Методические указания по методам контроля МУК 4.1.787-99 Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции.

Методические указания по методам контроля МУК 4.1.787-99 Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции.

МУК 4.1.787-99

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции

Дата введения 2000-01-01

1. РАЗРАБОТАНЫ Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Скачков В.Б., Брагина И.В., Королева Н.В.) и ЗАО "БиоХимМак СТ" (ведущий научный сотрудник Васияров Г.Г., старший научный сотрудник Алексеева Г.С., старший научный сотрудник Осокин Д.М., доктор химических наук Староверов С.М.).

2. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 23 октября 1999 г.

3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

1. Назначение и область применения

Настоящие методические указания устанавливают способы подготовки проб продовольственного сырья и пищевых продуктов методом твердофазной экстракции для последующего хроматографического анализа микотоксинов и предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции учреждениями госсанэпидслужбы РФ, а также для предприятий и учреждений, осуществляющих контроль качества и исследования продовольственного сырья и продуктов питания в соответствии с СанПиН 2.3.2.560-96* "Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов" и аккредитованных в установленном порядке.

2. Способ подготовки проб

Подготовка проб включает следующие разделы:

экстракция объекта испытания, предусматривающая получение единого экстракта, содержащего все микотоксины, нормируемые в данном объекте по СанПиН 2.3.2.560-96;

подготовка экстракта проб методом твердофазной экстракции, включающая предварительную очистку, концентрирование и окончательную очистку на концентрирующих патронах Диапак.

3. Требования безопасности

При работе с реагентами, растворителями и веществами необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

4. Условия выполнения подготовки проб

Процессы приготовления растворов и обработки проб проводят в нормальных условиях при температуре окружающего воздуха 18

С.

5. Афлатоксин B

(AT-B

), зеараленон (ЗОН), дезоксиниваленол (ДОН) и Т-2 токсин (Т-2)

5.1. Оборудование, материалы, реактивы

Таблица 1

Оборудование, материалы, реактивы и растворы	AT-B		ЗОН		ДОН	Т-2
	1 вар.	2 вар.	1вар.	2 вар.
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78 или магнитная или механическая мешалка	+
Весы аналитические с погрешностью взвешивания ±0,01 г	+
Мельница типа "Циклон" QC-114	+
Испаритель ротационный (ИР-1М2, ТУ 25-1173.102-84 или др.)	+
Устройство для создания вакуума около -0,7 мм рт.ст. (водоструйный насос, масляный вакуумный насос, медицинский отсасыватель)	+
Вакуумное устройство для подготовки проб (вакуумный манифолд), с приемниками проб вместимостью не менее 10 см	+
Устройство для упаривания проб в токе азота при нагревании около 40 °С (желательно суховоздушная баня)	+	+	-	-	-	-
Концентрирующий патрон Диапак А-3, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"	+	+	+	+	+	+
Концентрирующий патрон Диапак АУ-3, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"	-	-	-	-	+	+
Концентрирующий патрон Диапак П-3, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"	+	+	+	+	-	-
Концентрирующий патрон Диапак Н, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"	+	-	+	-	+	+
Концентрирующий патрон Диапак С, ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАО "БиоХимМак СТ"	-	+	-	+	-	-
Пинцет медицинский, 15 см	+
Шпатель металлический или фарфоровая ложка	+
Колбы плоскодонные конические с пробками вместимостью 50 см по ГОСТу 25336	+	+	+	+	-	-
Колбы плоскодонные конические (Эрленмейера) с пробками вместимостью 250 или 300 см по ГОСТу 25336	+
Колба Бюхнера вместимостью 500 см	+
Воронка Бунзена вместимостью 200 см	+
Воронка делительная вместимостью 250 см по ГОСТу 25336	+
Колбы остродонные с пробками по ГОСТу 25336 с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 5, 10 или 25 см	+
Колбы грушевидные с пробками по ГОСТу 25336 с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 10 и 25 см	+	+	+	+	-	-
Цилиндры мерные вместимостью 25, 50, 100 см , 2 кл, по ГОСТу 1770	+
Микрошприц вместимостью 100 мм (или пипетка с делениями по ГОСТу 20292* исполнения 4 или 5, 1-го класса точности вместимостью 1 см )	+

Бумага фильтровальная (плотная, узкопористая, медленно фильтрующая для тонких осадков, типа "синяя лента")	-	-	-	-	+	+
Вата медицинская не стерилизованная, х/б	+
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ОП-3 осч. по ТУ 6-09-14-2167-84, ректифицированный	+
Ацетон, осч, по ТУ 6-09-3513-75 ОП-2, ректифицированный	-	+	-	-	-	-
Бензол, хч, по ГОСТу 5955-75, выдержанный над Na SO , ректифицированный	+	+	+	+	-	-
Гептан, гексан, хч, по ТУ 6-09-3375-78 или петролейный эфир (фракция 70-100), хч, ректифицированный	+	+	+	+	-	-
Пропанол-2 (изопропиловый спирт), хч, по ТУ 6-09-402-75, ректифицированный	-	-	-	-	+	+
Уксусная кислота ледяная, хч, по ГОСТу 61-75	+	+	+	+	-	-
Хлороформ, медицинский, выдержанный над CaCl , ректифицированный	-	-	-	-	+	+
Хлористый метилен (дихлорметан), выдержанный над CaCl , ректифицированный	+	+	-	-	-	-
Эфир диэтиловый, выдержанный над NaOH, ректифицированный	-	+	-	-	-	-
Этилацетат (этиловый эфир уксусной кислоты), хч, по ГОСТу 22300-76, выдержанный над Na CO и ректифицированный	-	+	-	-	-	-
Сульфат натрия, безводный, хч, по ГОСТу 4166-76	+	+	+	+	-	-
Хлорид натрия, хч, по ГОСТу 4233-77	+
Вода дистиллированная	+
Экстрагент - 84% ацетонитрила в воде, 840 см ацетонитрила доводятся до 1 литра водой либо получается путем ректификации с водой водно-ацетонитрильной смеси (1:4)	+
33% бензола в ацетонитриле - смешать 30 см бензола и 60 см ацетонитрила (1:2)	+	+	+	+	-	-
20% ацетонитрила в бензоле - 20 см ацетонитрила разбавить бензолом до 100 см	+	-	-	-	-	-
2% уксусной кислоты в бензоле - 2 см уксусной кислоты разбавить бензолом до 100 см	-	-	+	-	-	-
5% уксусной кислоты в бензоле - 5 см уксусной кислоты разбавить бензолом до 100 см	-	+	-	-	-	-
10% этилацетата в бензоле - 10 см этилацетата разбавить бензолом до 100 см	-	+	-	+	-	-
25% гексана в эфире - 25 см гексана разбавить диэтиловым эфиром до 100 см	-	+	-	-	-	-
10% ацетона в дихлорметане - 10 см ацетона разбавить дихлорметаном до 100 см	-	+	-	-	-	-
20% ацетона в дихлорметане - 20 см ацетона разбавить дихлорметаном до 100 см	-	-	-	-	+	-

5.2. Способ подготовки проб

Определяемые микотоксины извлекают

экстрагентом

из пробы при соотношении масса пробы - объем экстрагента 1:5. При определении афлатоксина В

и зеараленона проводят очистку водно-ацетонитрильного экстракта на патроне Диапак А-3, концентрируют микотоксины на патроне Диапак П-3, высушивают от остатков воды и после упаривания и перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак Н (Диапак С - в случае кукурузы и продуктов из нее). Фракционным элюированием получают две фракции, содержащие афлатоксин B

и зеараленон, готовые к хроматографическому анализу.

При определении дезоксиниваленола и Т-2 токсина, проводят предварительную очистку водно-ацетонитрильного экстракта на патроне Диапак АУ-3 и концентрируют упариванием досуха. После перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак Н. Фракционным элюированием получают две фракции, содержащие дезоксиниваленол и Т-2 токсин, готовые к хроматографическому анализу.

Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения микотоксинов проводят анализ пробы методом стандартной добавки в исходный экстракт. Основные характеристики пробоподготовки методом твердофазной экстракции приведены в табл.2.

Основные характеристики подготовки проб

Таблица 2

Микотоксин	Время пробоподготовки, мин	Степень извлечения, %	Относительное среднее квадратическое отклонение, %
Афлатоксин В	120	75	20
Зеараленон	120	70	20
Дезоксиниваленол	90	85	10
Т-2 токсин	90	85	10

Для достижения указанной степени извлечения необходимо точно выполнять требования к квалификации органических растворителей, их подготовке и приготовлению растворов, перечисленных в п.5.1. Алгоритм поиска возможных потерь целевых микотоксинов при подготовке проб приведен в прилож.1 к настоящим методическим указаниям.

5.3. Подготовка концентрирующих патронов

Патроны Диапак представляют собой пластиковую колонку, содержащую 1 или 3 см

герметично упакованного сорбента.

5.3.1. Концентрирующий патрон Диапак А-3

Вскрыть выходную линию патрона Диапак А-3, сняв полимерную заглушку. Установить патрон в вертикальном положении узким концом вниз в подходящее устройство для вакуумирования и сбора элюата. Осторожно открыть полимерную крышку патрона, сформировать ровный горизонтальный верхний слой сорбента легким постукиванием по патрону и зафиксировать его с помощью небольшого ватного тампона. Подключить вакуум к устройству для вакуумирования и обеспечить подачу вакуума к патрону.

Концентрирующий патрон Диапак А-3 одноразового применения и регенерации не подлежит.

5.3.2. Концентрирующий патрон Диапак АУ-3

Подготовка концентрирующего патрона Диапак АУ-3 проводится аналогично п.5.3.1.

Концентрирующий патрон Диапак АУ-3 одноразового применения и регенерации не подлежит.

5.3.3. Концентрирующий патрон Диапак П-3

Установить патрон Диапак П-3 вертикально в подходящее устройство для вакуумирования и открыть верхнюю крышку. Суспендировать сорбент при перемешивании стеклянной палочкой в 10 см

бензола, дать отстояться сорбенту и пропустить при слабом вакууме, не допуская попадания воздуха на сорбент, последовательно по 10 см

бензола и ацетона.

Сохранив слой ацетона около 2 см, ввести пористый полимерный фильтр (имеется в комплекте) и уплотнить его палочкой по верхнему слою сорбента. Затем пропустить оставшийся ацетон и последовательно по 10 см

экстрагента

и смеси

экстрагент

-вода (1:1), не допуская попадания воздуха на сорбент со скоростью 2-3 капли в секунду.

Сохранив слой последнего элюента около 2 см, отключить вакуум и заглушить патрон сначала верхней крышкой, а затем (после прекращения скапывания) и нижней заглушкой. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение рабочего дня, а при случайном пересыхании приводится в рабочее состояние прокачиванием 10 см

смеси

экстрагент

-вода (1:1).

Концентрирующий патрон Диапак П-3 многоразового применения и подлежит регенерации по схеме, как указано выше, после проведения пробоподготовки.

5.3.4. Концентрирующий патрон Диапак Н

Снять с патрона Диапак Н заглушки, пропустить через него с помощью шприца 5 см

бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25

С.

Концентрирующий патрон Диапак Н многоразового применения и подлежит регенерации по следующим схемам после проведения пробоподготовки:

после подготовки

пробы ДТ

- последовательно пропустить через патрон по 5 см

этилового спирта, ацетона и бензола;

после подготовки

пробы AЗ

- последовательно пропустить через патрон по 5 см

ацетона и бензола.

5.3.5. Концентрирующий патрон Диапак С

Снять с патрона Диапак С заглушки, пропустить через него с помощью шприца 5 см

С.

Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.

5.4. Экстракция микотоксинов

5.4.1. Зерно и зернопродукты

25 г размолотой пробы перенести в коническую колбу и залить 125 см

экстрагента

. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. Экстракт отфильтровать через бумажный фильтр "синяя лента".

5.4.2. Орехи и семена масличных культур

25 г размолотой пробы перенести в колбу Эрленмейера, добавить 125 см

экстрагента

и 40 см

гексана. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. После перемешивания внести в экстракт 1 г хлорида натрия и продолжить перемешивание в течение 5 мин. Отфильтровать через бумажный фильтр "синяя лента". Отфильтрованный экстракт перенести в делительную воронку и после расслоения раствора собрать нижний водно-ацетонитрильный слой. Ацетонитрильный экстракт обезжирить 25 см

гексана в делительной воронке вместимостью 250 см

Экстракт перенести в делительную воронку, добавить еще 25 см

гептана и интенсивно перемешать. После расслоения собрать нижний водно-ацетонитрильный экстракт.

5.4.3. Масло растительное

25 г масла перенести в колбу Эрленмейера, добавить 40 см

гексана и 125 см

экстрагента

. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. После перемешивания в экстракт внести 0,2 г хлористого натрия и продолжить перемешивание в течение 3-5 мин. Экстракт перенести в делительную воронку и после расслоения смеси собрать нижний водно-ацетонитрильный слой. Ацетонитрильный экстракт обезжирить 25 см

гексана или гептана или петролейного эфира в делительной воронке вместимостью 250 см

Экстракт перенести в делительную воронку, добавить еще 25 см

гептана и интенсивно перемешать. После расслоения собрать нижний водно-ацетонитрильный экстракт.

5.5. Очистка и концентрирование проб

5.5.1. Очистка и концентрирование пробы при определении афлатоксина

и зеараленона

5.5.1.1. Предварительная очистка и концентрирование пробы

25 см

обезжиренного экстракта пропустить через патрон Диапак А-3 со скоростью 2

3 капли в секунду и отобрать 20 см

элюата.

Полученный элюат объемом 20 см

разбавить равным объемом воды. Полученный раствор пропустить через патрон Диапак П-3 со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего патрон промыть 5 см

воды и продуть воздухом в течение 1 мин.

Целевую фракцию элюировать с патрона Диапак П-3 последовательно 7 см

ацетонитрила и 7 см

33%-ного бензола в ацетонитриле

- со скоростью 1-2 капли в секунду. Собранный элюат пропустить через слой безводного сульфата натрия (10 г) самотеком. Колбу ополоснуть 2 см

33%-ного бензола в ацетонитриле

и содержимое перенести на тот же слой безводного сульфата натрия. Промыть сульфат натрия 3 см

33%-ного бензола в ацетонитриле

. Высушенный фильтрат упарить досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40

С и немедленно перерастворить в 0,5 см

бензола.

5.5.1.2. Окончательная очистка на патроне Диапак Н (вариант 1)

Бензольный раствор нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак Н. Колбу, содержавшую сухой остаток, обмыть еще 2 раза по 0,5 см

бензола и последовательно нанести растворы на патрон Диапак Н. Все смывы с патрона отбросить.

Зеараленон элюировать с патрона Диапак Н 4 см

2%-ной уксусной кислоты в бензол

е и упарить досуха (до исчезновения запаха уксусной кислоты) на ротационном испарителе при температуре не выше 50

С (

Проба З

). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.

Затем элюировать афлатоксин В

5 см

20%-ного ацетонитрила в бензоле

с патрона и упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40

С (

Проба А

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ афлатоксина В

, - 4 г.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ зеараленона,

, - 4 г.

5.5.1.3. Окончательная очистка на патроне Диапак С (вариант 2)

Рекомендуется для кукурузы и продуктов из нее.

Бензольный раствор нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак С. Колбу, содержавшую сухой остаток, обмыть еще 2 раза по 0,5 см

бензола и нанести растворы на патрон Диапак С при достижении верхнего фильтра патрона уровнем предыдущей порции раствора. Все смывы с патрона отбросить.

Зеараленон элюировать с патрона Диапак С 6 см

10%-ного этилацетата в бензоле

и упарить досуха (до исчезновения запаха бензола) на ротационном испарителе при температуре не выше 50

С (

Проба З

Затем через патрон Диапак С последовательно пропустить 3 см

5%-ной уксусной кислоты в бензоле

и 4 см

25%-ного гексана в эфире

. Все элюаты отбросить. Афлатоксин В

элюировать с патрона 6 см

10%-ного ацетона в дихлорметане

. Элюат упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40

С (

Проба А

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ афлатоксина В

, - 4 г.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ зеараленона,

, - 4 г.

5.5.2. Очистка и концентрирование пробы при определении дезоксиниваленола и Т-2 токсина

5.5.2.1. Предварительная очистка и концентрирование пробы

20 см

экстракта пропустить через патрон Диапак АУ-3 со скоростью 2

3 капли в секунду. Элюат собрать. Патрон промыть 5 см

экстрагента

и отфильтровать объединенные элюаты в сердцевидную колбу, фильтр промыть 2 см

ацетонитрила, собирая промывочную жидкость в ту же колбу. Упарить досуха на ротационном испарителе при температуре около 60

С. Упаривание повторить 2-3 раза с добавлением в колбу 3

5 см

пропанола-2 или ацетонитрила до исчезновения капель воды на стенках колбы (

Проба ДТ

5.5.2.2. Окончательная очистка на патроне Диапак Н

Пробу ДТ

растворить в 0,5 см

хлороформа и нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак Н. Колбу обмыть еще 2 раза по 0,5 см

хлороформа и последовательно нанести растворы на тот же патрон, начав сбор фракций, содержащих Т-2 токсин, в отгонную колбу. Завершить элюирование Т-2 токсина 2 см

хлороформа в ту же колбу. Элюат упарить досуха на ротационном испарителе при температуре 40

С и перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению Т-2 токсина (

Проба Т

Дезоксиниваленол элюировать с патрона в другую отгонную колбу 6 см

20%-ного ацетона в хлороформе

. Элюат упарить досуха на ротационном испарителе при температуре 40

С и перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению дезоксиниваленола (

Проба Д

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ дезоксиниваленола,

, - 4 г.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ Т-2 токсина,

, - 4 г.

6. Афлатоксин

6.1. Оборудование, материалы, реактивы

Испаритель ротационный ИР-1М2 или устройство для упаривания проб в токе азота при нагревании около 40 °С		ТУ 25-1173.102-84 или др.
Центрифуга типа ЦЛН-2, или аналогичная Устройство для создания вакуума около -0,7 мм рт.ст. (водоструйный насос, масляный вакуумный насос, медицинский отсасыватель) Вакуумное устройство для подготовки проб (вакуумный манифолд), с приемниками проб вместимостью не менее 10 см		ТУ 5-375-4171-73
Концентрирующий патрон Диапак С16М, ЗАО "БиоХимМак СТ"		ТУ 4215-002-05451931-94
Концентрирующий патрон Диапак С, ЗАО "БиоХимМак СТ" Пинцет медицинский, 15 см Шприц вместимостью 10 или 20 см типа Луер		ТУ 4215-002-05451931-94
Колбы плоскодонные конические с пробками, вместимостью 50 см		ГОСТ 25336
Колбы остродонные с пробками, с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 10 или 25 см		ГОСТ 25336
Колбы грушевидные с пробками, с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 25 см		ГОСТ 25336
Цилиндры мерные вместимостью 50 см , 2 кл, или пробирка градуированная вместимостью 15 или 20 см		ГОСТ 1770
Микрошприц вместимостью 100 мм или пипетка с делениями исполнения 4 или 5, 1-го класса точности вместимостью 1 см Вата медицинская не стерилизованная, х/б		ГОСТ 20292
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ОП-3, осч, ректифицированный или Ацетонитрил, 1 сорт, кооператив "Криохром", г.Санкт-Петербург		ТУ 6-09-14-2167-84
Ацетон, осч, ОП-2, ректифицированный		ТУ 6-09-3513-75
Гептан, гексан, хч, или петролейный эфир (марки 70-100), ректифицированный		ТУ 6-09-3375-78
Кислота лимонная, 1-водная, чда		ГОСТ 3652-29
Хлорид натрия, хч Хлороформ медицинский, выдержанный над CaCl , ректифицированный		ГОСТ 4233-77
Сульфат натрия, безводный, хч Вода дистиллированная		ГОСТ 4166-76

20% ацетона в хлороформе

- к 20 см

ацетона добавить хлороформ до 100 см

общего объема или

5% метанола в хлороформе

- к 20 см

хлороформа добавить 5 см

метанола, объем раствора довести хлороформом до 100 см

6.2. Способ подготовки проб

Афлатоксин M

извлекают из пробы жидкого молока пропусканием ее через патрон Диапак С16М. Затем фракцию, содержащую афлатоксин M

, элюируют хлороформом с патрона и, после высушивания и упаривания, проводят окончательную очистку на патроне Диапак С. Подготовленная проба готова к хроматографическому анализу.

Афлатоксин M

, из кисломолочных напитков и сметаны экстрагируют хлороформом в присутствии хлорида натрия и лимонной кислоты в соответствии с МУ N 4082-86* и, после высушивания и упаривания, проводят окончательную очистку на патроне Диапак С.

Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения микотоксинов проводят анализ методом стандартной добавки в исходный экстракт.

Время проведения пробоподготовки - 60 мин. Степень извлечения** - 80%. Относительное среднее квадратическое отклонение - 10%.

________________

* Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов и продовольственном сырье и пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Утв. МЗ СССР 20.03.86 N 4082-86.

** При снижении степени извлечения афлатоксина М

см. прилож.1.

6.3. Подготовка концентрирующих патронов

6.3.1. Концентрирующий патрон Диапак С16М

Снять с патрона Диапак С16М заглушки и пропустить через него с помощью шприца последовательно по 5 см

ацетонитрила и воды. Заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25

С.

Концентрирующий патрон Диапак С16М одноразового применения и регенерации не подлежит.

6.3.2. Концентрирующий патрон Диапак С

Снять с патрона Диапак С заглушки и пропустить через него с помощью шприца 5 см

С.

Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.

6.4. Подготовка проб молочных продуктов к анализу

6.4.1. Подготовка, концентрирование и очистка проб молока

Пробу молока 50 см

центрифугировать на подходящем оборудовании в течение 5 мин при 1000 об/мин. Для определения афлатоксина M

отобрать 20 см

супернатанта, избегая попадания жира.

Сухое молоко растворяется в соответствии с инструкцией или соответствующим ТУ и обрабатывается, как описано выше.

20 см

подогретой до 40

С подготовленной пробы молока пропустить через предварительно подготовленный патрон Диапак С16М со скоростью 3 капли в секунду. Затем патрон промыть 5 см

дистиллированной воды и высушить продуванием воздуха в течение 1 мин. Элюаты отбросить. Патрон промыть 10 см

гексана и вновь высушить воздухом в течение 1 мин.

Афлатоксин М

элюировать 6 см

хлороформа. Собранный элюат пропустить самотеком через слой безводного сульфата натрия (3 см

). Колбу обмыть 1 см

хлороформа и содержимое перенести на тот же слой безводного сульфата натрия. Хлороформные растворы собрать (

Экстракт M

6.4.2. Подготовка проб сметаны и кисломолочных продуктов

В коническую колбу вместимостью 250 см

помещают навеску 20,0 г сметаны или 40 см

кисломолочного напитка. Затем туда же вносят 10,0 см

водного раствора 2 г хлорида натрия и 0,24 г лимонной кислоты и 100 см

хлороформа (все составные части предварительно подогревают до температуры 35

С). Содержимое колбы встряхивают 2

3 мин, переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют 15 мин при 3000-4000 об/мин. Отделяют нижний хлороформный слой, высушивают над 10 г безводного сульфата натрия, отфильтровывают, измеряют объем фильтрата

и упаривают до 5

6 см

(

Экстракт М

6.5. Окончательная очистка пробы

Экстракт М

нанести на патрон Диапак С со скоростью 3

4 капли в секунду. Промыть сульфат натрия 1 см

хлороформа и раствор нанести на патрон Диапак С при достижении верхнего фильтра патрона уровнем предыдущей порции раствора.

Афлатоксин М

элюировать с патрона 10 см

20%-ного ацетона в хлороформе

или 7 см

5%-ного метанола в хлороформе

. Элюат собрать и упарить досуха на ротационном испарителе или в слабом токе азота при температуре не выше 40

С. Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению (

Проба М

Эквивалент массы пробы молока, взятой на анализ афлатоксина M

, М

- 20 г.

Эквивалент массы пробы сухого молока рассчитывается по формуле:

, (6.1)

где

- эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;

- масса пробы сухого молока, г;

- объем воды для растворения пробы сухого молока, см

Эквивалент массы пробы сметаны или кисломолочных напитков, взятой на анализ, рассчитывается по формуле:

, (6.2)

где

- эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;

- объем фильтрата, см

;

- масса (объем) пробы сметаны или кисломолочных напитков, г (см

7. Патулин

7.1. Оборудование, материалы, реактивы

Испаритель ротационный ИР-1М2		ТУ 25-1173.102-84 или др.
Центрифуга типа ЦЛН-2, или аналогичная Устройство для создания вакуума около -0,7 мм рт.ст. (водоструйный насос, масляный вакуумный насос, медицинский отсасыватель) Вакуумное устройство для подготовки проб (вакуумный манифолд), с приемниками проб вместимостью не менее 10 см Устройство для упаривания проб в токе азота при нагревании около 40 °С (желательно суховоздушная баня)		ТУ 5-375-4171-73
Концентрирующий патрон Диапак П-3, ЗАО "БиоХимМак СТ"		ТУ 4215-002-05451931-94
Концентрирующий патрон Диапак С, ЗАО "БиоХимМак СТ" Пинцет медицинский, 15 см		ТУ 4215-002-05451931-94
Колбы плоскодонные конические с пробками вместимостью 50 см		ГОСТ 25336
Колбы остродонные с пробками с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 5, 10 или 25 см		ГОСТ 25336
Колбы грушевидные с пробками с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 25 см		ГОСТ 25336
Пробирка градуированная вместимостью 15 или 20 см		ГОСТ 1770
Цилиндры мерные вместимостью 10 и 50 см , 2 кл		ГОСТ 1770
Микрошприц вместимостью 100 мм (или пипетка с делениями исполнения 4 или 5, 1-го класса точности вместимостью 1 см ) Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ Вата медицинская нестерилизованная, х/б		ГОСТ 20292
Ацетат цинка 2-водный, чда		ГОСТ 5823
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ОП-3 осч, ректифицированный		ТУ 6-09-14-2167-84
Ацетон, осч, ректифицированный, ОП-2		ТУ 6-09-3513-75
Бензол, хч, ректифицированный		ГОСТ 5955-75
Гексацианоферат II калия (калий железистосинеродистый) 3-водный, хч		ГОСТ 4207
Гептан, гексан, хч, или петролейный эфир (фракция 70-100), хч, ректифицированный Хлороформ, медицинский, выдержанный над CaCl , ректифицированный		ТУ 6-09-3375-78
Этилацетат (этиловый эфир уксусной кислоты), хч, выдержанный нaд Na CO и ректифицированный		ГОСТ 22300-76
Карбонат натрия, хч		ГОСТ 83-79
Сульфат натрия, безводный, хч Вода бидистиллированная		ГОСТ 4166-76

1,5% карбоната натрия

- 1,5 г карбоната натрия растворить в 100 см

воды.

15% этилацетата в бензоле

- 15 см

этилацетата разбавить бензолом до 100 см

30% этилацетата в бензоле

- 30 см

этилацетата разбавить бензолом до 100 см

Раствор Карреза I

- 15,0 г гексацианоферата II калия растворить в 100 см

воды.

Раствор Карреза II

- 30,0 г ацетата цинка растворить в 100 см

воды.

7.2. Способ подготовки проб

Микотоксин патулин извлекают из проб осветленных соков и напитков пропусканием их через патрон Диапак П-3. Затем патулин элюирут этилацетатом с патрона и после обработки раствором Na

, высушивания, упаривания и перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак С.

Соки и напитки с мякотью и консистентные продукты разводят водой, осветляют растворами Карреза в соответствии с ГОСТом 28038-89*, фильтруют и экстрагируют патулин пропусканием фильтрата через патрон Диапак П-3, Затем патулин элюирут этилацетатом с патрона и после обработки раствором Na

, высушивания, упаривания и перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак С.

________________

* Продукты переработки плодов и овощей. Метод определения микотоксина патулина. ГОСТ 28038-89.

Подготовленные пробы готовы к хроматографическому анализу.

Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения патулина проводят анализ методом стандартной добавки в пробу.

Время проведения пробоподготовки - 90 мин. Степень извлечения* - 60%. Относительное среднее квадратическое отклонение - 10%.

________________

* При снижении степени извлечения патулина см. прилож.1.

7.3. Подготовка концентрирующих патронов

7.3.1. Концентрирующий патрон Диапак П-3

бензола, дать отстояться сорбенту и пропустить при слабом вакууме, не допуская попадания воздуха, последовательно по 10 см

бензола и ацетона.

экстрагента

(см. п.5.1) и смеси

экстрагент

-вода (1:1), не допуская попадания воздуха на сорбент со скоростью 2-3 капли в секунду.

смеси

экстрагент

-вода (1:1).

Перед проведением пробоподготовки через патрон Диапак П-3 пропустить 10 см

воды.

Концентрирующий патрон Диапак П-3 многоразового применения и подлежит регенерации после проведения пробоподготовки по схеме его подготовки, как указано выше.

7.3.2. Концентрирующий патрон Диапак С

Снять с патрона Диапак С заглушки и пропустить через него с помощью шприца 5 см

С.

Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.

7.4. Подготовка проб к анализу

7.4.1. Подготовка осветленных соков и напитков

Отфильтровать пробу через плотный бумажный фильтр до получения 20 см

фильтрата (

Фильтрат П

7.4.2. Подготовка соков и напитков с мякотью и консистентных продуктов

Навеску пробы массой 10,0 г поместить в стеклянный стакан, смешать с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 см

. В мерную колбу внести 6,0 см

раствора Карреза I

и 6,0 см

раствора Карреза II

. Содержание колбы довести дистиллированной водой до метки, тщательно перемешать и отфильтровать в мерный цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Измерить объем фильтрата (

Фильтрат П

7.5. Концентрирование и очистка пробы

7.5.1. Концентрирование пробы на патроне Диапак П-3

Весь объем

Фильтрата П

нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак П-3 со скоростью 1-2 капли в секунду. Промыть патрон 5 см

бидистиллированной воды. Все смывы отбросить.

Патулин элюировать с патрона 10 см

этилацетата в колбу или мерную пробирку с пришлифованной пробкой, содержащую 5 см

1,5%-ного карбоната натрия

, закрыть пробкой, интенсивно перемешать и дать отстояться. Декантировать верхний этилацетатный слой, высушить его безводным сульфатом натрия (3 г) и перенести в колбу для упаривания. В колбу или пробирку, содержащую оставшийся

1,5%-ный карбонат натрия

, добавить еще 10 см

этилацетата, перемешать и, после полного расслоения, высушивания этилацетатного слоя тем же сульфатом натрия, объединить его с первой порцией этилацетатного раствора в той же колбе для упаривания. Операцию повторить с 5 см

этилацетата.

Упарить этилацетатный раствор на ротационном испарителе при температуре не выше 40

С до объема около 0,5 см

(

не упаривать досуха!

). Количественно перенести пробу в сердцевидную колбу вместимостью не более 5 см

или в полимерную пробирку типа Эппендорф, промыв предыдущую отгонную колбу 0,5 см

этилацетата, и присоединить к упариваемой пробе. Пробу упарить в токе азота при температуре не более 40

С в суховоздушной бане до 0,5 см

и добавить к ней 2,5 см

бензола.

7.5.2. Окончательная очистка пробы на патроне Диапак С

Бензол-этилацетатный раствор пропустить через патрон Диапак С со скоростью 1

2 капли в секунду. Обмыть колбу еще 0,5

1,0 см

15%-ного этилацетата в бензоле

и нанести на патрон. Все смывы отбросить.

Патулин элюировать с патрона 6 см

30%-ного этилацетата в бензоле

, собирая элюат в сердцевидную отгонную колбу. Элюат упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40

С в суховоздушной бане.

Внимание!

После упаривания пробу

немедленно

перерастворить в 100 мкл хлороформа, охлажденного до 0

С (для ТСХ-анализа) или в 100

500 мкл охлажденной до 5

С бидистиллированной воды, подкисленной до рН 4,0 уксусной кислотой (для ВЭЖХ-анализа) и быстро охладить до 0

С (

Проба П

). Хранить

Пробу П

в холодильнике не более 1 ч.

Эквивалент массы пробы осветленных соков и напитков, взятой на анализ,

, - 20 г, соков и напитков с мякотью и консистентных продуктов определяется по формуле:

, (7.1)

где

- эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;

- объем

Фракции П

, см

;

- масса пробы соков и напитков с мякотью или консистентных продуктов, г.

Приложение 1

Рекомендуемая методика испытаний концентрирующих патронов Диапак

Введение

Каждая партия концентрирующих патронов Диапак П-3, Диапак С16М, Диапак Н, Диапак С, а также партии сорбентов Диасорб А и Диасорб АУ подвергаются выходному контролю в соответствии с ТУ 4215-002-05451931-94 на их соответствие требованиям, предъявляемым к специализированным патронам для твердофазной экстракции микотоксинов. Этим метрологически обеспечивается их производство.

Применение настоящих испытаний рекомендуется проводить в следующих случаях:

если результат проверки правильности проведения пробоподготовки методом стандартной добавки не соответствует нормативу коэффициента извлечения;

если патроны Диапак подвергались неправильному хранению или нарушена целостность упаковки;

в случаях дополнительного сверхнормативного использования регенерируемых патронов (Диапак Н, Диапак П-3).

Приведенные ниже методики проверки патронов Диапак позволяют выявить ошибку по стадиям пробоподготовки. При соответствии характеристик патронов Диапак нормативным требованиям следует искать ошибки в правильности подготовки растворителей и приготовлении растворов, контроле условий упаривания и перерастворения анализируемых проб.

Если среди стадий подготовки пробы присутствует подготовка на патроне Диапак С, рекомендуется начинать анализ возможной потери целевого компонента именно с этого патрона. Это связано с чувствительностью силикагеля к качеству используемых растворителей и прежде всего с содержанием в них воды. Такая специфика сильной зависимости активности патрона Диапак С от условий его хранения и качества используемых растворителей может потребовать оптимизации количества элюента, используемого при работе с этими патронами в конкретной лаборатории.

Общая часть

Настоящая методика предназначена для метрологического обеспечения применения патронов Диапак в анализе микотоксинов и устанавливает процедуру их испытаний. Критерием качества патронов Диапак является соответствие результатов испытаний нормативам коэффициента извлечения,

, в модельных экспериментах в соответствии со схемами элюирования, приведенными в разделах 5-7 настоящих методических указаний.

Коэффициент извлечения рассчитывают по формуле:

, (1)

где

- коэффициент извлечения данных микотоксинов, %;

- концентрация данного микотоксина, найденная в результате испытания, мкг/см

; (или

площадь хроматографического пика, соответствующая концентрации

);

- концентрация того же микотоксина, используемая для градуировки хроматографической системы, мкг/см

; (или

площадь хроматографического пика, соответствующая концентрации

);

- коэффициент разведения образца.

За окончательное значение

принимается среднее арифметическое результатов двух параллельных испытаний, если абсолютное расхождение между ними не превышает 5%.

Испытания проводятся относительным методом по схеме "введено-найдено", поэтому специальных требований к стандартным образцам микотоксинов не предъявляется.

1. Испытание патронов Диапак А-3 и Диапак П-3 по афлатоксину В

и зеараленону

Испытание патронов Диапак А-3 проводится совместно с Диапак П-3 из-за низких концентраций афлатоксина В

и зеараленона, а также их температурной лабильности, приводящей к невозможности концентрирования упариванием. Патрон Диапак П-3 может быть испытан независимо от Диапак А-3, что рекомендуется выполнять потребителю через каждые 10 проб после соответствующей регенерации по п.5.3.3.

Приготовить из имеющихся стандартных растворов микотоксинов 1,0 см

испытательной смеси, содержащей 0,4 мкг афлатоксина В

и 4,0 мкг зеараленона в произвольной смеси бензола и ацетонитрила. Аликвоту смеси объемом 0,25 см

перенести в сердцевидную колбу и упарить растворители досуха в токе азота при температуре 40

С. Немедленно перерастворить остаток в 0,25 см

растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению. Ориентировочные значения концентраций: 0,4 мкг/см

- для афлатоксина B

и 4,0 мкг/см

- для зеараленона. Ввести раствор не менее двух раз в хроматографическую систему и рассчитать среднее арифметическое значение площадей пиков каждого из микотоксинов,

Подготовить патроны Диапак А-3 и Диапак П-3 в соответствии с п.п.5.3.1 и 5.3.3.

Вторую аликвоту смеси объемом 0,25 см

упарить аналогично, перерастворить в 25 мл

экстрагента

(смеси ацетонитрил-вода - 84:16) и нанести на патрон Диапак А-3 в соответствии с п.5.1.1. Полученные 20 мл элюата сконцентрировать на патроне Диапак П-3 в соответствии с п.5.1.1. Концентрат перерастворить и проанализировать аналогично градуировочному эксперименту, получив значение

Рассчитать значение

по формуле (1). Значение

1,25. Коэффициент извлечения,

, должен быть не менее 90% - для афлатоксина В

и 85% - для зеараленона.

При испытании одного патрона Диапак П-3 вторую аликвоту объемом 0,25 см

после упаривания перерастворить в 40 мл смеси

экстрагент

-вода (1:1) (смеси ацетонитрил-вода 42:58) и сконцентрировать в соответствии с п.5.1.1. Рассчитать значение

, принимая

1,00. Коэффициент извлечения,

, должен быть не менее 95% - для афлатоксина В

и 95% - зеараленона.

2. Испытание патронов Диапак АУ-3 по дезоксиниваленолу и Т-2 токсину

Приготовить из имеющихся стандартных растворов микотоксинов 1,0 см

испытательной смеси, содержащей по 20 мкг дезоксиваленола и Т-2 токсина в произвольной смеси бензола и ацетонитрила. Аликвоту смеси объемом 0,25 см

перенести в сердцевидную отгонную колбу и упарить досуха на ротационном испарителе при температуре 40

С. Перерастворить остаток в 0,25 см

растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению. Ориентировочное значение концентраций: 20 мкг/см

- для дезоксиниваленола и Т-2 токсина. Для градуировки хроматографической системы ввести раствор не менее двух раз и рассчитать среднее арифметическое значение площадей пиков каждого из микотоксинов,

Подготовить патрон Диапак АУ-3 по п.5.3.2.

Вторую аликвоту смеси объемом 0,25 см

упарить аналогично, перерастворить в 20 мл

экстрагента

(смеси ацетонитрил-вода 84:16) и нанести на патрон Диапак АУ-3, в соответствии с п.5.5.2. После упаривания досуха остаток перерастворить и проанализировать аналогично градуировочному эксперименту, получив значение

. Рассчитать значение

по формуле 1. Значение

1,00.

Коэффициент извлечения

должен быть не менее 95% - для дезоксиниваленола и Т-2 токсина.

3. Испытания патрона Диапак Н

Концентрирующие патроны Диапак Н являются универсальными регенерируемыми патронами для окончательной очистки афлатоксина В

, зеараленона, дезоксиниваленола и Т-2 токсина, поэтому испытание рекомендуется выполнять через каждые 10 проб после очередной регенерации по п.5.3.4. Патроны Диапак Н обеспечивают тонкую очистку указанных микотоксинов с высокими метрологическими характеристиками (

не менее 90%), поэтому значения

менее 90% чаще всего свидетельствуют об ошибках в приготовлении элюентов или о недостаточной чистоте растворителей.

3.1. Испытание по афлатоксину В

и зеараленону

Сухой остаток упаренной второй аликвоты испытательной смеси по п.1 немедленно перерастворить в 0,5 мл бензола и нанести по условиям п.5.1.2 на подготовленный (см. п.5.3.4) патрон Диапак Н. После элюирования и упаривания

Пробы З

Пробы А

немедленно перерастворить их в 0,25 см

растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению, и проанализировать аналогично градуировочному эксперименту по п.1, получив значение

по каждому из микотоксинов.

Рассчитать значение

по формуле (1). Значение

1,00. Коэффициент извлечение

должен быть не менее 90% - для афлатоксина В

и зеараленона.

3.2. Испытания по дезоксиниваленолу и Т-2 токсину

Сухой остаток упаренной второй аликвоты испытательной смеси по п.2 перерастворить в 0,5 мл хлороформа и нанести по условиям п.5.1.2 на подготовленный патрон Диапак Н. После элюирования и упаривания

Пробу Д

Пробу Т

перерастворить в 0,25 см

растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению, и проанализировать аналогично градуировочному эксперименту по п.2, получив значения

по каждому из микотоксинов.

Рассчитать значения

по формуле (1). Значение

1,00. Коэффициент извлечения

должен быть не менее 90% для дезоксиниваленола и Т-2 токсина.

4. Испытания патрона Диапак С

Концентрирующие патроны Диапак С являются одноразовыми патронами для окончательной очистки афлатоксина В

и зеараленона, а также афлатоксина М

и патулина. Патроны Диапак С обеспечивают тонкую очистку указанных микотоксинов с хорошими метрологическими характеристиками (

90%). Для достижения указанных характеристик необходимо установить оптимальный объем элюирования моделированием порционного элюирования (1

3 порции по 3 мл) целевых фракций в ходе настоящих испытаний.

Оптимальную схему элюирования, т.е. необходимое число порций по 3 мл, потребитель устанавливает по достижению суммарного коэффициента извлечения не ниже указанного норматива. Установленный объем элюирования подлежит проверке при смене партии растворителей и их смесей, используемых для тонкой очистки микотоксинов.

4.1. Испытания по афлатоксину В

и зеараленону

Подготовить патрон Диапак С в соответствии с п.5.3.5.

Сухой остаток упаренной второй аликвоты испытательной смеси по п.1 немедленно перерастворить в 0,5 мл бензола и нанести на патрон Диапак С в соответствии с п.5.1.3. После элюирования и раздельного упаривания трех фракций

Пробы З

и трех фракций

Пробы А

немедленно перерастворить их в 0,25 см

растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению, и проанализировать аналогично градуировочному эксперименту по п.1, получив по три значения

и одному

по каждому из микотоксинов.

Рассчитать

по формуле (1) для каждой из трех фракций

Проб З

1,00. Суммарный коэффициент извлечения

должен быть не менее 90% - для афлатоксина В

и 85% - для зеараленона. Определить минимально возможное число последовательных фракций, обеспечивающее суммарный

не ниже норматива. Найденное число фракций (от 1 до 3 ) и определяет оптимальный объем элюирования данных микотоксинов с патрона Диапак С данной партии с приготовленными растворителями.

Если значение суммарного

меньше нормативного значения, то это свидетельствует об ошибках в приготовлении элюирующих смесей и/или о недостаточной чистоте растворителей, в особенности с точки зрения содержания в них воды.

4.2. Испытание по афлатоксину М

Приготовить из имеющегося стандартного раствора 1,0 см

испытательной смеси, содержащей 0,1 мкг афлатоксина М

в произвольной смеси бензола и ацетонитрила. Аликвоту смеси объемом 0,25 см

перенести в сердцевидную колбу и упарить раствор в токе азота при температуре 40

С. Немедленно перерастворить остаток в 0,25

1,0 см

растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению. Ориентировочные значения концентраций афлатоксина М

0,025

0,1 мкг/см

соответственно. Для проведения градуировочного эксперимента ввести раствор не менее двух раз в хроматографическую систему и рассчитать среднее арифметическое значение площадей пиков афлатоксина М

Вторую аликвоту смеси объемом 0,25 см

упарить, как описано выше, перерастворить в 6 мл хлороформа и нанести в условиях п.6.5 на подготовленный (см. п.6.3.2)

патрон Диапак С. После элюирования и раздельного упаривания трех последовательных фракций

Пробы М

немедленно перерастворить их в 0,25

1,0 см

растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению, и проанализировать аналогично градуировочному эксперименту, получив три значения

по афлатоксину M

Рассчитать

по формуле (1) для каждой их трех фракций

Пробы М

1,00. Суммарный коэффициент извлечения

для афлатоксина M

должен быть не менее 85%. Найти оптимальный объем элюирования афлатоксина М

с патрона Диапак С по алгоритму, приведенному в п.4.1. Там же приведен алгоритм поиска ошибок.

4.3. Испытание по патулину

Приготовить из имеющегося стандартного раствора 1,0 см

испытательной смеси, содержащей 4,0 мкг патулина в произвольной смеси бензола и ацетонитрила. Аликвоту смеси объемом 0,25 см

перенести в сердцевидную колбу и упарить растворитель в токе азота при температуре 35

С. Немедленно перерастворить остаток в 0,25 см

растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению. Ориентировочное значение концентрации патулина: 4,0 мкг/см

. Для проведения градуировочного эксперимента ввести раствор не менее двух раз в хроматографическую систему и рассчитать среднее арифметическое значение площади пика патулина,

Вторую аликвоту смеси объемом 0,25 см

упарить аналогично, перерастворить в 3 мл

15%-ного этилацетата в бензоле

и нанести в условиях п.7.5.2 на подготовленный (см. п.7.3.2) патрон Диапак С. После элюирования и раздельного упаривания трех последовательных фракций

Пробы П

немедленно перерастворить их в 0,25 см

растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению, и проанализировать аналогично градуировочному эксперименту по п.4.3, получив три значения

по патулину.

Рассчитать значение

по формуле (1) для каждой их трех фракций

Пробы П

1,00. Суммарный коэффициент извлечения

для патулина должен быть не менее 75%. Найти оптимальный объем элюирования патулина с патрона Диапак С по алгоритму, приведенному в п.4.1. Там же приведен алгоритм поиска ошибок.

5. Испытание патрона Диапак П-3 по патулину

Вторую аликвоту испытательной смеси по п.4.3 объемом 0,25 см

после упаривания перерастворить в охлажденной до 5

С воде, подкисленной уксусной кислотой до рН 4,0, и сконцентрировать в условиях п.7.5.1 на подготовленном (см. п.7.3.1) патроне Диапак П-3. После элюирования и высушивания упарить этилацетатный экстракт досуха в токе азота при температуре 35

С, немедленно перерастворить в 0,25 см

растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению, и проанализировать аналогично градуировочному эксперименту по п.4.3, получив значения

Рассчитать значение

по формуле (1). Значение

1,00. Коэффициент извлечения

для патулина должен быть не менее 80%.

6. Испытание патрона Диапак С16М по афлатоксину M

Вторую аликвоту испытательной смеси по п.4.2 объемом 0,25 см

после упаривания перерастворить в 20 мл

5%-ного ацетонитрила в воде

и нанести в соответствии с п.6.4.1 на подготовленный по п.6.3.1 патрон Диапак С16М. После элюирования и высушивания упарить хлороформный

экстракт М

на ротационном испарителе при температуре не выше 40

С, немедленно перерастворить его в 0,25-1,0 см

растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению, и проанализировать аналогично градуировочному эксперименту по п.4.2, получив значения

для афлатоксина M

. Рассчитать

по формуле (1)

1,00. Коэффициент извлечения,

, по афлатоксину M

должен быть не менее 95%.