Методические указания по методам контроля МУК 4.1.2204-07 Обнаружение, идентификация и количественное определение охратоксина А в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Методические указания по методам контроля МУК 4.1.2204-07 Обнаружение, идентификация и количественное определение охратоксина А в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

МУК 4.1.2204-07

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Обнаружение, идентификация и количественное определение охратоксина А

в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом

высокоэффективной жидкостной хроматографии

Дата введения 2007-08-01

1. РАЗРАБОТАНЫ: ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН, профессор В.А.Тутельян, д.х.н. К.И.Эллер, к.м.н. И.В.Аксенов)

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

3. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 20 мая 2007 г. и введены в действие с 1 августа 2007 г.

4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ

1. Назначение и область применения

Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определения охратоксина А в продовольственном сырье и пищевых продуктах и предназначены для проведения лабораторных исследований учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в организациях, осуществляющих контроль безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.

2. Общие положения

Охратоксин А - микотоксин, продуцируемый микроскопическими грибами родов Aspergillus и Penicillium. Основными продуцентами охратоксина А являются A. ochraceus и Р. verrucosum.

Охратоксин A (C

ClNO

; молекулярная масса 403,8), представляющий собой по химической структуре 5-хлоризокумарин, связанный пептидной связью с L-фенилаланином, хорошо растворим в полярных органических растворителях и водном растворе гидрокарбоната натрия, малорастворим в воде. При фотометрировании раствора охратоксина А в толуол-уксусной кислоте (99:1) максимум поглощения наблюдается при длине волны, равной 333 нм, при этом относительный молярный коэффициент поглощения равен 544 м

/моль.

В экспериментах in vivo показано нефротоксическое, канцерогенное, тератогенное, эмбриотоксическое, нейротоксическое и иммунотоксическое действие охратоксина А. Международное агентство по изучению рака классифицирует охратоксин А как соединение, потенциально канцерогенное для человека (Группа 2В). Комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам и контаминантам установлена величина условно переносимого недельного поступления охратоксина А с пищей - 100 нг/кг массы тела.

Охратоксин А выявляется повсеместно в качестве природного загрязнителя продовольственного и кормового зерна, кофе и какао-бобов, винограда и специй.

3. Принцип метода

Метод включает следующие этапы:

- экстракция охратоксина А из пробы смесью ацетонитрил-вода (60:40% об.);

- очистка экстракта на иммуноаффинной колонке;

- определение охратоксина А с помощью ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием при длине волны возбуждения (

) 333 нм и длине волны эмиссии (

) 466 нм.

Диапазон определяемых концентраций: 0,0001-0,016 мг/кг.

Предел количественного определения: 0,0005 мг/кг.

Таблица

Метрологические характеристики метода, установленные

для разных концентраций охратоксина А в пробе

Метрологические характеристики	Концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг
	0,0001-0,001	>0,001
Границы относительной погрешности (показатель точности) ( ± ), %, =0,95	±30,72	±10,92
Стандартное отклонение повторяемости ( ), %	24,56	8,78
Предел повторяемости ( ), %	68,77	24,58
Полнота извлечения веществ, %	88,80	86,28

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, реактивы и материалы

4.1. Средства измерений

Система ВЭЖХ, состоящая из насоса высокого давления, инжектора типа Rheodyne-7125 с объемом петли-дозатора 50 мкл, спектрофлуориметрического детектора, обеспечивающего возбуждение флуоресценции в спектральной области 330-340 нм и регистрацию эмиссии флуоресценции при длине волны 466 нм и системы для сбора и обработки данных типа Мультихром (Амперсенд, Россия) или аналогичной, хроматографической колонки (250х4,6 мм), заполненной силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом с размером частиц 5 мкм (например, Kromasil С 18 (MetaChem Texnologies, США)
Весы аналитические
Микрошприц на 100 мкл для ВЭЖХ
Дозатор пипеточный, 1-5 см
Дозатор пипеточный, 100-1000 мкл
Дозатор пипеточный, 10-100 мкл
Цилиндры мерные с притертой пробкой вместимостью 100 см , тип 2-100 и 2-250	ГОСТ 1770-74
4.2. Вспомогательное оборудование
Спектрофотометр
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С или аналогичный	ТУ 64-1-2451
Ротационный испаритель ИР-1М с ловушкой или аналогичный	ТУ 25-11917
Электрошкаф сушильный лабораторный с погрешностью поддержания температуры ±2,5 в интервале от 50 до 350 °С	ТУ 16-531.639
Холодильник бытовой	ГОСТ 16317
Мельница лабораторная электрическая ЭМ-3А или аналогичная рН-метр	ТУ 46-22-236-79
Магнитная мешалка типа ММ 5 с перемешивающим стержнем	ТУ 25-11.834-80
Колбы плоскодонные конические на 250 см с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32	ГОСТ 10394-74
Флаконы стеклянные завинчивающиеся из темного стекла (вайл), объемом 7 см
Колбы мерные, вместимостью 100, 500, 1000 см тип 2-100-2, 2-500-2	ГОСТ 1770-74
Воронки лабораторные	ГОСТ 25336
Колбы грушевидные на 10 см с НШ 14,5, тип ГрКШ-10-14/23	ГОСТ 10394-72
4.3. Реактивы и материалы
Стандарт охратоксина А, фирма "Sigma", кат. N О-1877
Фильтры обеззоленные "синяя лента"	ТУ 6-09-1678
Натрий фосфорно-кислый двузамещенный, 12-водный, чда	ГОСТ 4172-76
Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, 2-водный, чда	ГОСТ 245-76
Натрий хлорид, хч	ГОСТ 4233-77
Ацетонитрил, осч, сорт 0
Метанол, осч	ГОСТ 6995-77
Кислота фосфорная, осч	ТУ 2612-014-00203677-97
Кислота уксусная ледяная, хч	ГОСТ 61-75
Толуол, чда	ГОСТ 5789-78
Иммуноаффинные колонки Ochraprep (R-Biopharm, Великобритания)

5. Подготовка к выполнению измерений

5.1. Приготовление стандартных растворов охратоксина А

Для приготовления стандартного раствора хранения (концентрация охратоксина А - 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина А массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 см

, приливают 50 см

смеси толуол-уксусная кислота (98:2% об.), тщательно перемешивают до полного растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую плотность при длине волны 333 нм (

). Концентрацию раствора вычисляют по формуле:

, нг/мкл

Далее 5 см

стандартного раствора охратоксина А с концентрацией 10 нг/мкл разбавляют смесью толуол-уксусная кислота (98:2% об.) до объема 100 см

, получая рабочий раствор с концентрацией 0,5 нг/мкл.

Для приготовления рабочих растворов охратоксина А с концентрацией 0,005; 0,05 и 0,1 нг/мкл отбирают соответственно 50, 500 и 1000 мкл раствора с концентрацией 0,5 нг/мкл, упаривают досуха и растворяют в 5 см

подвижной фазы.

Раствор хранения охратоксина А содержат в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) до одного года и используют для приготовления рабочих стандартных растворов. Рабочие стандартные растворы хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) в течение 1 месяца.

Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.

5.2. Приготовление фосфатного буферного раствора, рН=7,4

Навеску натрия фосфорно-кислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 см

, добавляют 10-20 см

дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.

5.3. Приготовление смесей растворителей

Толуол-уксусная кислота (98:2% об.).

В мерную колбу на 1000 см

вносят 20 см

уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил-вода (60:40% об.).

В мерную колбу на 1000 см

вносят 600 см

ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил-вода (60:40% об.; рН=3,0).

В мерную колбу на 1000 см

вносят 600 см

ацетонитрила и, перемешивая, доводят бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты подводят рН смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Метанол-уксусная кислота (98:2% об.).

В мерную колбу на 1000 см

вносят 20 см

уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

6. Отбор и подготовка проб для анализа

6.1. Отбор проб

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:

- "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб" ГОСТ 13586.3-83;

- "Крупа. Правила приемки и методы отбора проб" ГОСТ 26312.1-84;

- "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб" ГОСТ 27668-88;

- "Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию" ГОСТ 8756.0-70.

Пробы для анализа, представительные по концентрации микотоксинов для всей партии, следует отбирать из предварительно гомогенизированного среднего (исходного) образца массой 2 кг.

6.2. Подготовка проб для анализа

Отобранные пробы измельчают в течение 1-2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы.

6.2.1. Экстракция

Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см

, добавляют 100 см

смеси ацетонитрил-вода (60:40% об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр "синяя лента". Отбирают 10 см

фильтрата и добавляют 90 см

фосфатного буферного раствора, рН=7,4.

6.2.2. Очистка экстракта

На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1-2 капли в секунду, промывают 20 см

фосфатного буферного раствора, рН=7,4. Охратоксин А элюируют 3 см

смеси метанол-уксусная кислота (98:2% об.).

7. Выполнение измерений

7.1. Приготовление тестового образца

Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).

7.2. Условия хроматографирования

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - ацетонитрил-вода (60:40% об.; рН=3,0); скорость подвижной фазы - 1,5 см

/мин.

Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.

Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора А). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, рассчитывают массу охратоксина А во вколе с помощью градуировочного графика.

8. Обработка результатов измерения

8.1. Построение градуировочной зависимости

Для построения градуировочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 50 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 0,005 нг/мкл, что соответствует 0,25 нг охратоксина А. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями 0,05 и 0,10 нг/мкл, что в свою очередь соответствует 2,5 и 5,0 нг охратоксина А во вколе. В указанных условиях время удерживания находится для охратоксина А в диапазоне от 4 до 5 мин. На основании полученных данных строят градуировочный график (зависимость площади хроматографического пика от массы охратоксина А во вколе).

8.2. Оформление результатов

Расчет концентрации охратоксина А в пробе проводится по формуле:

, где

- концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг;

- масса навески для анализа, г (25,0);

- масса охратоксина А, соответствующая введенному в хроматограф объему раствора А, нг;

- объем раствора для экстракции, см

(100);

- объем экстракта, нанесенный на ИАК, см

(10);

- общий объем раствора А, см

(0,4);

- объем раствора А, введенный в хроматограф, см

(0,05).

При высоких уровнях загрязнения охратоксином А пробы необходимо увеличить объем раствора A (

) с внесением соответствующих изменений в формулу.

За окончательный результат испытаний принимается среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений:

, мг/кг

Результат анализа представляют в виде (при вероятности

=0,95):

, мг/кг, где

- граница абсолютной погрешности:

, мг/кг

- граница относительной погрешности методики (показатель точности), % (табл.1).

Если содержание охратоксина А в пробе менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание охратоксина А в пробе зерна менее 0,0001 мг/кг"*

_______________

* 0,0001 мг/кг - предел обнаружения.

8.3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

Допустимое расхождение между параллельными измерениями (

) определяют на основании предела повторяемости (

) (табл.1):

, мг/кг

Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:

то среднее арифметическое принимают за результат анализа.

При превышении норматива

следует повторить измерения, используя резервные пробы.

9. Контроль качества результатов измерений

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют такое количество раствора стандарта охратоксина А, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50-100%. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы (

) и пробы с добавкой (

). Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т.д.

Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (

), пробы без добавки (

) и величиной добавки (

) с нормативом оперативного контроля (

). Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия (при

=0,95):

Норматив оперативного контроля погрешности рассчитывают по формуле (

=0,90):

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы.

10. Требования техники безопасности

При выполнении анализов необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.2.007.0 и ГОСТ 4658. Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционными системами по ГОСТ 12.4.021.

11. Требования к квалификации исполнителя

К выполнению анализа охратоксина А в зерне и зернопродуктах допускаются лица со специальным высшим образованием или средним специальным образованием, владеющие техникой ВЭЖХ-анализа, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие опыт работы в химической лаборатории.

12. Условия выполнения измерений

Температура окружающего воздуха от 15 до 25 °С.

Относительная влажность воздуха не более 80% при 25 °С.

Атмосферное давление 730-760 мм рт.ст.

Напряжение электропитания: 210-220 В. Частота переменного тока: 45-50 ГЦ.