Методические указания по методам контроля МУК 4.2.2429-08 Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах (с Дополнениями и изменениями N 1).

МУК 4.2.2429-08

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах

Дата введения 2008-12-15

1. РАЗРАБОТАНЫ ГУ Научно-исследовательский институт питания РАМН (В.А.Тутельян, С.А.Шевелева, Н.Р.Ефимочкина); ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (А.Л.Гинцбург, Ф.С.Флуер).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 октября 2008 г.

4. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с 15 декабря 2008 г.

5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

ВНЕСЕНЫ Дополнения и изменения N 1, утвержденные и введенные в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации c 26.06.2011

 1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод качественного определения стафилококковых энтеротоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, мясе и мясопродуктах; птице и птицепродуктах) на основе твердофазного иммуноферментного анализа.

1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в порядке, установленном Правительством Российской Федерации.

1.3. Методы предназначены для исследования пищевых продуктов при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора и контроля, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи.

1.4. Согласно настоящим методическим указаниям предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов соответствует диапазону массовых концентраций от 0,2 до 2,0 мкг/кг (в зависимости от типа токсина и вида продукта), что ниже уровня 100-200 нг наиболее распространенного из числа известных иммунологических типов стафилококкового энтеротоксина типа А, обусловливающего развитие стафилотоксикоза у человека.

1.5. Настоящие методические указания устанавливают также метод качественного обнаружения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, C1, С2, С3, D, Е (при совместном определении) в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, в мясе и мясопродуктах; в птице и птицепродуктах) на основе фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов при использовании данного метода составляет не менее 1,0 мкг/кг.

(Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).

 2. Определения, обозначения и сокращения

СЭТ - стафилококковые энтеротоксины.

СЭА - стафилококковый энтеротоксин типа А.

СЭВ - стафилококковый энтеротоксин типа В.

ИФА - иммуноферментный анализ.

ИГ, IgG  - иммуноглобулины.

Кг - конъюгат.

ОП - оптическая плотность.

Стандартный образец состава - стандартный образец, воспроизводящий значения величин, характеризующих содержание определенных компонентов (ГОСТ 8.315).

Калибровочный раствор - раствор компонента, приготовленный из стандартного образца состава и необходимый для проведения испытания.

 3. Сущность метода

3.1. Методы основаны на детекции СЭТ, продуцируемых Staphylococcus aureus и другими коагулазоположительными стафилококками, в подготовленной соответствующим образом пробе пищевого продукта путем постановки иммунохимических тестов непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющего обнаруживать эпидзначимые типы стафилококковых энтеротоксинов А (СЭА) или В (СЭВ) при раздельном определении (тест-системы по ВФС 42-235* и 42-236*, ВС 89), а также энтеротоксины типов А, В, С, D и Е при совместном дифференцированном и недифференцированном определении

(Измененная редакция, Доп. и изм. N 1).

3.2. Принцип метода. Определение СЭТ происходит за счет специфического взаимодействия стафилококковых иммуноглобулинов к различным типам СЭТ, адсорбированных на планшете, со стафилококковыми энтеротоксинами, содержащимися в исследуемом материале. Образовавшийся комплекс "антитело + антиген" выявляют с помощью конкурирующих стафилококковых иммуноглобулинов (конъюгатов), меченых пероксидазой. Образующийся аналитический сигнал, зависящий от результатов взаимодействия комплекса "антитело + антиген" с конъюгатом на поверхности ячеек планшета и выражающийся в ферментации субстрата - ортофенилендиамина (при раздельном определении СЭТ типов А и В) или тетраметилбензидина (при совместном определении СЭТ типов А, В, С, D и Е) с изменением его окраски, измеряется по регистрируемому значению оптической плотности при длинах волн 492 и 450 нм, соответственно. Схема анализа представлена в табл.1

Таблица 1

Схема анализа

3.3. Для проведения раздельного определения используются тест-системы иммуноферментные для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В в виде лиофилизированных компонентов.

3.4. Для проведения совместного определения СЭТ используются тест-системы иммуноферментные для одновременного определения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, С, D, Е с использованием набора реагентов RIDASCREEN

SET А, В, С, D, Е или других зарегистрированных в Российской Федерации в установленном порядке тест-систем иммуноферментных с аналогичными характеристиками.

3.5. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (ФС-ИФА) стафилококковых энтеротоксинов основан на связывании СЭТ, экстрагированных из пищевого продукта, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, конъюгированных щелочной фосфатазой и флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата). Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм дважды для каждого образца: перед внесением субстрата (фон) и после накопления продуктов гидролиза - флюоресцентного 4-метил-умбеллиферола, который катализируется щелочной фосфатазой.

(Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).

3.6. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы, позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферола при 450 нм и тест-наборы, в состав которых входят наконечники, сенсибилизированные антителами к СЭТ типов А, В, С, D, Е, используемые в качестве пипетирующего устройства; и стрипы из 10 лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюорес-центного анализа.

(Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).

3.7. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы и тест-наборы, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке.

(Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).

 4. Требования к выполнению анализов

 4.1. Условия безопасного проведения работ

При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019*, а также требования, изложенные в технической документации на приборы.

Анализатор должен находиться в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила:

не использовать наконечники с поврежденной упаковкой;

не использовать поврежденные стрипы;

не использовать набор по истечении срока годности;

не смешивать реактивы из различных партий;

положительный контроль и стандарт содержат очищенный стафилококковый энтеротоксин. При работе соблюдать осторожность. Работать в защитной одежде, перчатках, очках. При попадании внутрь следует немедленно обратиться к врачу;

реактивы содержат натрия азид, который со свинцом и медью образует взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их накопления;

пролитые жидкости необходимо тщательно вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие отбеливатель;

анализаторы необходимо регулярно чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

 4.2. Требования к квалификации специалистов

Выполнение измерений может проводить специалист, способный после освоения техники иммуноферментного анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности.

 4.3. Условия выполнения измерений

Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях:

температура окружающего воздуха (20

±5) °

С;

атмосферное давление (97

±10)

кПа;

относительная влажность (65

±15)%.

Раздел 4. (Измененная редакция, Доп. и изм. N 1).

 5. Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

 5.1. Средства измерений и вспомогательное оборудование

Допускается использование оборудования, приборов и средств измерений, закупаемых по импорту, зарегистрированных в Госреестре РФ, соответствующих перечисленным по техническим характеристикам и позволяющих воспроизводить метрологические характеристики, указанные в настоящих методических указаниях.

(Измененная редакция, Доп. и изм. N 1).

 5.2 Лабораторная посуда и инструменты

Посуда мерная лабораторная:		ГОСТ 1770-74
цилиндры исполнения 2, вместимостью 1000 см ; цилиндры исполнения 3, вместимостью 25 и 100 см ; пробирки исполнения 1, вместимостью 10 см ; колбы исполнения 2, вместимостью 100, 500 и 1000 см
Пипетки 2-1-50 или 2-2-50		ГОСТ 20292-74*
Посуда лабораторная стеклянная:		ГОСТ 25336-82
колбы конические, вместимостью 50-1000 см
Пинцеты, скальпели, ножницы
Стерильные фильтр-насадки на шприц, диаметр пор 0,2 мкм (типа Millipore low protein binding Millex-GV-filters)
Автоматические пипетки на 50, 100 мкл и 1 мл, с наконечниками
Шприцы на 20 мл
Пипетка одноразовая на 500 мкл
Пакет для гомогенизации с фильтром
Центрифужные пробирки на 50 мл

     (Измененная редакция, Доп. и изм N 1).

 5.3. Реактивы и материалы

Бычий сывороточный альбумин по НД		ТУ 6-09-10-342-75
Тест-система иммуноферментная для определения стафилококкового энтеротоксина типа А по ВФС 42-235, ВС 89 с чувствительностью 2 нг/см
Тест-система иммуноферментная для определения стафилококкового энтеротоксина типа В по ВФС 42-236, ВС 89 с чувствительностью 1 нг/см
Спирт этиловый ректифицированный			ГОСТ 11547-80*
Кислота серная концентрированная, х.ч.			ГОСТ 4204-77
Вода дистиллированная			ГОСТ 6709-72
Водорода перекись, х.ч.		ГОСТ 109929-76*
О-фенилендиамин по НД
Калий хлористый			ГОСТ 4234-64*
Натрий углекислый			ГОСТ 84-76
или натрий углекислый безводный			ГОСТ 83-79
Натрий двууглекислый			ГОСТ 2156-76
Натрий хлористый			ГОСТ 4233-77
Натрий гидроокись
ТРИС-буфер
Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный 12-водный			ГОСТ 4172-76
Калий фосфорно-кислый однозамещенный			ГОСТ 4198-75
Твин-20 по НД
Кислота лимонная 1-водная			ГОСТ 3652-69
Наборы реагентов для иммуноферментного определения стафилококковых энтеротоксинов RIDACREEN SET А, В, С, D, Е (ф. "R-Biopharm AG", Германия) н-гептан
Фосфатный (PBS) буфер, рН 7,4 (0,55 г NaH PO · Н O+2,85 г Na HPO ·2 Н O+8,7 г NaCl растворить в дистиллированной воде и довести до объема 1000 мл)
Набор реагентов типа "VIDAS®Staph enterotoxin II (SET2), BioMerieux®, Франция или с аналогичными характеристиками
Набор реагентов типа RIDASCREEN® SET Total (R-Biopharm AG, Германия) или с аналогичными характеристиками
Индикатор рН (бумажный)
Трихлоруксусная кислота 90% (5,5 N)
Буфер ТРИС 0,3 М, рН 8,0
Раствор NaOH 1 N и 4 N
Соляная кислота 5 N

     (Измененная редакция, Доп. и изм. N 1).

 5.4. Состав тест-систем для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В

Тест-система иммуноферментная для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В представляет собой следующие наборы:

1) иммуноглобулины к стафилококковому энтеротоксину, выделенные из сыворотки крови (кроличьей), сухие (ИГ) в ампулах;

2) иммуноглобулины к стафилококковому энтеротоксину, выделенные из сыворотки крови (кроличьей), ковалентно связанные с пероксидазой хрена, сухие, конъюгат (Кг) в ампулах;

3) стафилококковый энтеротоксин (СЭ) ампулированный;

4) о-фенилендиамин (ОФД) сухой;

5) Твин-20 или тритон Х-100 (жидкий);

6) бычий сывороточный альбумин (БСА);

7) смесь солей для приготовления карбонат-бикарбонатного буферного раствора (КББР), раствор N 1;

8) смесь солей для приготовления фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР), раствор N 2;

9) смесь солей для приготовления цитратно-фосфатного буферного раствора (ЦФБР), раствор N 3;

10) планшеты для иммуноферментного анализа (ИФА), однократного применения;

11) гидроперит в таблетках;

12) планшет 96-ячеечный полистироловый наборный по НД.

Тест-системы из сухих реагентов хранят в защищенном от света месте при температуре (6±2) °С.

Срок годности при условии соблюдения правил хранения - 2 года с момента выпуска.

В случае несоответствия используемых наборов требованиям специфичности и снижения активности биологических компонентов применение наборов данной серии прекращают.

 5.5. Состав набора реагентов для иммуноферментного определения стафилококковых энтеротоксинов А, В, С, D, Е

В состав набора для дифференцированного определения СЭТ типов А, В, С, D, Е входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 12 проб с идентификацией энтеротоксинов (включая положительный контроль).

Набор для твердофазного иммуноферментного анализа СЭТ А, В, С, D, Е содержит:

В состав набора типа RIDASCREEN® SET Total для недифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 96 проб (включая положительные и отрицательные контроли) без идентификации типов энтеротоксинов.

Тест-набор для недифференцированного определения SET содержит:

(Измененная редакция, Доп. и изм. N 1).

 5.7. Состав тест-набора для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа

В состав набора должны входить материалы и реагенты в количествах, достаточных для исследования 26 проб и 4 контрольных образцов.

Набор содержит следующие компоненты, готовые к использованию (табл.1).

Таблица 1

Компоненты набора	Обозна- чение	Состав
30 стрипов для определения СЭТ	STR	см. табл.2
30 наконечников с конъюгированными антителами	SPR	На внутреннюю поверхность наконечников SPR® нанесены антитела к стафилококковым энтеротоксинам
Стандарт (1 флакон 6 мл)	S1	Очищенный энтеротоксин А (<1,0 нг/мл) + консервант + белковые стабилизаторы. Доверительный интервал указан на калибровочной карте
Положительный контроль определения (1 флакон 6 мл)	С1	Очищенный энтеротоксин А (<1,0 нг/мл) + консервант + белковые стабилизаторы. Доверительный интервал указан на калибровочной карте
Отрицательный контроль определения (1 флакон 6 мл)	С2	ТРИС-забуференный физиологический раствор (150 ммоль/л) - Твин рН 7,6 + консервант. Максимальное приемлемое значение указано на калибровочной карте MLE после следующего: "Control С2 (-) Test Value Range"
Концентрат буфера для экстракции СЭТ (1 флакон 55 мл)	R1	ТРИС* 2,5 моль/л - Твин 10 г/л - MIT 10 г/л рН 8,0
1 калибровочная карта		Лист спецификаций с фабричными установками для калибровки тестов, для данной партии реагентов
1 инструкция

Состав стрипа (табл.2). Каждый стрип в тест-наборе для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа состоит из 10 лунок, запечатанных фольгой, на которую нанесен штрих-код, несущий информацию о типе анализа, номере партии и сроке годности. Фольга перфорирована над лункой для внесения образца. Последняя лунка представляет собой кювету, в которой происходит считывание результата. Прочие лунки содержат реактивы для анализа.

Таблица 2

Лунка	Реактивы и назначение
1	Лунка для внесения 500 мкл образца
2	Предпромывочный буфер (400 мм ): NaCl-ТРИС (150 мМ) - Твин рН 7,6 - белковый стабилизатор + консервант
3-4-5-7-8-9	Промывочный буфер (600 мм ): NaCI - ТРИС (150 мМ) - Твин рН 7,6 + консервант
6	Коньюгат (400 мм ): меченные щелочной фосфатазой антитела к стафилококковым энтеротоксинам + консервант
10	Кювета, содержащая субстрат (300 мм ): 4-метил-умбелиферил-фосфат (0,6 мМ) + диэтаноламин* (0,62 моль/дм или 6,6%, рН 9,2)+ консервант

5.7. (Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).

 6. Проведение испытаний методом твердофазного иммуноферментного анализа*

________________

* Измененная редакция, Доп. и изм. N 1.

 6.1.Отбор проб

Отбор проб для анализа следует проводить в соответствии с ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ Р 51446-99* (ИСО 7218-96) "Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований" или МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов".

 6.2. Подготовка проб к анализу (при раздельном определении СЭА и СЭВ)

Из асептично отобранных образцов пищевых продуктов готовят пробы к анализу и экстрагируют СЭТ, учитывая физическое состояние продуктов, следующим образом:

а) экстракция СЭТ из твердых продуктов. Из произвольно отобранных точечных проб из 5 мест партии, массой нетто 25 г каждая, готовят среднюю пробу массой 125 г, измельчают режущим инструментом, добавляют 125 см

стерильного забуференного физиологического раствора с рН 7,4, содержащего 8,5 г натрия хлорида, 0,55 г NaH

PO

·

Н

O и 2,85 г Na

HPO

·

Н

O на 1000 мл дистиллированной воды, и гомогенизируют до получения однородной массы. В полученном гомогенате с помощью 1 N раствора соляной кислоты устанавливают рН 4,5, затем центрифугируют гомогенат при 8000-9000 об./мин в течение 45 мин при охлаждении (допускается проводить центрифугирование при температуре не выше 15

°

С). После центрифугирования слой жира, собирающийся на поверхности надосадочной жидкости, удаляют шпателем или стеклянной палочкой.

После удаления жира надосадочную жидкость (не менее 5 см

) переносят в новую стерильную пробирку, устанавливают в ней рН 7,3

±0,1

при помощи 1 N раствора NaOH, осадок удаляют. К полученному таким образом экстракту добавляют Твин-20 до конечной концентрации 0,1% и бычий сывороточный альбумин (или нормальную кроличью сыворотку) до конечной концентрации 2,5% и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин;

б) экстракция СЭТ из сыров. Из произвольно отобранных точечных проб сыра из 5 мест от партии, массой нетто 25 г каждая, готовят среднюю пробу массой 125 г, измельчают режущим инструментом, добавляют 125 см

стерильного 0,25 М ТРИС-буфера с рН 8,0, содержащего 30,28 г ТРИС гидроксиметиламинометана на 1000 мл дистиллированной воды, и гомогенизируют до получения однородной массы в течение 3 мин при высокой скорости. Доводят рН до 4,0 с помощью 6 N раствора соляной кислоты. Гомогенат центрифугируют в течение 10 мин при 3500 g, отделяют супернатант (не менее 5 см

) и доводят в нем рН до 7,0-8,0 6 N раствором NaOH;

в) экстракция СЭТ из жидких продуктов и сухих молочных продуктов. В объединенной пробе молока объемом 125 см

с помощью 1 N раствора соляной кислоты устанавливают рН 4,5, затем центрифугируют образец при 8000-9000 об./мин в течение 45 мин при охлаждении. В надосадочной жидкости (не менее 5 см

) доводят рН до 7,0-8,0 6 N раствором NaOH.

Образец сухого молока (25 г) смешивают с 125 см

0,25 М ТРИС-буфера с рН 8,0 и гомогенизируют до получения однородной массы в течение 3 мин при высокой скорости. Доводят рН до 4,0 с помощью 6 N раствора соляной кислоты. Гомогенат центрифугируют в течение 10 мин при 3500 g, отделяют супернатант (не менее 5 см

) и доводят в нем рН до 7,0-8,0 6 N раствором NaOH.

 6.3. Подготовка лабораторной посуды

Лабораторную стеклянную посуду следует мыть хромовой смесью, многократно промывать водопроводной водой и ополаскивать дистиллированной водой. Сушить посуду следует в сушильном шкафу.

 6.4. Подготовка прибора к работе

Подготовку и проверку фотометра проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации и техническим описанием к прибору.

 6.5. Проведение анализа при использовании тест-систем для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В

6.5.1. Подготовка к проведению анализа

6.5.1.1. Раствор N 1. Карбонатно-бикарбонатный буферный раствор (КББР) 0,05 М, рН 9,5

±0,1.

Навеску солей из пакета с надписью "раствор N 1" разводят в 150 см

дистиллированной воды. Хранить при температуре (4

±2) °

С в течение месяца.

6.5.1.2. Раствор N 2. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР) 0,1 М, рН 7,2

±0,1.

Навеску солей из пакета с надписью "раствор N 2" растворяют в 500 см

дистиллированной воды и доводят объем до 3 дм

. Хранить при температуре (4

±2) °

С в течение месяца.

6.5.1.3. Раствор N 2А. К 1 дм

раствора N 2 добавляют 0,5 см

детергента (Твин-20 или тритон Х-100). Раствор N 2А хранению не подлежит.

6.5.1.4. Раствор N 2Б. Содержимое флакона с этикеткой "БСА" растворяют в 50 см

раствора N 2А. Хранению не подлежит.

6.5.1.5. Раствор N 3. ЦФБР 0,1 М, рН 5,5

±0,1.

Содержимое пакетика с надписью "лимонная кислота" (пакет N 3) 0,32 г растворяют в 25 см

дистиллированной воды. Содержимое пакета с надписью "натрий фосфорно-кислый 12-водный" 1,65 г также растворяют в 25 см

дистиллированной воды. Хранить по отдельности, не более двух недель. Перед употреблением растворы смешивают в соотношении 1:1.

6.5.1.6. Раствор N 4. Содержимое 1 ампулы с этикеткой "ИГ" растворяют в 1 см

дистиллированной воды, далее доводят объем до 30 см

раствором N 1. Одна ампула "ИГ" расходуется на 1 планшет.

6.5.1.7. Раствор N 5. Содержимое 1 ампулы с этикеткой "СЭА" или "СЭВ" растворяют в 1 см

дистиллированной воды. Исходный раствор СЭА и СЭВ можно хранить при температуре (4

±2) °

С в течение 1 месяца. Рабочий раствор СЭА и СЭВ с конечной концентрацией 1 нг/ см

готовят из исходного, используя раствор N 2А. Хранению не подлежит.

6.5.1.8. Раствор N 6. Содержимое ампулы с этикеткой "Кг" разводят в 1 см

дистиллированной воды, далее доводят до 10 см

раствором N 2Б. Хранению не подлежит.

6.5.1.9. Раствор N 7. Растворяют 4-5 мг ОФД в 10 см

раствора N 3. Раствор N 7 готовят за 10 мин до использования, хранят в темном месте при комнатной температуре. (Содержимое флакона ОФД рассчитано на 50 см

, т.е. на 5 планшетов.)

6.5.1.10. Раствор N 8. Одну таблетку гидроперита растворяют в 10 см

дистиллированной воды. Полученный 30%-й раствор перекиси водорода хранят в темном месте при температуре (4

±2) °

С. Срок хранения 1 месяц.

6.5.1.11. Раствор N 9. Смешивают 10 см

раствора N 7 и 0,17 см

( )раствора N 8, разведенного дистиллированной водой 1:10 (или 50 см

раствора N 7 и 0,85 см

3%-го раствора перекиси водорода). Готовят непосредственно перед внесением в лунки. Хранению не подлежит.

6.5.1.12. Раствор N 10. Раствор серной кислоты в концентрации 1,5 моль/дм

- растворяют 1,5 см

концентрированной (х.ч.) серной кислоты в 15 см

дистиллированной воды. Хранят при температуре (20

±2) °

С.

6.5.2. Подготовка проб к измерениям

Приготовление рабочих растворов исследуемых образцов.

Экстракты из проб продуктов, полученные по п.6.2, вносят в количестве 1,0 см

в пробирки и наносят маркировку, соответствующую номерам проб.

6.5.3. Проведение испытаний

6.5.3.1. Сорбция стафилококковых иммуноглобулинов на планшет. В ячейки планшета вносят с помощью автоматического дозатора пипеточного по 0,25 см

раствора N 4. Сенсибилизацию планшетов иммуноглобулинами проводят в течение 2 ч при температуре (37

±2) °

С или 18-24 ч при температуре (4

±2) °

С.

6.5.3.2. По окончании сорбции иммуноглобулины удаляют из ячеек планшета сильным встряхиванием перевернутого планшета и отмывают 4 раза по 5 мин раствором N 2А (промывной раствор вносят до края ячеек), вытряхивают и высушивают постукиванием по фильтровальной бумаге.

6.5.3.3. Внесение на планшет положительного контроля. В ячейки А-1, В-1, вносят по 0,1 см

раствора N 5 (положительный контроль). В ячейки С-1, Д-1, вносят по 0,1 см

раствора N 2А (отрицательный контроль). В остальные ячейки планшета вносят по 0,1 см

исследуемого материала.

6.5.3.4. Планшеты выдерживают в термостате при температуре (37±2) °С в течение 1 ч, затем жидкость из ячеек удаляют в емкость с 6%-м раствором перекиси водорода, отмывают 5 раз и подсушивают, как указано в п.6.5.3.2.

6.5.3.5. В каждую ячейку планшета вносят по 0,1 см

раствора N 6.

6.5.3.6. Планшеты выдерживают в термостате при температуре (37±2) °С в течение 1 ч.

6.5.3.7. Удаляют жидкость из ячеек планшета встряхиванием и отмывают 6 раз как указано в п.6.5.3.2.

6.5.3.8. В каждую ячейку планшета вносят по 0,1 см

раствора N 9.

6.5.3.9. Планшеты выдерживают в темноте при температуре (20±2) °С в течение 30 мин до появления слабо-желтой окраски в контрольных ячейках (С-1, Д-1).

6.5.3.10. Реакцию останавливают внесением в ячейки по 0,1 см

раствора N 10. В ячейках, где прошла реакция, появляется окрашивание от желтого до оранжево-коричневого. В ячейках, где исследуемые пробы не содержат энтеротоксина, окраска отсутствует или светло-желтая.

6.5.3.11. Для каждого типа энтеротоксина следует использовать отдельный планшет, повторное использование планшета не допускается.

6.5.4. Учет результатов анализа

6.5.4.1. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности (ОП) на вертикальном фотометре при длине волны 492 нм.

Результаты записей оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами вариантов.

6.5.4.2. Величина оптической плотности в ячейках с положительным контролем - специфическим антигеном (А-1, В-1) - должна составлять не менее 0,30±0,05; в ячейках с отрицательным контролем (С-1, Д-1) - не более 0,10±0,05. Значения ОП в двух параллельных определениях одной и той же пробы не должны различаться более чем на 0,05.

6.5.4.3. Для всех ячеек-дублей рассчитывают средние арифметические значения оптической плотности (ОП) и находят отношения полученных к среднему значению оптической плотности для контроля.

6.5.4.4. Результат определения считается положительным, если ОП в исследуемом материале в 2 раза и более превосходит среднее арифметическое из двух значений ОП отрицательного контроля.

6.5.4.5. По результатам двух параллельных определений рассчитывают среднее арифметическое значение ОП в исследуемом образце.

Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого, то среднее арифметическое принимают за результат анализа. В противном случае анализ следует повторить.

6.5.4.6. В протоколах анализа по раздельному определению СЭТ результаты представляют в виде:

СЭА или СЭВ обнаружены в образце массой 125 г (в 5 образцах по 25 г);

СЭА или СЭВ не обнаружены в образце массой 125 г (в 5 образцах по 25 г).

 6.6. Проведение анализа при совместном определении стафилококковых энтеротоксинов А, В, С, D, Е

Перед использованием набора необходимо довести температуру всех реагентов до комнатной, сразу после использования охладить все реагенты до температуры 2-8 °С. В процессе выполнения анализа не допускать высыхания лунок планшета. Воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. На всех стадиях инкубации следует избегать воздействия прямого солнечного света. При инкубации рекомендуется прикрыть планшет крышкой.

6.6.1. Приготовление моющего буфера. Для приготовления моющего буфера смешивают 1 часть концентрированного моющего буфера и 9 частей дистиллированной воды (например, 10 мл концентрата и 90 мл дистиллированной воды). Если во флаконе с концентрированным буфером образовались кристаллы, следует предварительно их растворить, нагревая флакон в водяной бане при 37 °С. Срок хранения готового моющего буфера при температуре 2-8 °С составляет не более четырех недель. Температуру моющего буфера перед его использованием необходимо довести до комнатной.

6.6.2. Подготовка планшета. Фольгированная упаковка планшета открывается со стороны застежки. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2-8 °С.

6.6.3. Положительный контроль. В качестве положительного контроля используют смесь энтеротоксинов А, В, С, D, Е (концентрация каждого энтеротоксина составляет 2 нг/мл), раствор входит в комплект набора в готовом к использованию виде.

 6.7. Проведение анализа

6.7.1. Проведение анализа для совместного дифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, С, D, Е методом твердофазного иммуноферментного анализа.

6.7.1.1. Вставить в рамку планшета стрипы в количестве, соответствующем количеству проб, подготовленных для анализа.

6.7.1.2. Добавить по 100 мм

исследуемого раствора в лунки А - G соответствующего стрипа, в лунку Н добавить 100 мм

положительного контроля, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре.

6.7.1.3. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку и тщательно выбить капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. С помощью 8-канальной пипетки заполнить лунки по 250 мм

готового моющего буфера и снова вылить жидкость. Выбить лунки, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок моющим буфером еще три раза.

6.7.1.4. Добавить в каждую лунку по 100 мм

коньюгата, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре.

6.7.1.5. Провести процедуру, описанную в п.6.7.1.3.

6.7.1.6. Добавить по 50 мм

субстрата и 50 мм

хромогена в каждую лунку. Осторожно перемешать вручную и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.

6.7.1.7. Добавить в каждую лунку по 100 мм

стоп-реагента и осторожно перемешать вручную. В течение 30 мин после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм ("бланк" или нулевое считывание по воздуху).

6.7.2. Проведение анализа для совместного недифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов методом твердофазного иммуноферментного анализа.

6.7.2.1. Вставить в рамку планшета стрипы в количестве, соответствующем количеству проб, подготовленных для анализа.

6.7.2.2. Добавить по 100 мм

исследуемых проб и контролей в соответствующие лунки стрипа, используя новый наконечник для каждой пробы. Закрыть лунки пленкой и инкубировать в течение 30 мин при температуре (36

±1) °

С.

6.7.2.3. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку и тщательно выбить капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. С помощью 8-канальной пипетки заполнить лунки по 300 мм

готового моющего буфера и снова вылить жидкость. Выбить лунки, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок моющим буфером еще 4 раза.

6.7.2.4. Добавить в каждую лунку по 100 мм

коньюгата 1, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 30 мин при температуре (36

±1) °

С.

6.7.2.5. Провести процедуру, описанную в п.6.7.2.3.

6.7.2.6. Добавить в каждую лунку по 100 мм

коньюгата 2, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 30 мин при температуре (36

±1) °

С.

6.7.2.7. Провести процедуру, описанную в п.6.7.2.3.

6.7.2.8. Добавить по 100 мм

субстрата/хромогена в каждую лунку. Осторожно перемешать вручную и инкубировать при температуре (36

±1) °

С в течение 15 мин в темноте. Немедленно просмотреть результаты.

6.7.2.9. Изменение цвета в лунках планшета из красного в голубой указывает на присутствие стафилококковых энтеротоксинов в пробах. Осторожно перемешать пробы вручную круговыми движениями микропланшета по поверхности стола для равномерного распределения окраски раствора в лунках.

6.7.2.10. Добавить в каждую лунку по 100 мм

стоп-реагента и осторожно перемешать вручную. Изменение цвета из голубого в желтый указывает на присутствие стафилококковых энтеротоксинов в пробах. Измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм.     

6.7. (Измененная редакция, Доп. и изм. N 1).

 6.8. Обработка результатов измерения

6.8.1. Определение пороговой величины. Для каждой пробы отдельно вычисляется среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках F и G (отрицательный контроль). Для того, чтобы получить пороговую величину, к этому среднему значению следует добавить 0,15.

При совместном недифференцированном определении СЭТ методом твердофазного иммуноферментного анализа пороговую величину оптической плотности также устанавливают путем прибавления 0,15 к среднему значению оптической плотности, измеренной в лунках с отрицательным контролем.

(Измененная редакция, Доп. и изм. N 1).

6.8.2. Область достоверности (контроль качества анализа):

1) оптическая плотность, измеренная в лунках с положительным контролем, должна быть равна или больше 0,5;

2) средняя оптическая плотность, измеренная в лунках F и G (отрицательный контроль) должна быть равна или меньше 0,3;

3) если условия 1 и 2 не соблюдаются, результаты не подлежат интерпретации.

6.8.3. Интерпретация результатов. Результат интерпретируется как отрицательный, если величина оптической плотности ниже пороговой. Результат интерпретируется как положительный, если величина оптической плотности выше пороговой или равна ей.

 6.9. Учет результатов анализа

В протоколах анализа по совместному определению СЭТ результаты представляют в виде:

СЭТ типов А, В, С, D и Е обнаружены в образце массой 125 г (в 5 образцах по 25 г);

СЭТ типов А, В, С, D и Е не обнаружены в образце массой 125 г (в 5 образцах по 25 г).

 6.10. Идентификация стафилококковых энтеротоксинов

При получении положительных результатов анализа с применением недифференцированного определения СЭТ методом твердофазного иммуноферментного анализа тип присутствующего в исследуемой пробе энетротоксина может быть установлен путем повторного дифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, С, D, Е (п.6.7.1).

6.10. (Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).

 7. Проведение фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа для качественного недифференцированного определения СЭТ типов А, В, C1, С2, С3, D и Е

 7.1. Подготовка к анализу

     7.1.1. Приготовление буфера для экстракции

Содержимое флакона R1 (концентрат буфера для эктракции) растворить в стерильной деминерализованной воде до конечного объема 1000 см

, тщательно перемешать. Буфер может храниться в течение 3 месяцев при температуре 2-8

°

С. Концентрат буфера можно разделить на аликвоты и разводить по частям в зависимости от частоты использования и скорости потребления.

     7.1.2. Приготовление 90%-го раствора трихлоруксусной кислоты

Растворить 90 г трихлоруксусной кислоты в 40 мл деминерализованной воды. Довести конечный объем до 100 см

. Хранить раствор 1 месяц при температуре 18-25

°

С.

     7.1.3 Измерение рН экстрактов

Для измерения рН использовать трехцветный бумажный индикатор рН с точностью определения не менее 0,5 единиц рН.

 7.2. Проведение экстракции

     7.2.1. Общий протокол экстракции СЭТ

Внести 25 г образца пищевого продукта и 25 см

буфера для экстракции в пакет для гомогенизации типа стомайкер. Гомогенизировать в течение 3 мин на высокой скорости до получения гомогенной суспензии, оставить на 15 мин при комнатной температуре. Центрифугировать пробу в течение 15 мин при 3000-5000 g и температуре 18-25

°

С. Пропустить супернатант через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Измерить рН фильтрата и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. Отобрать 500 мкл готового экстракта для проведения анализа.

     7.2.2. Молочные продукты (кисломолочные продукты, сухое молоко, сыры)

Внести 25 г образца в 40 см

деминерализованной воды нагретой до температуры (38

±2) °

С. Гомогенизировать в течение 3 мин на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Оставить на 30 мин при 18-25

°

С. Измерить рН и, при необходимости, довести его до 3,5-4,0, используя раствор 5N НСl. Центрифугировать 15 мин при 3000-5000 об./мин и температуре 18-25

°

С. Измерить рН надосадочной жидкости и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. Центрифугировать повторно 15 мин при 3000-5000 g и температуре 18-25

°

С. При необходимости профильтровать как описано в п.7.2.1. Отобрать 500 мкл готового экстракта для проведения анализа.

     7.2.3. Молоко

Отобрать 25 см

пробы и довести рН до 3,5-4,0, используя 5 N НСl. Далее экстракцию СЭТ проводить как указано в п.7.2.2.

     7.2.4. Сырые мясо и мясопродукты, готовые мясные изделия, морепродукты

Гомогенизировать 25 г образца в 25 см

деминерализованной воды в течение 3 мин на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Если суспензия слишком плотная, добавить еще 25 см

деминерализованной воды и гомогенизировать повторно. Отобрать весь экстракт. Измерить рН и, при необходимости, довести его до рН 4,0, используя раствор 5 N НСl. Оставить на 15-30 мин при 18-25

°

С. Центрифугировать 15 мин при 3000-5000 g и температуре 18-25

°

С. Пропустить надосадочную жидкость через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Измерить рН фильтрата и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. При наличии осадка центрифугировать повторно. Отобрать 500 мм

готового экстракта для проведения анализа.

7.2.5. Экстракция СЭТ из концентрированных пищевых продуктов (концентраты готовых блюд, сублимированные пищевые продукты)

Концентрированные продукты следует развести в соответствии с рекомендациями изготовителя. Измерить рН конечного продукта и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. При наличии осадка центрифугировать 15 мин при 3000-5000 g и температуре 18-25

°

С, пропустить надосадочную жидкость через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Отобрать 500 мм

готового экстракта для проведения анализа.

7.2.6. Экстракция СЭТ из сухих (дегидратированных) продуктов

Сухие продукты (кроме сухого молока) восстановить в дистиллированной воде до объема, указанного изготовителем. Оставить на 1 ч при температуре 18-25 °С, далее экстракцию СЭТ проводить как указано в п.7.2.1.

7.2.7. Концентрирование проб трихлоруксусной кислотой

Метод используется для увеличения концентрации СЭТ при исследовании молочных продуктов, в том числе сыров.

Приготовить раствор трихлоруксусной кислоты в соответствии с п.7.1.2.

Внести 25 г образца в 40 см

деминерализованной воды нагретой до температуры (38

±2) °

С. Гомогенизировать в течение 3 мин на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Оставить на 30 мин при 18-25

°

С. Измерить рН и, при необходимости, довести его до 3,5-4,0, используя раствор 5 N НСl. Центрифугировать 15 мин при 3000-5000 об./мин и температуре 18-25

°

С. Измерить рН надосадочной жидкости и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. Измерить объем надосадочной жидкости (

). Добавить к надосадочной жидкости 90%-й водный раствор трихлоруксусной кислоты до его конечной концентрации 5%. Гомогенизировать и оставить на 30 мин при 18-25

°

С. Центрифугировать 30 мин при 3000-5000 g и температуре 18-25

°

С. Осторожно удалить надосадочную жидкость. Растворить осадок в 0,3 М буфере ТРИС, рН 8,0, в объеме, соответствующем

начального объема надосадочной жидкости

, обработанной трихлоруксусной кислотой. При необходимости довести рН до 7,5-8,0, используя раствор 4 N NaOH. При таком значении рН молочный раствор прозрачен. При наличии твердых частиц центрифугировать повторно 15 мин при 3000-5000 g и температуре 18-25

°

С. Отобрать 500 мм

готового экстракта для проведения анализа.

 7.3. Хранение экстрактов

Определение СЭТ с использованием наборов для проведения фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа следует проводить сразу после экстракции. Если нет возможности провести тест сразу, экстракты (кроме молочных продуктов) могут храниться при температуре не выше -19 °С в течение 7 суток.

 7.4. Проведение анализа на автоматическом иммуноферментном анализаторе

Перед использованием наборов и реактивов новой партии в прибор необходимо ввести спецификации. Для этого используется калибровочная карта. Если не провести эту процедуру до проведения анализа, прибор не сможет распечатать результат. Процедуру необходимо проводить только один раз для каждой партии реактивов (лота). Данные с калибровочной карты вводят автоматически или вручную.

Перед проведением анализа необходимое количество компонентов тест-набора оставить при комнатной температуре на 30 мин.

7.4.1. Стандарт перед использованием необходимо тщательно перемешать. Тестирование стандарта необходимо для подтверждения сохранности набора при транспортировании и хранении. Стандарт должен тестироваться в каждом наборе. Результаты тестирования хранятся в течение 2 недель и автоматически используются для анализа результатов теста. Рекомендуется тестирование стандарта в 2 стрипах.

7.4.2. Положительный и отрицательный контроли перед использованием тщательно перемешивают. Контроли тестируются в каждом наборе. Тестирование контролей необходимо для занесения пределов теста в компьютер.

7.4.3. В прибор вводят соответствующую информацию для создания рабочего листа.

7.4.4. Вносят 500 мм

готового экстракта в лунку для внесения образца на стрипе тест-набора.

7.4.5. Вносят 500 мм

стандарта и контролей в 1 лунку (отдельно для каждого) стрипа.

7.4.6. Вставляют стрипы и конусы в соответствующие отделения прибора, которые указаны в рабочем листе. Следует убедиться, что на стрипе и конусе указаны соответствующие буквы кода данного анализа.

7.4.7. Анализ проводят в соответствии с инструкцией, изложенной в руководстве пользователя.

7.4.8. Анализ полностью автоматизирован, длительность составляет 80 мин.

 7.5. Интерпретация результатов

Оптический сканер прибора измеряет флюоресценцию дважды в оптической кювете для каждого образца. Первый раз измеряется фон субстрата и кюветы перед внесением в нее субстрата. Второй раз флюоресценция измеряется после внесения субстрата в конус и образования флюоресцирующего продукта в результате ферментативной реакции на поверхности конуса. Вычитание фона кюветы из последнего измерения дает относительную величину флуоресценции - ОВФ (Relative Fluorescence Value) тестируемого образца. Интерпретация значений ОВФ проводится прибором автоматически согласно формуле:

Результат теста=ОВФ образца / ОВФ стандарта.

В качестве стандарта в системе используют очищенный стафилококковый энтеротоксин типа А.

Результаты тестирования для образца и контролей сравниваются со значениями ОВФ, хранящимися в базе данных: <0,13,

0,13. Если полученное значение меньше 0,13, то результат интерпретируется как отрицательный. Если значение теста равно или выше 0,13, то результат интерпретируется как положительный.

Результаты также считаются недействительными, если (1) значение ОВФ фона выше ожидаемого значения или (2) нет информации о значениях ОВФ стандарта. В первом случае возможно загрязнение субстрата, в связи с чем необходимо провести повторное тестирование образца с новым стрипом. Во втором случае должен быть протестирован новый стандарт из той же партии и результаты теста должны быть пересчитаны по этому стандарту.

На принтер выводится информация - тип теста, номер образца, дата и время анализа, номер партии и дата окончания срока годности набора, значения ОВФ, результат и его интерпретация.

Раздел 7. (Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).

Приложение

(рекомендуемое)

Форма таблицы для записи результатов анализа