ГОСТ Р 50929-96
Группа С19
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРЕМИКСЫ
Методы определения витаминов группы В
Premixes. Methods for determination of vitamin В complex
ОКС 65.120.19*
ОКСТУ 9209
Дата введения 1997-01-01
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Акционерным обществом открытого типа "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (АООТ "ВНИИКП")
Нижегородским государственным техническим университетом
ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, БВД, премиксы"
2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 июля 1996 г. N 488
3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Настоящий стандарт распространяется на премиксы и устанавливает методы определения витаминов В
, В
, холинхлорида, В
химическими методами и высокоэффективной жидкостной хроматографией.
2 НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 61-75 Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 246-76 Гидросульфит натрия технический. Технические условия
ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия
ГОСТ 2603-79 Ацетон. Технические условия
ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4109-79 Бром. Технические условия
ГОСТ 4139-75 Калий роданистый. Технические условия
ГОСТ 4166-76 Натрий серно-кислый. Технические условия
ГОСТ 4174-77 Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия
ГОСТ 4201-79 Натрий углекислый кислый. Технические условия
ГОСТ 4204-77 Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4206-75 Калий железосинеродистый. Технические условия
ГОСТ 4234-77 Калий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 4530-76 Кальций углекислый. Технические условия
ГОСТ 6016-77 Спирт изобутиловый. Технические условия
ГОСТ 6217-74 Уголь активный древесный дробленый. Технические условия
ГОСТ 6552-80 Кислота ортофосфорная. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 9337-79 Натрий фосфорнокислый 12-водный. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
ГОСТ 19908-90 Тигли, чаши, стаканы, колбы, воронки, пробирки и наконечники из прозрачного кварцевого стекла. Общие технические условия
ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 25664-83 Метол (4-метиламинофенол сульфат). Технические условия
ГОСТ 26573.0-85. Премиксы. Технические условия
ГОСТ 27067-86 Аммоний роданистый. Технические условия
ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 29228-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания
ГОСТ 29251-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 29252-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 2. Бюретки без времени ожидания
3 ОТБОР ПРОБ
Отбор проб по ГОСТ 13496.0
4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА B
Сущность метода заключается в извлечении витамина В
(тиамина) из навески анализируемого продукта раствором серной кислоты, окислении его раствором железосинеродистого калия в тиохром, экстракции окисленной формы из водной фазы изобутиловым спиртом и измерении интенсивности флуоресценции.
4.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104*.
Флуорометр Квант-7, ФАНК-1
Аппарат для встряхивания жидкости типа АВУ-1
Колбы мерные 2-50(100)-1(2) по ГОСТ 1770.
Воронки стеклянные типа В по ГОСТ 25336.
Пробирки П-1(2)-25-0,2 по ГОСТ 1770.
Шкаф сушильный с терморегулятором, обеспечивающий постоянство температуры (105±2) °С.
Воронки делительные типа ВД вместимостью 100 см
Стаканы В-1-100ТХС по ГОСТ 25336.
Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-1(2), 6(7)-1(2)-5(10) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Цилиндры 1(2, 3, 4)-25(50, 100) по ГОСТ 1770.
Фильтры обеззоленные (красная лента) по нормативному документу [3].
Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор молярной концентрации 
(
H
SO
)=0,1 моль/дм
.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор в соотношении 1:1 (по объему) и раствор молярной концентрации (НСl)=0,01 моль/дм
.
Калий хлористый по ГОСТ 4234.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 10%.
Спирт изобутиловый по ГОСТ 6016.
Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166.
Калий железосинеродистый (красная кровяная соль) по ГОСТ 4206, раствор с массовой долей 1%.
Хининсульфат или хининхлорид по нормативным документам [9, 10].
Тиминбромид или тиаминхлорид по нормативным документам [16, 17].
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Примечания
1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
4.2 Подготовка к испытанию
4.2.1 Приготовление окислительной смеси
1 см
свежеприготовленного раствора железосинеродистого калия смешивают с 49 см
раствора гидроокиси натрия.
Смесь готовят в день проведения анализа.
4.2.2 Приготовление основного стандартного раствора из хининсульфата
10 мг хининсульфата растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см
в растворе серной кислоты и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор хранится не более 1 года в склянке из темного стекла.
4.2.3 Приготовление рабочего стандартного раствора хининсульфата
Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом. Для этого 1 см
основного стандартного раствора (4.2.2) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см
и доводят до метки раствором серной кислоты.
Концентрация хининсульфата - 1 мкг/см
.
4.2.4 Приготовление основного стандартного раствора из тиамин-бромида
Взвешивают 10 мг кристаллического тиаминбромида, предварительно высушенного в сушильном шкафу в течение 2-3 ч при температуре 100-105 °С, растворяют его в мерной колбе вместимостью 100 см
в растворе соляной кислоты молярной концентрации
(НСl)=0,01 моль/дм
и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор содержит 100 мг тиамина в 1 см
.
Раствор хранят не более 1 мес в склянке из темного стекла в прохладном месте.
4.2.5 Приготовление рабочего стандартного раствора тиаминбромида
Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом.
1 см
основного стандартного раствора тиаминбромида (4.2.4) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см
и доводят до метки дистиллированной водой.
Концентрация рабочего стандартного раствора тиаминбромида - 1 мкг/см
.
4.2.6 Контроль за содержанием витамина В
в стандартном растворе проводят по 6.2.4.
4.3 Проведение испытания
Навеску премикса массой 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см
, добавляют 5 г хлористого калия и приливают 70 см
серной кислоты. Затем колбу с реактивами встряхивают на аппарате в течение 10 мин, доводят объем в колбе до метки раствором серной кислоты, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр, отбросив первую порцию фильтрата. Переносят 2 см
фильтрата в мерную колбу вместимостью 50 см
и доводят до метки раствором серной кислоты. Отбирают 20 см
разбавленного фильтрата и переносят в делительную воронку, куда приливают 20 см
изобутилового спирта, тщательно перемешивают в течение 2 мин. После расслоения верхний слой сливают, а нижний - переносят в градуированную пробирку и доводят до объема 20 см
раствором серной кислоты, перемешивают.
Из пробирки берут 8 см
раствора в делительную воронку, приливают 6 см
окислительной смеси (4.2.1), перемешивают, добавляют 20 см
изобутилового спирта и встряхивают 2 мин. После расслоения нижний водный слой отбрасывают, а верхний (спиртовый) - фильтруют через обеззоленный фильтр (красная лента), пропуская через слой безводного сернокислого натрия (4-5 г) в флуорометрическую пробирку и флуорометрируют.
Для окисления стандартного раствора берут 8 см
рабочего стандартного раствора тиамина и проводят дальнейшую его обработку, как с испытуемой пробой.
Для гашения флуоресценции в испытуемом и стандартном растворах к ним добавляют по 1-2 капли раствора соляной кислоты в соотношении 1:1 (по объему), перемешивают и измеряют остаточную флуоресценцию.
Если в качестве стандартного раствора используют раствор хининсульфата (или хининхлорида), то его не окисляют и не гасят, так как он имеет одно и то же значение по флуорометру, равное 72.
По стандартному раствору хининхлорида (хининсульфата) настраивают (по инструкции) прибор на деление прибор
а 80.
4.4. Обработка результатов испытания
Содержание витамина В
в премиксе, г/т, вычисляют по формуле
,
где
- показание флуорометра для испытуемого раствора до гашения;
- показание флуорометра для испытуемого раствора после гашения;
- первоначальный объем раствора, см
;
- масса витамина в стандартном растворе, мкг;
- показания флуорометра для стандартного раствора до гашения;
- показания флуорометра для стандартного раствора после гашения;
- масса навески, г;
- объем испытуемого раствора, взятый на испытание, см
.
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности
=0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности
=0,95 расхождения не должны превышать 15%.
Примечание - При использовании в качестве стандартного раствора хининсульфата (хининхлорида) в расчетную формулу вместо выражения (
) подставляют цифру 72.
5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В
Сущность метода заключается в извлечении витамина В
(рибофлавина) из навески путем кислотного гидролиза и измерении интенсивности флуоресценции.
5.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Флуорометр Квант-7, ФАНК-1.
рН-метр по нормативному документу [8].
Баня водяная.
Центрифуга ОПН-8.
Фильтры обеззоленные (синяя лента) по нормативному документу [3].
Колбы мерные 2-50(100, 1000)-1(2) по ГОСТ 1770.
Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-1, 6(7)-1(2)-25 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Цилиндры 1(2, 3, 4)-100 по ГОСТ 1770.
Кислота уксусная по ГОСТ 61.
Витамин В
по нормативному документу [11].
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор с массовой долей 5% и раствор молярной концентрации (НСl)=0,1 моль/дм
.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 15%.
Натрий двууглекислый по ГОСТ 4201.
Натрия гидросульфит по ГОСТ 246.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Примечания
1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
5.2 Подготовка к испытанию
5.2.1 Приготовление основного стандартного раствора витамина В
40 мг витамина В
растворяют в дистиллированной воде, подкисленной 10 см
ледяной уксусной кислоты, при нагревании до 50 °С в мерной колбе вместимостью 1000 см
. Доводят объем до метки дистиллированной водой. В 1 см
раствора содержится 40 мкг рибофлавина.
Раствор хранят в прохладном, темном месте в склянке из темного стекла не более 2 мес.
5.2.2 Приготовление рабочего стандартного раствора рибофлавина
1 см
основного стандартного раствора рибофлавина переносят в мерную колбу вместимостью 100 см
и доводят до метки дистиллированной водой, подкисленной раствором соляной кислоты с массовой долей 5% до рН 5,5-6,0.
В 1 см
раствора содержится 0,4 мкг рибофлавина.
Раствор готовят перед употреблением.
5.2.3 Контроль за содержанием витамина В
в стандартном растворе проводят по 6.2.4.
5.3 Проведение испытания
Навеску премикса массой 2-5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см
, приливают 75 см
раствора соляной кислоты молярной концентрации
(НСl)=0,1 моль/дм
, смывая частицы премикса со стенок колбы. Колбу помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. Содержимое колбы периодически перемешивают.
После охлаждения колбы рН раствора доводят до значения 5,5-6,0 раствором гидроокиси натрия. Затем объем в колбе доводят дистиллированной водой до метки, хорошо перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин при 8000 об/мин.
Из полученного фильтрата готовят раствор с нужным разведением (например, 1 см
фильтрата разводят в мерной колбе вместимостью 50 см
) и определяют интенсивность флуоресценции, помещая в одну флуорометрическую пробирку 12-15 см
испытуемого раствора, в другую - такое же количество рабочего стандартного раствора. Затем в эти же пробирки добавляют 2-3 раза по 0,1 г двууглекислого натрия и по 0,1 г гидросульфита натрия или 4-6 капель раствора гидроокиси натрия. Содержимое пробирок осторожно перемешивают, фильтруют, если раствор мутный, и снова измеряют интенсивность флуоресценции на приборе
.
5.4 Обработка результатов испытания
Содержание витамина В
в премиксе, г/т, вычисляют по формуле
,
где
- показания флуорометра для испытуемого раствора до гашения флуоресценции;
- показания флуорометра для испытуемого раствора после гашения флуоресценции;
- содержание витамина В
в рабочем стандартном растворе, мкг/см
;
- первоначальный объем раствора, см
;
- окончательный объем разведения, см
;
- показания флуорометра для стандартного раствора до гашения флуоресценции;
- показания флуорометра для стандартного раствора после гашения флуоресценции;
- масса навески, г,
- объем раствора, взятый для разведения, см
.
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности
=0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности
=0,95 расхождения не должны превышать 15%.
6 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ В
И В
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ
Сущность метода заключается в экстракции витаминов В
(тиамина) и В
(рибофлавина) из навески раствором соляной кислоты и определении их на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором с использованием обращенно-фазного режима элюирования.
Метод применим в диапазоне содержания витамина В
от 0,05 до 0,5 г/кг в премиксе, витамина В
- от 0,1 до 2 г/кг в премиксе.
6.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором и систематической погрешностью измерений не выше 10%. Допускается использовать хроматографы "Цвет-306", "Цвет-3006 со спектрофотометрическим детектором" и "Милихром".
Колонка хроматографическая стальная или стеклянная высотой 150 мм и диаметром 4 мм с числом теоретических тарелок не менее 2000, заполненная сорбентом "Силасорб С-18" или "Сепарон С-18".
Спектрофотометр СФ-26 или СФ-46 (спектральный диапазон 186-1100 нм).
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Линейка измерительная металлическая по ГОСТ 427.
Секундомер механический по нормативному документу [15].
Сорбент "Силасорб С-18" зернением 7 мкм.
рН-метр по нормативному документу [8].
Мешалка магнитная ММ-5.
Центрифуга лабораторная ЦЭ-2 с числом оборотов 6000 в мин.
Иономер ЭБ-74 со стеклянным электродом ЭСЛ-62-07.
Микрошприц МШ-10 или микропипетка МП-2.
Колбы конические со шлифом вместимостью 100 см
Колбы мерные 2-25(50, 100, 200)-1(2) по ГОСТ 1770.
Воронка ВФ-1-56(75)ХС или ВФ-2-75(110)ХС со стеклянным фильтром ПОР 100 по ГОСТ 25336.
Пипетки градуированные 6(7)-1(2)-10 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
Ацетонитрил по нормативному документу [7].
Натрия октилсульфонат, хроматографически чистый (изготовление Германия, фирма Pylver).
Триэтиламин, перегнанный по нормативному документу [4].
Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, концентрированная и раствор молярной концентрации (НСl)=0,01 моль/дм
.
Витамин В
по нормативному документу [11].
Витамин В
по нормативным документам [16, 17].
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Примечания
1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
6.2 Подготовка к испытанию
6.2.1 Приготовление элюента
Для приготовления 1 дм
элюента смешивают 120 см
ацетонитрила с 880 см
дистиллированной воды, добавляют 2,5 см
триэтиламина, 0,5 г октилсульфоната натрия и приливают ортофосфорную кислоту до рН 7,6 по рН-метру. Полученную смесь фильтруют через стеклянный фильтр для удаления механических примесей.
Срок хранения элюента - не более 1 мес.
6.2.2 Приготовление раствора-экстрагента
К 1 дм
дистиллированной воды прибавляют 0,8 см
концентрированной (37%-ной) соляной кислоты, рН раствора 2±0,2.
6.2.3 Приготовление основных стандартных растворов витаминов В
и В
Для приготовления основных стандартных растворов витаминов В
и В
берут навески 0,1 г тиаминхлорида и 0,01 г рибофлавина. Навеску тиаминхлорида растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см
, а рибофлавина - в мерной колбе вместимостью 200 см
, при нагревании до температуры 70-80 °С и доводят дистиллированной водой до метки. Полученные растворы содержат в 1 см
1 мг витамина В
и 0,05 мг витамина В
соответственно.
Срок хранения основных стандартных растворов витаминов В
и В
- не более 2 недель в холодиль
нике.
6.2.4 Контроль за содержанием витаминов В
и В
в основных стандартных растворах
Контроль за содержанием витаминов в основных стандартных растворах осуществляют спектрофотометрически по значениям молярных коэффициентов светопоглощения.
Для этого основные стандартные растворы разбавляют дистиллированной водой в 50 раз и измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см.
Массовую концентрацию витаминов В
и В
рассчитывают по формуле
,
где
- оптическая плотность;
- молярный коэффициент;
- толщина слоя раствора, 1 см.
Массовую концентрацию витаминов В
и В
и В
, мг/см
, мг/см
, рассчитывают соответственно по формулам:
;
,
где 205 - молярный коэффициент светопоглощения тиаминхлорида при рабочей длине волны 268 нм;
324 - молярный коэффициент светопоглощения рибофлавина при рабочей длине волны 445 нм.
6.2.5 Приготовление рабочего стандартного раствора витаминов В
и В
Из основных стандартных растворов готовят рабочие стандартные растворы с содержанием витаминов В
- 0,02 мг и В
- 0,025 мг в 1 см
.
Для этого в мерную колбу вместимостью 50 см
помещают 1 см
основного стандартного раствора тиаминхлорида (6.2.3) и 25 см
основного стандартного раствора рибофлавина (6.2.3), доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.
Рабочий стандартный раствор готовят в день испытани
й.
6.3 Проведение испытания
6.3.1 Экстракция витаминов В
и В
Навеску премикса массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 см
и приливают 10 см
раствора соляной кислоты молярной концентрации
(НСl)=0,01 моль/дм
. Колбу ставят на магнитную мешалку с включением нагрева. Перемешивание и нагрев осуществляют в течение 10 мин. Полученную суспензию переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют при 5000-6000 об/мин в течение 3 мин. Центрифугат сливают в мерную колбу вместимостью 25 см
. Коническую колбу с остатком раствора смывают небольшим количеством (около 5 см
) раствора соляной кислоты молярной концентрации
(НСl)=0,01 моль/дм
, сливают раствор в центрифужную пробирку и снова центрифугируют. Центрифугат соединяют с первым в той же мерной колбе. Промывание центрифугированием повторяют 3-4 раза, каждый раз сливая промывные воды в ту же колбу. После этого раствор в мерной колбе доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют или дополнительно центрифугируют для очищения от механических примесей и взвешенных частиц. Приготовленный раствор используют для хроматографического анал
иза.
6.3.2 Хроматографирование
Хроматографирование осуществляют в следующих условиях. Разделение проводят на колонке 4х150 мм, заполненной сорбентом (6.2.4).
Подвижная фаза - элюент (6.2.1).
Рабочая длина волны спектрофотометрического детектора хроматографа 254 нм. Скорость элюирования - 1,2 см
/мин. Время удерживания для витамина В
составляет 6 мин, а для витамина В
- 8 мин. Объем загрузки анализируемого раствора - 10 мкдм
. Для насыщения колонки в начале работы производится 3-5 загрузок, отмечая высоты пиков. При достижении постоянной высоты можно приступить к испытаниям. Анализируемые растворы хроматографируют каждый по три раза в одинаковых условиях. В этих же условиях хроматографируют рабочие стандартные растворы витаминов В
и В
.
Измеряют высоты пиков, как расстояние от вершины пика до линии, проведенной в основании пика (приложение А, рисунок А.1 и приложение Б, рисунок Б.1).
6.4 Обработка результатов испытания
Содержание витаминов В
и В
и
в премиксе, г/т, вычисляют по формуле
,
где
- высота пика витамина на хроматограммах экстракта из премикса, мм;
- массовая концентрация витамина в рабочем стандартном растворе, мг/см
;
- объем премикса с экстрактом, см
;
- высота пика витамина на хроматограммах рабочего стандартного раствора, мм;
- масса навески премикса, г.
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности
=0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности
=0,95 расхождения не должны превышать 15%.
7 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛИНХЛОРИДА
Сущность метода заключается в экстракции холинхлорида дистиллированной водой, образовании в присутствии трехзамещенного фосфата натрия комплекса рейнеката холинхлорида и измерении интенсивности окраски его ацетоновых растворов спектрофотометрически.
7.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Фотоэлектроколориметр - ФЭК-56М, КФК или спектрофотометр типа СФ-26.
Насос вакуумный по ГОСТ 25336.
Центрифуга ОПН-8.
Колбы конические вместимостью 50-100 см
Эксикатор вакуумный по ГОСТ 25336.
Стаканы химические вместимостью 200-250 см
Баня водяная.
Колбы конические с притертой пробкой вместимостью 100 и 250 см
Воронка ВФО-40-ПОР-16 (Шотта N 2) по ГОСТ 25336.
Аппарат для встряхивания жидкости типа АВУ-1.
Колбы мерные 2-25(100)-1(2) по ГОСТ 1770.
Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-2, 6(7)-1(2)-5(10, 25) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Цилиндр мерный 1(2, 3, 4)-100 по ГОСТ 1770.
Фильтры обеззоленные (синяя лента) по нормативному документу [3].
Холинхлорид кристаллический по нормативному документу [18].
Спирт этиловый по ГОСТ 18300.
Натрий фосфорнокислый 12-водный по ГОСТ 9337, раствор с массовой долей 0,1%.
Ацетон по ГОСТ 2603.
Спирт изопропиловый по нормативному документу [1].
Рейнекат аммония по нормативному документу [5].
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Примечания
1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
7.2 Подготовка к испытанию
7.2.1 Приготовление осаждающего реактива
2 г рейнеката аммония растворяют в 100 см
этилового спирта в конической колбе при нагревании на водяной бане при температуре (40±2) °С в течение 20 мин. После охлаждения раствор фильтруют через обеззоленный складчатый фильтр. Раствор готовят в день определения.
7.2.2 Приготовление стандартного раствора холинхлорида
0,1 г кристаллического холинхлорида высушивают до постоянной массы в вакуум-эксикаторе и растворяют его в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см
. Доводят до метки дистиллированной водой. Стандартный раствор содержит 1 мг холинхлорида в 1 см
.
Допускается приготовление стандартного раствора из 70%-ного раствора холинхлорида с пересчетом на 100%-ную активность.
7.2.3 Построение градуировочного графика
В 5 конических колб вместимостью 50 см
помещают 1, 2, 5, 7, 10 см
стандартного раствора холинхлорида, соответственно добавляют 10 см
раствора фосфата натрия и 5 см
раствора рейнеката аммония и далее проводят все испытания по 7.2.4. Интенсивность окрашенных растворов измеряют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром или спектрофотометре при длине волны 526 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно ацетона и на основании его показаний строят градуировочный график.
7.2.4 Проведение испытания
Навеску премикса массой 1-5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, вносят в мерную колбу вместимостью 100 см
, приливают 50 см
дистиллированной воды, нагревают до 80 °С и встряхивают на аппарате 15 мин. Охлаждают колбу, объем доводят до метки дистиллированной водой и фильтруют через обеззоленный складчатый фильтр в стакан. Отбирают 5-20 см
фильтрата в колбу с притертой пробкой, приливают 10 см
раствора фосфорнокислого натрия и 5 см
раствора рейнеката аммония. Колбу с содержимым встряхивают и оставляют на 2 ч при температуре 4 °С. После выпадения кристаллов холинхлорида раствор фильтруют на воронке Шотта N 2 с асбестовым слоем, используя вакуумный насос. Кристаллы, оставшиеся на фильтре, промывают 4-5 порциями (по 5 см
) охлажденного изопропилового спирта (спирт хранится в холодильнике до полного использования). Меняют колбу и растворяют кристаллы ацетоном, приливая его в три приема по 7 см
, каждый раз осторожно размешивая верхний асбестовый слой с осадком.
Содержимое колбы фильтруют в мерную колбу вместимостью 25 см
. Объем доводят в колбе ацетоном до метки. Интенсивность окрашенных растворов измеряют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром или спектрофотометре при длине волны 526 нм в кюветах толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно ацетон
а.
7.3 Обработка результатов испытания
Содержание 70%-ного холинхлорида
в премиксе, г/т, рассчитывают по формуле
,
где
- масса холинхлорида, найденная по градуировочному графику, мм;
1,43 - коэффициент пересчета на 70%-ный раствор холинхлорида;
- общий объем экстракта, см
;
- масса навески, г;
- объем раствора, взятый на проведение анализа, см
.
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности
=0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности
=0,95, расхождения не должны превышать 15%.
8 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В
Сущность метода заключается в кислотном гидролизе связанных форм витамина В
(никотиновой кислоты), очистке гидролизата, получении окрашенного раствора и колориметрическом определении в сравнении со стандартным раствором.
8.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Фотоэлектроколориметр типа ФЭК-56, КФК или спектрофотометр типа СФ-26 или аналогичные с диапазоном длин волн 400-440 нм.
Баня водяная.
Баня ледяная.
Воронка Бюхнера N 3 или N 4 по ГОСТ 9147.
Палочки стеклянные.
Стакан химический вместимостью 1 и 2 дм
Склянки из темного стекла.
Колбы конические вместимостью 250 дм
Бюретка 1-2-25 по ГОСТ 29251 и ГОСТ 29252.
Фильтры обеззоленные (красная и синяя ленты) по нормативному документу [3].
Колбы мерные 2-100(500, 1000)-1(2) по ГОСТ 1770.
Воронки стеклянные по ГОСТ 25336.
Пипетки 1(2, 4, 5)-1(2)-1(2), 6(7)-1(2)-5(10, 25) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Пробирки с притертой пробкой вместимостью 15 см
Цилиндры мерные 1(2, 3, 4)-50(100, 500) по ГОСТ 1770.
Бром по ГОСТ 4109.
Калий роданистый по ГОСТ 4139 или аммоний роданистый по ГОСТ 27067, растворы с массовыми долями 1 и 10%.
Кальций углекислый по ГОСТ 4530.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации (НСl)=0,5 моль/дм
(0,5 н.).
Кислота серная по ГОСТ 4204, растворы с молярными концентрациями (
H
SO
)=2 моль/дм
и
(
H
SO
)=10 моль/дм
.
Витамин В
по нормативному документу [12].
Метол по ГОСТ 25664, раствор с массовой долей 6%.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, растворы молярных концентраций (NaOH)=4 моль/дм
и
(NaOH)=10 моль/дм
.
Спирт этиловый по ГОСТ 18300.
Уголь активный по ГОСТ 6217.
Фенолфталеин по нормативному документу [6].
Цинк сернокислый по ГОСТ 4174, раствор с массовой долей 80%.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Примечания
1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч.
и ч.д.а.
8.2 Подготовка к испытанию
8.2.1 Перекристаллизация метола
500 см
раствора серной кислоты молярной концентрации
(
H
SO
)=0,1 моль/дм
нагревают до кипения, добавляют 100 г метола и снова доводят до кипения. Если раствор сильно окрашен, к нему добавляют 10 г активного угля. Кипящий раствор быстро фильтруют через предварительно нагретую (кипящей водой) воронку Бюхнера, фильтрат переносят в большой химический стакан, приливают 0,7 дм
этилового спирта (96°), размешивают, помещают в ледяную баню и оставляют на несколько часов в темном месте.
Выпавшие в осадок кристаллы отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают на фильтре 2-3 раза этиловым спиртом, порциями по 30-40 см
и высушивают на воздухе в темном месте.
Подготовленный метол хранят в склянке из темного стекла в холодильнике до полного использовани
я.
8.2.2 Приготовление раствора метола
Навеску перекристаллизированного метола массой (8±0,002) г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см
и доводят объем до метки раствором соляной кислоты молярной концентрации
(НСl)=0,5 моль/дм
. Раствор готовят перед употреблением.
8.2.3 Приготовление бромной воды
В темную склянку с притертой пробкой 100 см
дистиллированной воды, добавляют в вытяжном шкафу 4-5 см
брома, хорошо встряхивают и оставляют на 1-3 сут для лучшего насыщения воды бромом. Бромную воду охлаждают в емкости со льдом в течение 30 мин.
8.2.4 Приготовление роданбромидного раствора
К 30 см
охлажденной бромной воды по каплям прибавляют раствор роданистого калия или роданистого аммония с массовой долей 10% до светло-желтого окрашивания. Затем по каплям прибавляют эти же растворы с массовой долей 1% до полного обесцвечивания бромной воды. К обесцвеченному раствору постепенно, небольшими порциями, по 20-50 мг, добавляют углекислый кальций до прекращения выделения пузырьков газа.
Раствор фильтруют от осадка через обеззоленный фильтр с синей лентой в склянку из темного стекла с притертой пробкой и хранят на холоде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
8.2.5 Приготовление основного стандартного раствора витамина В
помещают в мерную колбу вместимостью 500 см
, добавляют 200 см
дистиллированной воды, 5 см
раствора серной кислоты молярной концентрации
(
H
SO
)=10 моль/дм
и после растворения кристаллов доводят объем дистиллированной водой до метки.
В 1 см
раствора содержится 1000 мкг витамина В
.
Раствор годен к употреблению в течение 6 мес при хранении в холодил
ьнике.
8.2.6 Приготовление рабочего стандартного раствора витамина В
5 см
основного стандартного раствора витамина В
разводят дистиллированной водой в колбе вместимостью 1 дм
, доводят до метки этой же водой и тщательно перемешивают. В 1 см
раствора содержится 5 мкг витамина В
. Раствор готовят в день проведения анализа.
8.3 Проведение испытания
Навеску массой 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см
, смывая горлышко колбы 60-65 см
раствора серной кислоты молярной концентрации
(
H
SO
)=2 моль/дм
. Содержимое перемешивают и колбу помещают в кипящую водяную баню на 40 мин, периодически перемешивая содержимое. По окончании гидролиза колбу охлаждают до комнатной температуры, доводят объем дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбрасывая первые 5-10 см
фильтрата.
Отбирают 10-20 см
фильтрата в мерную колбу вместимостью 100 см
и доводят объем до метки дистиллированной водой. Затем 25 см
полученного раствора помещают в цилиндр вместимостью 50 см
, добавляют 1-2 капли раствора фенолфталеина и нейтрализуют, внося по каплям раствор гидроокиси натрия молярной концентрации
(NaOH)=10 моль/дм
до получения слабо-розового окрашивания. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации
(
H
SO
)=2 моль/дм
, добавляя по каплям до исчезновения розового окрашивания. Раствор охлаждают, добавляют 2 см
раствора сернокислого цинка и 1-2 капли этилового спирта (для устранения пены).
Из пипетки по каплям добавляют раствор гидроокиси натрия молярной концентрацией
(NaOH)=4 моль/дм
, одновременно перемешивая палочкой до образования осадка и появления бледно-розового окрашивания раствора. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации
(
H
SO
)=2 моль/дм
(до исчезновения розового окрашивания) и оставляют стоять в течение 10 мин, периодически перемешивая. Палочку вынимают, обмывают над цилиндром дистиллированной водой и доводят объем до 50 см
, перемешивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр.
Цветную реакцию проводят в восьми пробирках с притертыми пробками: в одну пробирку вносят 5 см
дистиллированной воды (контроль на реактивы, В
); в три пробирки вносят по 5 см
рабочего стандартного раствора, В; в четыре пробирки вносят по 5 см
полученного фильтрата, из них 2 пробирки, с испытуемым раствором А; две - поправка на аминореагирующие вещества, А
.
Все пробирки, кроме А
, помещают на 5 мин в водяную баню при температуре (50±2) °С. После этого в 2 пробирки (А
) вносят по 2 см
дистиллированной воды, а во все остальные пробирки - по 2 см
роданбромидного раствора из бюретки в вытяжном шкафу. Пробирки закрывают пробками, перемешивают и помещают в баню при той же температуре на 10 мин. По истечении этого времени пробирки вынимают, охлаждают водой до комнатной температуры и ставят на 10 мин в темное место. Затем в каждую пробирку приливают по 3 см
раствора метола, перемешивают и оставляют на 1 ч в темном месте при комнатной температуре. По истечении этого времени растворы фильтруют через бумажный складчатый фильтр, если они мутные, и колориметрируют на фотоэлектроколориметре (синий светофильтр) или спектрофотометре при длине волны 400-440 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм отн
осительно дистиллированной воды.
8.4 Обработка результатов испытания
Содержание витамина В
в премиксе, г/т, рассчитывают по формуле
,
где
- оптическая плотность испытуемого раствора (среднее из двух параллельных определений);
- оптическая плотность раствора - поправки на аминореагирующие вещества (среднее из двух параллельных определений);
- объем гидролизата, см
;
- объем разведения, см
;
- объем раствора после обработки сернокислым цинком, см
;
- масса витамина В
в измеряемом стандартном растворе, мкг;
- оптическая плотность стандартного раствора (среднее из трех параллельных определений);
- оптическая плотность раствора - контроль на реактивы;
- масса навески премикса, г;
- объем, взятый на дополнительное разведение, см
;
- объем гидролизата, взятый на обработку сернокислым цинком, см
;
- объем раствора, взятый для проведения цветной реакции, см
.
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности
=0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности
=0,95 расхождения не должны превышать 15%.
9 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ
9.1 Определение витамина В
с применением жидкостного микроколоночного хроматографа отечественного производства марки "Милихром".
Сущность метода заключается в экстракции витамина В
(никотиновой кислоты) из навески премикса раствором соляной кислоты и последующем определении его содержания в испытуемом растворе с помощью хроматографа "Милихром".
9.1.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Хроматограф жидкостный микроколоночный "Милихром" со спектрофотометрическим детектором (спектральный диапазон от 190 до 360 нм).
Колонка хроматографическая размером 2х120 мм с числом теоретических тарелок не менее 4000, заполненная одним из следующих сорбентов: Силасорб С18, Силасорб SPHC 18, Сепарон С18.
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Колбы конические КН-100, КН-200 по ГОСТ 19908.
Баня водяная с терморегулятором.
Пипетки 2-1(2)-1, 2-1(2)-5, 2-1(2)-10 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Колбы мерные 2-50-1(2), 2-100-1(2), 2-200-1(2) по ГОСТ 1770.
Воронка ВФ-1-40-ПОР 16-ХС по ГОСТ 25336.
Воронка 71 по ГОСТ 19908.
Стакан ВН-50, ВН-200 по ГОСТ 19908.
рН-метр по нормативному документу [8].
Цилиндр мерный 2-50, 2-100 по ГОСТ 1770.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 40%.
Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор молярной концентрации (
H
SO
)=5 моль/дм
.
Кислота уксусная по ГОСТ 61, с массовой долей 95%.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации (НСl)=0,1 моль/дм
.
Витамин В
по нормативному документу [12].
Фенолфталеин по нормативному документу [6].
Триметиламин по нормативному документу [2].
Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
Примечания
1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
9.1.2 Подготовка к испытанию
9.1.2.1 Приготовление элюента для хроматографии
Трехкомпонентный элюент готовят смешиванием уксусной кислоты, дистиллированной воды и триметиламина в объемном соотношении 3:95:2. Для этого в мерную колбу вместимостью 500 см
вносят пипеткой 15 см
концентрированной уксусной кислоты, затем цилиндром вносят 100 см
дистиллированной воды и перемешивают. Добавляют 10 см
триметиламина, перемешивают, доводят до метки дистиллированной водой и снова тщательно перемешивают. Приготовленный раствор фильтруют через стеклянный фильтр ПОР 16 и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой. Полученный элюент хранят не более 1 мес в холодильнике.
9.1.2.2 Подготовка хроматографической колонки
Через колонку пропускают элюент в количестве 20-30 свободных объемов колонки, т.е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 50 мкдм
/мин, а затем 100 мкдм
/мин. Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.
После стабилизации колонки проводят ее насыщение витамином В
. Для этого выполняют 7-10 анализов более концентрированного градуировочного раствора витамина В
. Насыщение колонки прекращают, когда расхождение между последовательными определениями не превышает 3,0%.
9.1.2.3 Приготовление раствора серной кислоты молярной концентрации
(
H
SO
)=5 моль/дм
.
В мерную колбу вместимостью 100 см
помещают 30-40 см
дистиллированной воды и добавляют 14,2 см
концентрированной серной кислоты. Осторожно перемешивают и добавляют еще 35-40 см
дистиллированной воды. Когда раствор остынет до комнатной температуры, осторожно доводят объем дистиллированной водой до мет
ки.
9.1.2.4 Построение градуировочного графика
В мерную колбу вместимостью 100 см
помещают 0,1 г витамина В
и приливают 70 см
раствора соляной кислоты молярной концентрации
(НСl)=0,1 моль/дм
. Колбу помещают в водяную баню и нагревают в течение 10 мин при температуре 75 °С. Затем охлаждают и содержимое количественно переносят в химический стакан вместимостью 200 см
. Добавляют 1-2 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина, раствор гидроокиси натрия с массовой долей 40% до образования розового окрашивания, избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации
(
H
SO
)=5 моль/дм
. Раствор фильтруют через бумажный фильтр с синей полосой в мерную колбу вместимостью 100 см
и доводят объем до метки дистиллированной водой. Получают основной стандартный раствор витамина В
массовой концентрации 1 мг/см
. Из этого раствора готовят рабочие растворы, содержащие 0,4; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 мг витамина В
в 50 см
. Для этого соответственно 0,4; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0 и 3,0 см
основного раствора помещают в 6 мерных колб вместимостью 50 см
и доводят до метки дистиллированной водой.
Рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:
хроматографическая колонка 2х120 мм;
сорбент - Силасорб С 18, Силасорб SPH С 18, Сепарон С 18;
трехкомпонентный элюент на основе уксусной кислоты;
объем пробы - 6 мкдм
;
длина волны - 260 нм;
скорость подачи элюента - 80-100 мкдм
/мин;
постоянная времени - 0,2 с.
Удерживаемый объем пика витамина В
- 560-580 мкдм
(может меняться в зависимости от длины колонки и плотности ее заполнения). Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пики колонку промывают, прокачивая через нее 150-200 мкдм
элюента до выхода на нулевую линию.
Значение средних высот хроматографических пиков (в единицах оптической плотности е.о.п.) откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс - количество витамина в 50 см
раствора.
Градуировочный график строят так же, откладывая по оси ординат средние высоты хроматографических пиков, выраженные в единицах длины (миллиметрах).
Построение градуировочного графика можно заменить расчетом коэффициентов наклона
, мг/е.о.п., по формуле
,
где
- коэффициент наклона градуировочного графика для
-го градуировочного раствора, мг/е.о.п.;
- количество точек, по которым строится градуировочный график.
Значение коэффициента наклона градуировочного графика
, мг/е.о.п. или мг/мм, вычисляют по формуле
,
где
- содержание витамина в соответствующем
-м градуировочном растворе,
- высота
-го хроматографического пика, е.о.п. или мм.
9.1.2.5 Проверка градуировочного графика
Градуировочный график контролируют не реже 1 раза в неделю. Для этого 1-2 рабочих раствора витамина следует анализировать, как указано в 9.1.2.4.
Отклонение полученных результатов от измеренных в момент построения градуировочного графика
, %, определяют по формуле
,
где
,
- высота хроматографического пика, определенная при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно, е.о.п. или мм.
При отклонении результатов более чем на 5% строят новый градуировочный график.
Градуировочные растворы хранят в холодильнике в стеклянной посуде с притертой пробкой. Срок годности растворов не более 1 мес.
9.1.3 Проведение кислотного гидролиза
Навеску премикса массой 1-5 г, взятую с погрешностью не более 0,001 г, помещают в коническую колбу вместимостью 100 см
и добавляют 3 см
раствора соляной кислоты молярной концентрации
(НСl)=0,1 моль/дм
. Колбу нагревают на водяной бане при температуре (75±1) °С в течение 10 мин, охлаждают, содержимое колбы количественно переносят в химический стакан вместимостью 200 см
. Добавляют 1-2 капли спиртового раствора фенолфталеина с массовой долей 1% и раствор гидроокиси натрия с массовой долей 40% до образования розового окрашивания. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации
(
H
SO
)=5 моль/дм
. После 10-минутного выдерживания раствор фильтруют через обеззоленный фильтр с синей лентой в мерную колбу вместимостью 50 см
и доводят объем до метки дистиллированной в
одой.
9.1.4 Хроматографирование
Полученный экстракт хроматографируют, как в 9.1.2.4. Для определения содержания витамина В
в премиксах проводят 2 параллельных анализа, начиная со взятия навески. Каждый экстракт хроматографируют два раза, находят среднеарифметическое значение высоты пиков в единицах оптической плотности или миллиметрах и по градуировочному графику определяют содержание витамина в миллиграммах, приложение В, рисунок B.1.
9.1.5 Обработка результатов испытания
Содержание витамина В
в премиксе, мг/кг, вычисляют по формуле
,
где
- содержание витамина, найденное по градуировочному графику, мг;
- навеска премикса, г.
При использовании коэффициента наклона
вместо градуировочного графика содержание витамина В
в премиксе, мг/г, вычисляют по формуле
,
где
- коэффициент наклона градуировочного графика, мг/е.о.п.;
- высота хроматографического пика, е.о.п.;
- масса навески премикса, г.
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности
=0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности
=0,95 расхождения не должны превышать 15%.
9.2 Определение витамина В
с применением жидкостных хроматографов импортного производства
Сущность метода заключается в экстракции витамина В
из навески премикса раствором соляной кислоты молярной концентрации
(НСl)=0,01 моль/дм
и хроматографическом анализе его содержания в испытуемом растворе с использованием жидкостного хроматографа со спектрофотометрическим детектором.
Метод применим в диапазоне содержания витамина В
от 0,2 до 4 г/кг премикса.
9.2.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором при спектральном диапазоне от 200 до 300 нм. Возможно использование детектора при постоянной длине волны 254 нм.
Колонка хроматографическая стальная или стеклянная высотой 150-200 мм и диаметром 2,6-4,6 мм с числом теоретических тарелок не менее 3000 на 1 м, заполненная сорбентом "Силосорб С-18" или "Сепарон С-18" с зернением 7,5 мкм.
Весы лабораторные не ниже 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Центрифуга лабораторная ЦЭ-2 с числом оборотов 6000 в минуту.
Колбы мерные 2-50(100)-1(2) по ГОСТ 1770.
Иономер ЭВ-74 со стеклянным электродом ЭСЛ-63-07.
Пипетка 4-1(2)-1 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Ацетонитрил по нормативному документу [7].
Тетрабутиламмоний хлористый по нормативному документу [14].
Тетрабутиламмоний бромистый по нормативному документу [13].
Витамин В
по нормативному документу [12].
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации (НСl)=0,01 моль/дм
.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
Примечания
1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
9.2.2 Подготовка к испытанию
9.2.2.1 Приготовление элюента для хроматографии
В колбе вместимостью 1 дм
смешивают 120 см
ацетонитрила с 880 см
дистиллированной воды, добавляют (2±0,002) г хлористого (бромистого) тетрабутиламмония. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр для удаления механических примесей и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой.
Полученный раствор можно хранить в течение 1 мес.
9.2.2.2 Приготовление раствора экстрагента
Для экстракции витамина В
используют раствор соляной кислоты молярной концентрации
(НСl)=0,01 моль/дм
, который готовят прибавлением к 1 дм
дистиллированной воды 0,6 см
концентрированной 37%-ной соляной кислоты. Значение рН должно быть 2±0,2.
9.2.2.3 Приготовление основного стандартного раствора витамина В
Навеску витамина В
массой 0,1 г взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см
и доводят до метки этой же водой. Полученный раствор содержит 1 мг витамина В
в 1 см
.
Раствор хранят в холодильнике до полного использования.
9.2.2.4 Приготовление рабочего стандартного раствора витамина В
Рабочий стандартный раствор никотиновой кислоты готовят в зависимости от предполагаемого содержания ее в премиксе по таблице 1. Рабочий стандартный раствор готовят в день проведения контроля.
Таблица 1
Концентрация рабочего стандартного раствора, мг/см | Количество основного стандартного раствора, необходимое для разбавления, см | Вместимость мерной колбы для разведения, см | Предполагаемое содержание витамина В в 1 кг премикса, г |
0,04 | 2 | 50 | 2-3 |
0,02 | 1 | 50 | 1-2 |
0,01 | 1 | 100 | Менее 1 |
9.2.3 Проведение испытания
9.2.3.1 Экстрагирование
Навеску премикса массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см
, приливают 2/3 объема раствора соляной кислоты молярной концентрации
(НСl)=0,01 моль/дм
, перемешивают и оставляют стоять в течение 20 мин, несколько раз при этом перемешивая, после чего доводят до метки тем же раствором. Полученную суспензию перемешивают и часть отливают в центрифужную пробирку, центрифугируют в течение 5 мин при 6000 об/мин. Полученный центрифугат используют для хроматографического анализа.
9.2.3.2 Хроматографирование
Хроматографирование осуществляют при следующих условиях: колонка, заполненная сорбентом, подвижная фаза - элюент по 9.2.2.1, рабочая длина волны спектрофотометрического детектора 262 нм (или 254 нм), скорость элюирования - 1,5 см
/мин, температура - комнатная. При данных условиях проводят 3-5 загрузок стандартного раствора по 5 мкдм
, отмечая время выхода пика витамина В
в секундах и высоту пика относительно базисной линии. При достижении постоянной высоты можно приступать к контролю. Загружают по 3 раза в одинаковых условиях 5-10 мкдм
стандартного раствора витамина массовой концентрации 0,01-0,04 мг в 1 см
в зависимости от состава премикса (10 мкдм
раствора массовой концентрации 0,01-0,02 мг/см
или 5 мкдм
раствора массовой концентрации 0,04 мг/см
) и экстракт премикса после центрифугирования. По времени выхода определяют пик витамина В
в экстракте и измеряют высоту пика, как расстояние от вершины пика до линии, проведенной в основании пика (приложение Г рисунок Г.1). Измеряя и сравнивая высоты пиков на хроматограммах, вычисляют содержание витамина В
в преми
ксах.
9.2.3.3 Обработка результатов испытания
Содержание витамина В
в премиксе, г/кг, вычисляют по формуле
,
где
- концентрация витамина В
в рабочем стандартном растворе, мг/см
;
- высота пика витамина В
на хроматограмме испытуемого раствора, мм;
- общий объем экстракта, см
;
- высота пика витамина В
на хроматограмме рабочего стандартного раствора, мм;
- масса навески, г.
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности
=0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности
=0,95 расхождения не должны превышать 15%.
10 ТРЕБОВАНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1 Работы с концентрированными кислотами, щелочами и др. летучими веществами должны проводиться в вытяжном шкафу.
10.2 Необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с электроприборами.
ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)
ХРОМАТОГРАММА ЭКСТРАКТА ИЗ ПРЕМИКСА
Рисунок А.1 - Хроматограмма экстракта из премикса
ПРИЛОЖЕНИЕ Б
(справочное)
ХРОМАТОГРАММА СМЕСИ ВИТАМИНОВ В
И В
Рисунок Б.1 - Хроматограмма смеси витаминов В
и В
ПРИЛОЖЕНИЕ В
(справочное)
ХРОМАТОГРАММА ЭКСТРАКТА ВИТАМИНА В
ИЗ ПРЕМИКСА
Рисунок B.1 - Хроматограмма экстракта витамина В
из премикса
ПРИЛОЖЕНИЕ Г
(справочное)
ХРОМАТОГРАММЫ РАСТВОРОВ ВИТАМИНА В
Рисунок Г.1 - Хроматограммы:
а - стандартного раствора; б - экстракта из премикса
ПРИЛОЖЕНИЕ Д
(информационное)
БИБЛИОГРАФИЯ
[1] ТУ 6-09-402-87 2 пропанол (изопропиловый спирт) химически чистый
[2] ТУ 6-09-11-2021-87 Триметиламин
[3] ТУ 6-09-1678-86 Фильтры обеззоленные (белая, красная, синяя ленты)
[4] МРТУ 6-09-2437-65 Триэтиламин
[5] ТУ 6-09-08-944-83 Рейнекат аммония
[6] ТУ 6-09-53-60-87 Фенолфталеин (индикатор)
[7] ТУ 6-09-06-1092-83 Ацетонитрил. Технические условия
[8] ТУ 25-7416-0171-88 рН-метр типа рН-155
[9] ГФ СССР-Х ст.149 Хининсульфат
[10] ГФ СССР-Х ст.147 Хинингидрохлорид
[11] ГФ СССР-Х ст.585 Рибофлавин (витамин В
)
[12] ГФ СССР-Х ст.19 Никотиновая кислота (витамин В
)
[13] МРТУ 6-09-105-62 Тетрабутиламмоний бромистый
[14] МРТУ 6-09-5351-68 Тетрабутиламмоний хлористый
[15] ТУ 25-1894.003-90 Секундомер СОС ПР-2А-3-000
[16] ГФ СССР-Х ст.673 Тиаминбромид
[17] ГФ СССР-Х ст.674 Тиаминхлорид
[18] ГФ Х ст.42-1997-93 Холинхлорид
