ГОСТ 31748-2012 Продукты пищевые. Определение афлатоксина B(1) и общего содержания афлатоксинов B(1), B(2), G(1) и G(2) в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии.
ГОСТ 31748-2012
(ISO 16050:2003)
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
фии
МКС 67.060
67.080.10
Дата введения 2013-07-01
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС")
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. N 51)
За принятие проголосовали:
|
|
|
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения | AM
| Минэкономики Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Казахстан | KZ | Госстандарт Республики Казахстан |
Киргизия | KG | Кыргызстандарт |
Молдова | MD | Молдова-Стандарт |
Россия | RU | Росстандарт |
Таджикистан | TJ | Таджикстандарт |
Узбекистан
| UZ
| Узстандарт
|
(Поправка. ИУС N 7-2015), (Поправка. ИУС N 6-2019).
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1760-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31748-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.
Международный стандарт разработан техническим комитетом по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).
Перевод с английского языка (en).
Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в национальных (государственных) органах по стандартизации указанных выше государств.
Степень соответствия - модифицированная (MOD).
Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53162-2008 (ИСО 16050:2003)
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
ВНЕСЕНЫ: поправка, опубликованная в ИУС N 2, 2015 год; поправка, опубликованная в ИУС N 7, 2015 год; поправка, опубликованная в ИУС N 6, 2019 год с учетом уточнения, опубликованного в ИУС 11-2019
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой, с очисткой на иммуноафинной колонке и послеколоночной дериватизацией, для определения афлатоксинов в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки.
Данный метод применим в отношении кукурузы с содержанием 24,5 мкг/кг, арахисового масла с содержанием 8,4 мкг/кг и сырых арахисовых орехов с содержанием 16 мкг/кг общей суммы афлатоксинов.
Метод допускается использовать для масличных культур, сушеных фруктов и продуктов их переработки.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ ISO 5725-1-2003* Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения
_______________
* На территории РФ действует ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения.
ГОСТ 4159-79 Реактивы. Йод. Технические условия
ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия
ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия
ГОСТ 22524-77 Пикнометры стеклянные. Технические условия
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
(Поправка. ИУС N 2-2015)
3 Сущность метода*
4 Реактивы
При отсутствии специальных указаний используют реактивы только признанных аналитических марок квалификации х.ч. или ч.д.а.
4.1 Вода, не ниже 1-й степени, по [1].
Вода не должна содержать органические примеси.
4.2 Хлорид натрия по ГОСТ 4233.
4.3 Йод кристаллический по ГОСТ 4159.
4.4 Афлатоксин, кристаллический или в виде пленочной ампулы.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Афлатоксины канцерогенны для человека. Следует принимать во внимание заявление, сделанное Международным агентствами по исследованиям в области рака (ВОЗ) (см. [2], [3]).
Необходимо надлежащим образом предохранять лабораторию, в которой проводятся анализы, от дневного света. Для этого закрывают окна фольгой, поглощающей ультрафиолетовое излучение. Допускается использовать в комбинации с затемненным освещением (когда отсутствует прямое солнечное освещение) занавески или шторы в комбинации с искусственным освещением.
4.5 Ацетонитрил, степень чистоты для ВЭЖХ.
4.6 Метанол по ГОСТ 6995, степень чистоты ВЭЖХ.
А.7 Толуол по ГОСТ 5789.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Толуол огнеопасен и токсичен. Приготовление стандартов с использованием данного растворителя следует проводить в вытяжном шкафу. Операции за пределами вытяжного шкафа, такие как измерение эталонов методом УФ спектрометрии, следует проводить с использованием эталонов в закрытых контейнерах.
4.8 Смесь толуол/ацетонитрил
Смешивают 98 объемных частей толуола (4.7) с двумя объемными частями ацетонитрила (4.5) (см. предупреждение в 4.7).
4.9 Растворитель для экстракции
Смешивают семь объемных частей метанола (4.6) с тремя объемными частями воды (4.1).
Другие смеси - растворители для экстракции, которые совместимы с подвижной фазой, могут также использоваться, если покажут себя более эффективными или будут рекомендованы производителем иммуноаффинной колонки.
4.10 Подвижная фаза
Смешивают три объемные части воды (4.1) с одной объемной частью ацетонитрила (4.5) и одной объемной частью метанола (4.6). Перед использованием проводят дегазацию раствора.
4.11 Реагент для послеколоночной дериватизации
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Растворы, содержащие афлатоксины, предохраняют от действия света (хранят в темноте, используют алюминиевую фольгу или затемненную стеклянную посуду).
Для определения точной концентрации афлатоксина в каждом исходном растворе регистрируют спектр поглощения при длинах волн от 330 до 370 нм в кварцевых кюветах толщиной 1 см (5.7), используя спектрометр (5.6).
|
|
|
Афлатоксин | , г/моль | |
| 312 | 19300 |
| 314 | 20400 |
| 328 | 16600 |
| 330 | 17900 |
Примечание - В качестве растворителя используется смесь толуола и ацетонитрила (4.8) | ||
4.13 Основной стандартный раствор смеси афлатоксинов
Примечание - Обычное воздействие УФ излучения во время измерения оптической плотности не приводит к заметной конверсии с образованием продуктов фотолиза.
4.14 Градуировочный раствор смеси афлатоксинов
Таблица 2 - Приготовление стандартных растворов
|
|
|
|
|
|
Стандартный раствор | Объем, отобранный из исходного раствора, мкл | Концентрация афлатоксина, нг/ см | |||
|
| | | | |
1 | 60 | 15,0 | 3,75 | 7,50 | 3,75 |
2 | 40 | 10,0 | 2,50 | 5,00 | 2,50 |
3 | 20 | 5,00 | 1,25 | 2,50 | 1,25 |
4 | 10 | 2,50 | 0,625 | 1,25 | 0,625 |
Примечание - Указанные значения приведены в качестве ориентиров. Точные значения массовой концентрации растворов вычисляют исходя из значений, рассчитанных по формуле (1) - см. 4.12 | |||||
5 Оборудование
Лабораторную стеклянную посуду, которая контактирует с водными растворами афлатоксинов в серной кислоте (4.15), погружают в воду на несколько часов, затем тщательно промывают (например, три раза) водой, чтобы удалить все следы кислоты. Отсутствие кислоты проверяют с помощью индикаторной бумаги.
Примечание - Данная обработка является необходимой, так как использование стеклянной посуды, промытой не кислотой, может привести к потере афлатоксинов. На практике данная обработка необходима для круглодонных колб, мерных колб, мерных цилиндров, склянок или пробирок, используемых для градуировочных растворов и конечных экстрактов (особенно автоматических пипеток), а также пастеровских пипеток, если они используются для переноса градуировочных растворов или экстрактов.
Обычное лабораторное оборудование и, в частности, то, которое приводится ниже.
5.1 Иммуноаффинная (IA) колонка
Рекомендуется использование высокоскоростного блендера.
5.3 Рифленая фильтровальная бумага, например, диаметром 24 см.
5.4 Фильтровальная бумага из стеклянного микроволокна, например, диаметром 11 см.
5.6 Спектрофотометр, предназначенный для измерения оптической плотности в диапазоне длин волн от 200 до 400 нм.
5.7 Кюветы из кварцевого стекла толщиной 1 см, не имеющие существенного поглощения в диапазоне длин волн от 300 до 370 нм.
5.8 Мембранный фильтр для водных растворов, изготовленный из политетрафторэтилена, диаметром 4 мм и размером пор 0,45 мкм.
5.9 Оборудование для ВЭЖХ
5.9.2 Система ввода (инжектор), со шприцевой загрузкой и петлей 50 мкл или эквивалентным.
- длина: 250 мм;
- внутренний диаметр: 4,6 мм;
- размер сферических частиц: 5 мкм.
Допускается использование колонки меньшей длины.
5.9.4 Система послеколоночной дериватизации, состоящая из безпульсационного насоса и тройника, имеющего очень малый мертвый объем, системы труб из политетрафторэтилена или нержавеющей стали длиной от 3000 до 5000 мм и внутренним диаметром 0,5 мм, а также водяной бани или послеколоночного реактора для реакции с участием йода.
6 Методика испытания*
6.1 Общие замечания
Растворы проб и стандартные растворы для определения с помощью ВЭЖХ должны содержать одинаковый растворитель или смесь растворителей.
6.2 Экстракция
Для получения прозрачного раствора можно также использовать центрифугу.
6.3 Очистка
Методы ввода в IA колонки, промывания и элюирования немного отличаются в зависимости от производителя колонки, и необходимо четко следовать конкретным инструкциям, прилагаемым к колонкам.
Примечание - В целом, процедуры включают экстракцию образца смесью метанола и воды, фильтрацию или центрифугирование, возможное разбавление образца раствором фосфатного буфера или водой, загрузку под давлением в предварительно промытую колонку, промывку колонки дистиллированной водой и элюирование афлатоксинов метанолом или ацетонитрилом (в зависимости от продукта и инструкций производителя).
Необходимо предусмотреть, чтобы максимальная емкость колонки не была превышена.
6.4 Условия работы при выполнении ВЭЖХ
Выход разделительной колонки подсоединяют к одному ответвлению тройника системы послеколоночной дериватизации (5.9.4) с помощью короткого фрагмента системы труб с внутренним диаметром, например, 0,25 мм. Ко второму ответвлению тройника подсоединяют выход насоса, который поставляет реагент для послеколоночной дериватизации. Один конец витка труб из политетрафторэтилена или нержавеющей стали (см. 5.9.4) присоединяют к третьему ответвлению тройника и другой конец присоединяют к детектору (см. 5.10). Используя термостат или водяную баню, поддерживают температуру реакционного змеевика на уровне 70 °С.
В случае использования колонки, указанной в 5.9.3, подходящими являются следующие параметры:
- впрыскиваемый объем: 50 мкл.
6.5 Идентификация
Проводят идентификацию каждого пика афлатоксина на хроматограмме образца путем сравнения значений времени удерживания со значениями соответствующих стандартов.
6.6 Построение градуировочной зависимости
Для каждого афлатоксина строят градуировочную зависимость путем ввода 50 мкл стандартных растворов 1, 2, 3 и 4 (см. таблицу 2). Проверяют линейность зависимости [4].
6.7 Определение
Количественное определение проводится методом внешнего стандарта с интегрированием площади пика или измерением высоты пика, которые далее соотносятся с соответствующими значениями для стандарта.
7 Обработка* результатов
_______________
Для получения массовой доли суммы афлатоксинов суммируют массовые доли четырех афлатоксинов.
8 Прецизионность
8.1 Межлабораторное сравнительное испытание
Детали межлабораторного сравнительного испытания прецизионности данного метода приведены в приложении А. Значения, полученные в результате межлабораторного сравнительного испытания, могут быть неприменимы к диапазонам концентраций и матрицам, отличных от тех, которые приведены в приложении А.
8.2 Повторяемость
a) Значения для кукурузы:
b) Значения для арахисового масла:
c) Значения для арахиса:
8.3 Воспроизводимость
a) Значения для кукурузы:
b) Значения для арахисового масла:
c) Значения для арахиса:
9 Протокол испытаний
Протокол испытаний должен содержать:
- всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;
- используемый метод отбора образцов, если он известен;
- используемый метод испытаний, со ссылкой на настоящий стандарт;
- детали проведения работ, не установленные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, а также все факторы, влияющие на результат(ы) испытаний;
- полученные результат(ы) испытаний или, если была проведена проверка повторяемости, полученный окончательный результат.
Приложение А
(справочное)
Результаты межлабораторного сравнительного испытания
В исследовании участвовало десять лабораторий, имелся один экземпляр каждого образца. Во время проведения данного межлабораторного сравнительного испытания в качестве реагента послеколоночной дериватизации использовался йод.
Таблица А.1 - Данные по прецизионности и открываемости афлатоксина для кукурузы
|
|
|
|
|
|
Параметр | Афлатоксин | ||||
| | | | | Сумма |
Число лабораторий, оставшихся после исключения лабораторий с резко отличающимися результатами | 9 | 9 | 9 | 10 | 9 |
Число принятых результатов | 8* | 18 | 18 | 20 | 18 |
Среднее значение  , мкг/кг | 14,88 | 1,38 | 7,18 | 1,05 | 24,49 |
Стандартное отклонение сходимости  , мкг/кг | 0,68 | 0,35 | 0,68 | 0,20 | 1,79 |
Коэффициент вариации сходимости, % | 5,8 | 25 | 9,5 | 19 | 7,3 |
Предел сходимости (  ), мкг/кг | 2,4 | 0,98 | 1,90 | 0,56 | 5,0 |
Стандартное отклонение воспроизводимости  , мкг/кг | 1,50 | 0,41 | 0,68 | 0,53 | 2,86 |
Коэффициент вариации воспроизводимости, % | 10 | 30 | 9,5 | 51 | 11,7 |
Предел воспроизводимости (  ), мкг/кг | 4,20 | 1,15 | 1,90 | 1,48 | 8,01 |
Выход, % | 85 | 55 | 96 | 42 | 81 |
Таблица А.2 - Данные по прецизионности и открываемости афлатоксина для арахисового масла
|
|
|
|
|
|
Параметр | Афлатоксин | ||||
| | | | | Сумма |
Число лабораторий, оставшихся после исключения лабораторий с резко отличающимися результатами | 10 | 9 | 10 | 10 | 10 |
Число принятых результатов | 20 | 18 | 20 | 20 | 20 |
Среднее значение , мкг/кг | 5,26 | 0,58 | 2,34 | 0,24 | 8,42 |
Стандартное отклонение сходимости , мкг/кг | 0,78 | 0,12 | 0,55 | 0,19 | 1,45 |
Коэффициент вариации сходимости, % | 14,9 | 21 | 24 | 79 | 17 |
Предел сходимости ( ), мкг/кг | 2,2 | 0,34 | 1,54 | 0,53 | 4,06 |
Стандартное отклонение воспроизводимости , мкг/кг | 1,56 | 0,22 | 0,71 | 0,24 | 2,54 |
Коэффициент вариации воспроизводимости, % | 30 | 38 | 31 | 101 | 30 |
Предел воспроизводимости ( ), мкг/кг | 4,37 | 0,62 | 1,99 | 0,67 | 7,11 |
Выход, % | 90 | 70 | 93 | 29 | 84 |
Таблица А.3 - Данные по прецизионности и открываемости афлатоксина для арахиса
|
|
|
|
|
|
Параметр | Афлатоксин | ||||
| | | | | Сумма |
Число лабораторий, оставшихся после исключения лабораторий с резко отличающимися результатами | 9 | 10 | 10 | 10 | 9 |
Число принятых результатов | 18 | 20 | 20 | 20 | 18 |
Среднее значение , мкг/кг | 9,71 | 1,07 | 4,54 | 0,65 | 16 |
Стандартное отклонение сходимости , мкг/кг | 0,53 | 0,25 | 0,28 | 0,27 | 0,83 |
Коэффициент вариации сходимости, % | 5,5 | 23 | 6,2 | 42 | 5,2 |
Предел сходимости ( ), мкг/кг | 1,48 | 0,70 | 0,78 | 0,76 | 2,3 |
Стандартное отклонение воспроизводимости , мкг/кг | 1,62 | 0,41 | 0,66 | 0,50 | 2,58 |
Коэффициент вариации воспроизводимости, % | 17 | 38 | 15 | 77 | 16 |
Предел воспроизводимости ( ), мкг/кг | 4,54 | 1,15 | 1,85 | 1,4 | 7,22 |
Выход, % | 83 | 64 | 91 | 39 | 80 |
Библиография
|
|
[1] | ISO 3696:1987 Water for analytical laboratory use. Specification and test methods (ИСО 3696:1987 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний) |
[2] | Castegnaro М., Hunt D.C., Sansone Е.В., Schuller P.L., Siriwardana M.G., Telling G.M., van Egmond H.P. и Walker E.A. Лабораторная очистка и разрушение афлатоксинов , , и в лабораторных отходах. Научная публикация IARC N 37, Международное агентство по исследованиям в области рака (ВОЗ), Лион (Франция), 1980 г., стр.59 |
[3] | Castegnaro М., Barek J., Fremy J.M., Lafontaine M., Miraglia M., Sansone E.B. и Telling G.M. Лабораторная очистка и разрушение канцерогенов в лабораторных отходах: некоторые микотоксины. Публикация IARC N 113, Международное агентство по исследованиям в области рака (ВОЗ), Лион (Франция), 1991 г., стр.63 |
[4] | Van Trijp J.M.P. и Roos А.Н. Модель для расчета калибровочных кривых, доклад RIKILT, 91, 02, январь 1991 г. |
________________________________________________________________________________________
УДК 637.544:006.354 МКС 67.060 MOD
67.080.10
________________________________________________________________________________________
