ГОСТ Р 50929-96 Премиксы. Методы определения витаминов группы В.

ГОСТ Р 50929-96

Группа С19

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРЕМИКСЫ

Методы определения витаминов группы В

Premixes. Methods for determination of vitamin В complex

ОКС 65.120.19*

ОКСТУ 9209

Дата введения 1997-01-01

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Акционерным обществом открытого типа "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (АООТ "ВНИИКП")

Нижегородским государственным техническим университетом

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, БВД, премиксы"

2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 июля 1996 г. N 488

3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

      1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящий стандарт распространяется на премиксы и устанавливает методы определения витаминов В

, В

, холинхлорида, В

химическими методами и высокоэффективной жидкостной хроматографией.

      2 НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 61-75 Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 246-76 Гидросульфит натрия технический. Технические условия

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 2603-79 Ацетон. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4109-79 Бром. Технические условия

ГОСТ 4139-75 Калий роданистый. Технические условия

ГОСТ 4166-76 Натрий серно-кислый. Технические условия

ГОСТ 4174-77 Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия

ГОСТ 4201-79 Натрий углекислый кислый. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4206-75 Калий железосинеродистый. Технические условия

ГОСТ 4234-77 Калий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4530-76 Кальций углекислый. Технические условия

ГОСТ 6016-77 Спирт изобутиловый. Технические условия

ГОСТ 6217-74 Уголь активный древесный дробленый. Технические условия

ГОСТ 6552-80 Кислота ортофосфорная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9337-79 Натрий фосфорнокислый 12-водный. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 19908-90 Тигли, чаши, стаканы, колбы, воронки, пробирки и наконечники из прозрачного кварцевого стекла. Общие технические условия

ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25664-83 Метол (4-метиламинофенол сульфат). Технические условия

ГОСТ 26573.0-85. Премиксы. Технические условия

ГОСТ 27067-86 Аммоний роданистый. Технические условия

ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 29228-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания

ГОСТ 29251-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 29252-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 2. Бюретки без времени ожидания

      3 ОТБОР ПРОБ

Отбор проб по ГОСТ 13496.0

      4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА B

Сущность метода заключается в извлечении витамина В

(тиамина) из навески анализируемого продукта раствором серной кислоты, окислении его раствором железосинеродистого калия в тиохром, экстракции окисленной формы из водной фазы изобутиловым спиртом и измерении интенсивности флуоресценции.

4.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104*.

Флуорометр Квант-7, ФАНК-1

Аппарат для встряхивания жидкости типа АВУ-1

Колбы мерные 2-50(100)-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронки стеклянные типа В по ГОСТ 25336.

Пробирки П-1(2)-25-0,2 по ГОСТ 1770.

Шкаф сушильный с терморегулятором, обеспечивающий постоянство температуры (105±2) °С.

Воронки делительные типа ВД вместимостью 100 см

по ГОСТ 25336.

Стаканы В-1-100ТХС по ГОСТ 25336.

Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-1(2), 6(7)-1(2)-5(10) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-25(50, 100) по ГОСТ 1770.

Фильтры обеззоленные (красная лента) по нормативному документу [3].

Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор молярной концентрации

(

H

SO

)=0,1 моль/дм

.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор в соотношении 1:1 (по объему) и раствор молярной концентрации

(НСl)=0,01 моль/дм

.

Калий хлористый по ГОСТ 4234.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 10%.

Спирт изобутиловый по ГОСТ 6016.

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166.

Калий железосинеродистый (красная кровяная соль) по ГОСТ 4206, раствор с массовой долей 1%.

Хининсульфат или хининхлорид по нормативным документам [9, 10].

Тиминбромид или тиаминхлорид по нормативным документам [16, 17].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

4.2 Подготовка к испытанию

4.2.1 Приготовление окислительной смеси

1 см

свежеприготовленного раствора железосинеродистого калия смешивают с 49 см

раствора гидроокиси натрия.

Смесь готовят в день проведения анализа.

4.2.2 Приготовление основного стандартного раствора из хининсульфата

10 мг хининсульфата растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см

в растворе серной кислоты и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор хранится не более 1 года в склянке из темного стекла.

4.2.3 Приготовление рабочего стандартного раствора хининсульфата

Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом. Для этого 1 см

основного стандартного раствора (4.2.2) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см

и доводят до метки раствором серной кислоты.

Концентрация хининсульфата - 1 мкг/см

.

4.2.4 Приготовление основного стандартного раствора из тиамин-бромида

Взвешивают 10 мг кристаллического тиаминбромида, предварительно высушенного в сушильном шкафу в течение 2-3 ч при температуре 100-105

°

С, растворяют его в мерной колбе вместимостью 100 см

в растворе соляной кислоты молярной концентрации

(НСl)=0,01 моль/дм

и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор содержит 100 мг тиамина в 1 см

.

Раствор хранят не более 1 мес в склянке из темного стекла в прохладном месте.

4.2.5 Приготовление рабочего стандартного раствора тиаминбромида

Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом.

1 см

основного стандартного раствора тиаминбромида (4.2.4) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см

и доводят до метки дистиллированной водой.

Концентрация рабочего стандартного раствора тиаминбромида - 1 мкг/см

.

4.2.6 Контроль за содержанием витамина В

в стандартном растворе проводят по 6.2.4.

4.3 Проведение испытания

Навеску премикса массой 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см

, добавляют 5 г хлористого калия и приливают 70 см

серной кислоты. Затем колбу с реактивами встряхивают на аппарате в течение 10 мин, доводят объем в колбе до метки раствором серной кислоты, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр, отбросив первую порцию фильтрата. Переносят 2 см

фильтрата в мерную колбу вместимостью 50 см

и доводят до метки раствором серной кислоты. Отбирают 20 см

разбавленного фильтрата и переносят в делительную воронку, куда приливают 20 см

изобутилового спирта, тщательно перемешивают в течение 2 мин. После расслоения верхний слой сливают, а нижний - переносят в градуированную пробирку и доводят до объема 20 см

раствором серной кислоты, перемешивают.

Из пробирки берут 8 см

раствора в делительную воронку, приливают 6 см

окислительной смеси (4.2.1), перемешивают, добавляют 20 см

изобутилового спирта и встряхивают 2 мин. После расслоения нижний водный слой отбрасывают, а верхний (спиртовый) - фильтруют через обеззоленный фильтр (красная лента), пропуская через слой безводного сернокислого натрия (4-5 г) в флуорометрическую пробирку и флуорометрируют.

Для окисления стандартного раствора берут 8 см

рабочего стандартного раствора тиамина и проводят дальнейшую его обработку, как с испытуемой пробой.

Для гашения флуоресценции в испытуемом и стандартном растворах к ним добавляют по 1-2 капли раствора соляной кислоты в соотношении 1:1 (по объему), перемешивают и измеряют остаточную флуоресценцию.

Если в качестве стандартного раствора используют раствор хининсульфата (или хининхлорида), то его не окисляют и не гасят, так как он имеет одно и то же значение по флуорометру, равное 72.

По стандартному раствору хининхлорида (хининсульфата) настраивают (по инструкции) прибор на деление прибор

а 80.

4.4. Обработка результатов испытания

Содержание витамина В

в премиксе, г/т, вычисляют по формуле

,

где

- показание флуорометра для испытуемого раствора до гашения;

- показание флуорометра для испытуемого раствора после гашения;

- первоначальный объем раствора, см

;

,

- разведения, см

;

- масса витамина в стандартном растворе, мкг;

- показания флуорометра для стандартного раствора до гашения;

- показания флуорометра для стандартного раствора после гашения;

- масса навески, г;

- объем испытуемого раствора, взятый на испытание, см

.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности

=0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности

=0,95 расхождения не должны превышать 15%.

Примечание - При использовании в качестве стандартного раствора хининсульфата (хининхлорида) в расчетную формулу вместо выражения (

) подставляют цифру 72.

      5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В

Сущность метода заключается в извлечении витамина В

(рибофлавина) из навески путем кислотного гидролиза и измерении интенсивности флуоресценции.

5.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Флуорометр Квант-7, ФАНК-1.

рН-метр по нормативному документу [8].

Баня водяная.

Центрифуга ОПН-8.

Фильтры обеззоленные (синяя лента) по нормативному документу [3].

Колбы мерные 2-50(100, 1000)-1(2) по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-1, 6(7)-1(2)-25 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-100 по ГОСТ 1770.

Кислота уксусная по ГОСТ 61.

Витамин В

по нормативному документу [11].

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор с массовой долей 5% и раствор молярной концентрации

(НСl)=0,1 моль/дм

.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 15%.

Натрий двууглекислый по ГОСТ 4201.

Натрия гидросульфит по ГОСТ 246.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

5.2 Подготовка к испытанию

5.2.1 Приготовление основного стандартного раствора витамина В

40 мг витамина В

растворяют в дистиллированной воде, подкисленной 10 см

ледяной уксусной кислоты, при нагревании до 50

°

С в мерной колбе вместимостью 1000 см

. Доводят объем до метки дистиллированной водой. В 1 см

раствора содержится 40 мкг рибофлавина.

Раствор хранят в прохладном, темном месте в склянке из темного стекла не более 2 мес.

5.2.2 Приготовление рабочего стандартного раствора рибофлавина

1 см

основного стандартного раствора рибофлавина переносят в мерную колбу вместимостью 100 см

и доводят до метки дистиллированной водой, подкисленной раствором соляной кислоты с массовой долей 5% до рН 5,5-6,0.

В 1 см

раствора содержится 0,4 мкг рибофлавина.

Раствор готовят перед употреблением.

5.2.3 Контроль за содержанием витамина В

в стандартном растворе проводят по 6.2.4.

5.3 Проведение испытания

Навеску премикса массой 2-5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см

, приливают 75 см

раствора соляной кислоты молярной концентрации

(НСl)=0,1 моль/дм

, смывая частицы премикса со стенок колбы. Колбу помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. Содержимое колбы периодически перемешивают.

После охлаждения колбы рН раствора доводят до значения 5,5-6,0 раствором гидроокиси натрия. Затем объем в колбе доводят дистиллированной водой до метки, хорошо перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин при 8000 об/мин.

Из полученного фильтрата готовят раствор с нужным разведением (например, 1 см

фильтрата разводят в мерной колбе вместимостью 50 см

) и определяют интенсивность флуоресценции, помещая в одну флуорометрическую пробирку 12-15 см

испытуемого раствора, в другую - такое же количество рабочего стандартного раствора. Затем в эти же пробирки добавляют 2-3 раза по 0,1 г двууглекислого натрия и по 0,1 г гидросульфита натрия или 4-6 капель раствора гидроокиси натрия. Содержимое пробирок осторожно перемешивают, фильтруют, если раствор мутный, и снова измеряют интенсивность флуоресценции на приборе

.

5.4 Обработка результатов испытания

Содержание витамина В

в премиксе, г/т, вычисляют по формуле

,

где

- показания флуорометра для испытуемого раствора до гашения флуоресценции;

- показания флуорометра для испытуемого раствора после гашения флуоресценции;

- содержание витамина В

в рабочем стандартном растворе, мкг/см

;

- первоначальный объем раствора, см

;

- окончательный объем разведения, см

;

- показания флуорометра для стандартного раствора до гашения флуоресценции;

- показания флуорометра для стандартного раствора после гашения флуоресценции;

- масса навески, г,

- объем раствора, взятый для разведения, см

.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности

=0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности

=0,95 расхождения не должны превышать 15%.

      6 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ В

И В

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

Сущность метода заключается в экстракции витаминов В

(тиамина) и В

(рибофлавина) из навески раствором соляной кислоты и определении их на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором с использованием обращенно-фазного режима элюирования.

Метод применим в диапазоне содержания витамина В

от 0,05 до 0,5 г/кг в премиксе, витамина В

- от 0,1 до 2 г/кг в премиксе.

6.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором и систематической погрешностью измерений не выше 10%. Допускается использовать хроматографы "Цвет-306", "Цвет-3006 со спектрофотометрическим детектором" и "Милихром".

Колонка хроматографическая стальная или стеклянная высотой 150 мм и диаметром 4 мм с числом теоретических тарелок не менее 2000, заполненная сорбентом "Силасорб С-18" или "Сепарон С-18".

Спектрофотометр СФ-26 или СФ-46 (спектральный диапазон 186-1100 нм).

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Линейка измерительная металлическая по ГОСТ 427.

Секундомер механический по нормативному документу [15].

Сорбент "Силасорб С-18" зернением 7 мкм.

рН-метр по нормативному документу [8].

Мешалка магнитная ММ-5.

Центрифуга лабораторная ЦЭ-2 с числом оборотов 6000 в мин.

Иономер ЭБ-74 со стеклянным электродом ЭСЛ-62-07.

Микрошприц МШ-10 или микропипетка МП-2.

Колбы конические со шлифом вместимостью 100 см

по ГОСТ 25336.

Колбы мерные 2-25(50, 100, 200)-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронка ВФ-1-56(75)ХС или ВФ-2-75(110)ХС со стеклянным фильтром ПОР 100 по ГОСТ 25336.

Пипетки градуированные 6(7)-1(2)-10 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Ацетонитрил по нормативному документу [7].

Натрия октилсульфонат, хроматографически чистый (изготовление Германия, фирма Pylver).

Триэтиламин, перегнанный по нормативному документу [4].

Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, концентрированная и раствор молярной концентрации

(НСl)=0,01 моль/дм

.

Витамин В

по нормативному документу [11].

Витамин В

по нормативным документам [16, 17].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

6.2 Подготовка к испытанию

6.2.1 Приготовление элюента

Для приготовления 1 дм

элюента смешивают 120 см

ацетонитрила с 880 см

дистиллированной воды, добавляют 2,5 см

триэтиламина, 0,5 г октилсульфоната натрия и приливают ортофосфорную кислоту до рН 7,6 по рН-метру. Полученную смесь фильтруют через стеклянный фильтр для удаления механических примесей.

Срок хранения элюента - не более 1 мес.

6.2.2 Приготовление раствора-экстрагента

К 1 дм

дистиллированной воды прибавляют 0,8 см

концентрированной (37%-ной) соляной кислоты, рН раствора 2

±0,2.

6.2.3 Приготовление основных стандартных растворов витаминов В

и В

Для приготовления основных стандартных растворов витаминов В

и В

берут навески 0,1 г тиаминхлорида и 0,01 г рибофлавина. Навеску тиаминхлорида растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см

, а рибофлавина - в мерной колбе вместимостью 200 см

, при нагревании до температуры 70-80

°

С и доводят дистиллированной водой до метки. Полученные растворы содержат в 1 см

1 мг витамина В

и 0,05 мг витамина В

соответственно.

Срок хранения основных стандартных растворов витаминов В

и В

- не более 2 недель в холодиль

нике.

6.2.4 Контроль за содержанием витаминов В

и В

в основных стандартных растворах

Контроль за содержанием витаминов в основных стандартных растворах осуществляют спектрофотометрически по значениям молярных коэффициентов светопоглощения.

Для этого основные стандартные растворы разбавляют дистиллированной водой в 50 раз и измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см.

Массовую концентрацию витаминов В

и В

рассчитывают по формуле

,

где

- оптическая плотность;

- молярный коэффициент;

- толщина слоя раствора, 1 см.

Массовую концентрацию витаминов В

и В

и В

, мг/см

, мг/см

, рассчитывают соответственно по формулам:

;

,

где 205 - молярный коэффициент светопоглощения тиаминхлорида при рабочей длине волны 268 нм;

324 - молярный коэффициент светопоглощения рибофлавина при рабочей длине волны 445 нм.

6.2.5 Приготовление рабочего стандартного раствора витаминов В

и В

Из основных стандартных растворов готовят рабочие стандартные растворы с содержанием витаминов В

- 0,02 мг и В

- 0,025 мг в 1 см

.