крупный рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, исследуют в сроки, предусмотренные инструкциями по применению вакцин.
Мелкий рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, в РНГА не исследуют.
Реакцию ставят с использованием набора для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота для РНГА.
Содержимое лунок перемешивают до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18°С до 26°С в течение 3-4 ч и проводят учет реакции.
Одновременно с исследуемыми сыворотками аналогично готовят разведения контрольных сывороток: бруцеллезной и негативной.
Исследуемые и контрольные сыворотки в исходных разведениях в пробирках выдерживают в водяной бане, нагретой до 60°С-62°С в течение 30 мин.
При получении положительного результата исследования сыворотки крови животных в одном разведении, для определения титра гемагглютининов в РНГА постановку реакции проводят в четырех разведениях, при этом исходное разведение каждой сыворотки готовят заново.
Все сыворотки (исследуемые и контрольные) проверяют на отсутствие гемагглютинирующих свойств.
Содержимое лунок перемешивают путем легкого постукивания по краю планшета до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18°С до 24°С в течение 3-4 ч и проводят учет реакции.
Результат контроля на самоагглютинирующие свойства исследуемых и контрольных сывороток должен быть отрицательным.
Допускается постановка реакции в два этапа: накануне готовят исходные разведения исследуемых и контрольных сывороток крови, прогревают при указанном выше режиме, хранят при температуре от 2°С до 8°С и на следующий день исследуют.
После постановки реакции планшеты выдерживают в 1%-ном растворе хлорамина или другом антисептическом растворе 1,5-2,0 ч. Впоследствии их моют, как указано выше.
7.8.4 Обработка результатов
Реакции учитывают визуально и оценивают в крестах по следующей схеме:
"++++" (четыре креста) - 100%-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хорошо выраженного "зонтика" покрывает все дно лунки, возможно сползание и заворачивание краев агглютината в виде "зонтика";
"+++" (три креста) - 75%-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хорошо выраженного "зонтика" меньшего диаметра, чем при оценке реакции на четыре креста. В центре лунки возможно образование с трудом различаемого кольца из осевших неагглютинированных эритроцитов;
"++" (два креста) - 50%-ная агглютинация эритроцитов, осевшие неагглютинированные эритроциты образуют на дне лунки ровное кольцо с зернистостью вокруг него;
"+" (один крест) - на дне лунки кольцо коричнево-красного цвета;
"-" (минус) - эритроциты оседают в виде компактной "пуговки" или колечка.
За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация эритроцитов с оценкой четыре или три креста. Реакции с оценкой два креста ("++"), один крест ("+") и минус ("-") считают отрицательными.
7.9 Иммуноферментный анализ (ИФА)
Сущность метода заключается в выявлении в образце сыворотки крови животных иммуноглобулинов класса G к бактериям рода Brucella.
7.9.1 Подготовка к исследованию
7.9.1.2 Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т
Таблица 6 - Разведения ФСБ-Т
Компоненты | Количество используемых стрипов | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
Объем, см | Концентрат ФСБ-Т, см
| 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 14 | 16 | 18 | 20 | 22 | 26 |
| Вода дистиллированная, см | 48 | 96 | 144 | 192 | 240 | 288 | 336 | 384 | 432 | 480 | 528 | 624 |
Допускается хранить неиспользованный рабочий раствор ФСБ-Т в течение 5 сут в холодильнике при температуре от 2°С до 8°С.
Все остальные компоненты набора для ИФА по 5.3 готовы к употреблению.
7.9.2 Проведение исследования
7.9.2.1 Для исследования сывороток крови в ИФА отбирают необходимое количество стрипов, нумеруют их в соответствии с описью исследуемых проб водостойким маркером из-за возможного выпадения из рамки-держателя во время тестирования. Оставшиеся стрипы хранят в полиэтиленовом пакете с влагопоглотителем, при температуре от 2°С до 8°С.
7.9.3 Обработка результатов
Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре. Оптическую плотность измеряют при длине волны 450 нм. Нулевой уровень задают по воздуху. Результаты учитывают только в том случае, если в лунках с К- среднее значение оптической плотности (К-) не более 0,2 ед. о. п., а разница средних значений оптической плотности между (К+) и (К-) превышает 0,35 ед. оптической плотности.
Если значение оптической плотности исследуемого образца не превышает 0,3 ед.о.п., то результат анализа считают отрицательным (lg G к бактерии рода Brucella не определены).
Если значение оптической плотности исследуемого образца сыворотки попадает в интервал от 0,3 до 0,9 ед.о.п., то результат анализа сомнительный. Рекомендуется повторить исследование такой сыворотки, а в случае повторного сомнительного результата - провести исследование сыворотки, полученной из крови, взятой от данного животного повторно через 15-30 сут.
Если значение оптической плотности исследуемого образца превышает 0,9 ед.о.п., то результат анализа положительный.
Примечание - Для проведения ИФА могут применяться коммерческие тест-системы, использование которых проводится по инструкции производителя после валидации методики в лаборатории.
7.10 Иммунохроматографический анализ (ИХА)
7.10.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в выявлении специфических антител к липополисахаридному антигену Brucella abortus и Brucella melitensis, содержащихся в сыворотке крови крупного рогатого скота и овец.
7.10.2 Подготовка к исследованию
Перед началом работы компоненты набора и анализируемые пробы сыворотки крови выдерживают в течение 30 мин при температуре от 18°С до 25°С.
7.10.3 Проведение исследования
7.10.3.1 Метод ИХА применяют для серологического исследования невакцинировованного крупного и мелкого рогатого скота; крупного рогатого скота, вакцинированного неагглюгиногенными (из штамма В.aborus* КВ17/100 или аналогичными) или слабоагглютиногенными бруцеллезными вакцинами (из штаммов В.abortus 82, 75/79-АВ или аналогичными), но не ранее чем через 8 мес после введения вакцины.
7.10.3.4 Компонент К1 извлекают из пакета и каждую тест-полоску в вертикальном положении (по стрелкам, направленным вниз) погружают до уровня ограничительной линии в подготовленную по 7.10.3.3 пробу сыворотки.
Через 10 мин тест-полоски извлекают из флаконов и помещают в горизонтальном положении маркированной стороной вверх на чистую сухую, не поглощающую влагу поверхность (эмалированный или металлический кювет).
Через 30 мин после начала анализа (но не позднее 40 мин) визуально учитывают результаты реакции.
 |
Рисунок 1 - Учет результатов иммунохроматографического анализа
7.10.4 Обработка результатов
Результаты реакции оценивают по наличию на тест-полосках линий розового цвета в К- и Т- зонах. Реакцию считают:
- положительной - при наличии на тест-полоске в Т- и К-зонах двух параллельных линий розового цвета. То есть в анализируемой пробе сыворотки крови содержатся специфические антитела к ЛПС антигену В.abortus и В.melitensis;
- отрицательной - при наличии окрашенной линии розового цвета только в К-зоне тест-полоски. То есть в анализируемой пробе сыворотки крови специфические антитела к ЛПС антигену В.abortus и В.melitensis отсутствуют;
- недостоверной - при наличии линии розового цвета только в Т-зоне или при отсутствии окрашенных в розовый цвет линий в Т- и К-зонах. В этом случае рекомендуется провести повторное тестирование пробы сыворотки крови с использованием новой тест-полоски.
8 Интерпретация результатов исследований
8.1 Диагноз на бруцеллез считают установленным в следующих случаях:
8.1.1 У животных всех видов, не вакцинированных против бруцеллеза живыми вакцинами:
- при положительном результате биопробы (за исключением животных, с момента иммунизации которых против бруцеллеза прошло менее 12 мес);
- положительном результате в РИД с О-ПС антигеном;
- повышении титра антител при повторном серологическом исследовании через 15-30 сут.
8.1.5 У лошадей и верблюдов (В.abortus):
8.1.6 У свиней (В.suis):
- при положительном результате в РБП и (или) аллергической пробе, подтвержденном положительной РСК (РДСК) в титре 1:5 и выше и (или) ИФА.
8.1.7 У оленей и маралов (B.suis):
8.1.8 У собак (В.abortus, В.suis, В.melitensis):
8.1.9 У собак (В.canis):
- при положительном результате в РА с R-антигенами в титре 1:100 и выше и (или) в РИД.
8.1.10 У пушных зверей:
8.1.11 У морских свинок:
При положительном результате исследования в РИД с О-ПС антигеном и (или) ИФА животных считают больными.
При невозможности проведения исследований в полном объеме из-за недостаточного количества сыворотки крови либо отсутствия диагностических тест-систем, проводят исследование сывороток крови от крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей, овец, коз, оленей (маралов), взятых повторно через 15-30 сут в РА, РСК, РИД с О-ПС антигеном и ИФА.
При повышении титров РА и (или) РСК, и (или) положительном результате в РИД с О-ПС антигеном, и (или) в ИФА заболевание считают установленным.
При сохранении титров РА и (или) РСК на прежнем уровне или их снижении и отрицательном результате в РИД с О-ПС антигеном и ИФА заболевание исключают.
При положительном результате исследования в РИД с О-ПС антигеном и (или) ИФА животных считают больными.
При невозможности проведения исследований в полном объеме из-за недостаточного количества сыворотки крови либо отсутствия диагностических тест-систем проводят исследование сывороток крови от крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей, овец, коз, оленей (маралов), взятых повторно через 15-30 сут, в РИД с О-ПС антигеном (за исключением верблюдов, лошадей) в РА, РСК и ИФА. При повышении титров в РА и (или) РСК, и (или) положительном результате РИД с О-ПС антигеном, и (или) ИФА заболевание считают установленным.
При сохранении титров РА и (или) РСК на прежнем уровне или их снижении и отрицательном результате в РИД с О-ПС антигеном и ИФА заболевание исключают.
8.4 При выявлении свиней, положительно реагирующих при серологическом исследовании в РСК в титре 1:5, эти же пробы сыворотки исследуют в РБП и дополнительно в ИФА и (или) самих животных исследуют аллергической пробой.
При положительном результате исследования в РБП и (или) ИФА и (или) аллергической пробе заболевание бруцеллезом считается установленным.
При невозможности проведения исследования в полном объеме сыворотку крови свиней отбирают повторно через 15-30 сут и исследуют в РСК, РБП и дополнительно в ИФА и (или) самих животных исследуют аллергической пробой.
При сохранении или повышении титров антител в РСК и положительном результате РБП и (или) ИФА и (или) аллергической пробы заболевание свиней считают установленным.
При сохранении титров в РСК на прежнем уровне или их снижении и отрицательном результате РБП, ИФА и аллергической пробы заболевание свиней считают не установленным.
8.5 Оценка результатов диагностических исследований в ИФА проводится согласно инструкции по применению соответствующих диагностических наборов (тест-систем). Для исследования целесообразно использовать тест-системы ИФА с О-ПС антигеном или аналогичным.
8.6 Животных всех видов неблагополучных по бруцеллезу пунктов, не иммунизированных и иммунизированных против бруцеллеза сомнительно и положительно реагирующих при серологическом исследовании в одной из подтверждающих диагноз реакций в сроки, предусмотренные действующими инструкциями по применению вакцин, считают больными бруцеллезом.
УДК 619:616.98:579.841.93:616-076:006.35 | МКС 11.220 |
| |
Ключевые слова: животные, бруцеллез, диагностика, серологические реакции, интерпретация результатов | |