ГОСТ 31488-2012 Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности ксиланазы.
ГОСТ 31488-2012
Группа С09
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ
Методы определения ферментативной активности ксиланазы
Enzyme preparations. Methods of xylanase enzyme activity determination
МКС 07.100.30
65.120
Дата введения 2013-07-01
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") и Научно-техническим центром "Лекарства и биотехнология" (НТЦ "Лекбиотех")
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 41 от 23-24 мая 2012 г.)
За принятие проголосовали:
|
|
|
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Азербайджан | AZ | Азстандарт |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Кыргызстан | KG | Кыргызстандарт |
Российская Федерация | RU | Росстандарт |
Таджикистан | TJ | Таджикстандарт |
Молдова | MD | Молдова-Стандарт |
Узбекистан | UZ | Узстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 октября 2012 г. N 476-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31488-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.
5 Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53047-2008
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в указателе "Национальные стандарты".
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе "Национальные стандарты", а текст изменений - в информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе "Национальные стандарты"
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает методы определения ферментативной активности ксиланазы (экзо- и эндоксиланазной активностей) ферментных препаратов и ферментсодержащих смесей с использованием окрашенного субстрата и ксилана.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 199-78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 5845-79 Реактивы. Калий-натрий виннокислый 4-водный. Технические условия
ГОСТ 5962-67* Спирт этиловый ректификованный. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 13867-68 Продукты химические. Обозначения чистоты
ГОСТ 20264.0-74 Препараты ферментные. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 24104-2001* Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29227-91 (ИСО 8351-1:81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 гидролиз: Расщепление исходного соединения на два более простых в присутствии молекул воды.
3.2 ферментативный гидролиз: Гидролиз высокомолекулярных соединений под воздействием катализаторов белковой природы - гидролитических ферментов (гидролиз, класс 3 [1]).
3.3 субстрат: Соединение или вещество, на которое воздействует данный фермент.
3.5 азо-ксилан: Высокомолекулярное соединение ксилана, к которому привязан хромофор - азо-группа, имеющее желто-оранжевое окрашивание.
4 Метод определения ферментативной активности ксиланазы с субстратом ксиланом
4.1 Характеристика метода
Метод используется при возникновении разногласий в качестве арбитражного.
4.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование и реактивы
4.2.1 Для определения ферментативной активности ксиланазы используют следующие средства измерений и оборудование:
- фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектрофотометр (СФ) любого типа, которые обеспечивают измерения при длине волны 540 нм, с погрешностью измерения коэффициента пропускания не более 1% (не более 0,01 единицы оптической плотности);
- рН-метр любого типа для измерения в диапазоне от 0 до 14 рН, с пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ±0,1 единиц рН;
- ультратермостат или водяной термостат с точностью регулирования температуры ±1 °С;
- весы лабораторные по ГОСТ 24104, высокого класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г, ценой поверочного деления 0,1 мг и пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ±0,15 мг; а также с наибольшим пределом взвешивания 1 кг, ценой поверочного деления 20 мг и пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ±30 мг;
- водяную баню любого типа, которая обеспечивает поддержание температуры (100±1) °С;
- таймер любого типа с погрешностью ±30 с;
- секундомер с емкостью шкалы счетчика 1 мин, ценой деления 1 с и погрешностью ±1,5 с;
- механическую мельницу, обеспечивающую размалывание исследуемого образца ферментного препарата до полного прохода пробы через сито;
- сито с диаметром отверстий 1,0 мм, сделанное из металлического проволочного тканого материала.
4.2.2 Для определения ферментативной активности ксиланазы используют следующие лабораторную посуду и материалы:
- колбы мерные 1(2)-50, 100, 200, 500, 1000-2 по ГОСТ 1770;
- воронки ВФ - 1(2)-60-ПОР 500 ТХС по ГОСТ 25336;
- пробирки П1-14-120 ХС или П1-16-150 ХС по ГОСТ 25336;
- пипетки по ГОСТ 29227;
- колбы и стаканы (бюксы) СВ 19/9 и 24/10 по ГОСТ 25336;
- стаканы В-1-25, 50, 100, 150, 250, 600, 800, 1000 ТС по ГОСТ 25336;
- цилиндры 1(2,3,4)-50 (100) по ГОСТ 1770;
- эксикатор любого исполнения по ГОСТ 25336;
- ступку и пестик фарфоровые по ГОСТ 9147.
4.2.3 Для определения ферментативной активности ксиланазы используют следующие реактивы:
- кислоту уксусную ледяную по ГОСТ 61;
- натрий уксуснокислый трехводный по ГОСТ 199;
- калий-натрий виннокислый четырехводный по ГОСТ 5845;
- натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
- воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
- кислоту 3,5-динитросалициловую (ДНС) кристаллическую с содержанием основного вещества 98%;
- D-ксилозу с содержанием основного вещества от 98% до 99%;
- ксилан из овса или березовый с содержанием остатков ксилозы.
4.2.4 Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х.ч.) или 3 (ч.д.а.) по ГОСТ 13867.
4.2.5 Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования с метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов с показателями качества не ниже указанных.
4.3 Подготовка к анализу
Срок хранения раствора в стеклянной посуде при комнатной температуре - не более 1 мес.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 1 мес.
4.3.1.3 Для приготовления ацетатного буферного раствора смешивают равные объемы растворов уксусной кислоты и уксуснокислого натрия, полученных в соответствии с 4.3.1.1 и 4.3.1.2, измеряют рН и при необходимости доводят значение рН до 4,7 одним из исходных растворов.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 1 мес.
4.3.2 Приготовление раствора натрия гидроокиси массовой доли 10,7%
4.3.3 Приготовление реактива динитросалициловой кислоты (ДНС) массовой доли 1,0%
Стакан с полученным раствором помещают в водяную баню с температурой (47±1) °С и постепенно, небольшими порциями добавляют 300 г виннокислого калия-натрия. Перемешивание продолжают при той же температуре до полного растворения реактива.
При необходимости (в случае образования осадка) раствор фильтруют через воронку со стеклянным фильтром.
Срок хранения раствора в темной бутыли при комнатной температуре - не более 6 мес.
4.3.4 Приготовление раствора субстрата ксилана массовой доли 1%
Субстрат готовят в день проведения анализа.
4.3.5 Приготовление рабочих стандартных растворов ксилозы
4.3.5.2 Приготовление рабочих стандартных растворов ксилозы
Из основного стандартного раствора ксилозы по 4.3.5.1 готовят серию разведений в соответствии с таблицей 1.
Таблица 1
|
|
|
|
Объем стандартного раствора с молярной (массовой) концентрацией ксилозы 10 мкмоль/см (1500 мкг/см ), см | Объем буферного раствора, см | Концентрация ксилозы в разведении | |
|
| массовая, мкг/см | молярная, мкмоль/см |
0,5 | 9,5 | 75 | 0,5 |
1,0 | 9,0 | 150 | 1,0 |
1,5 | 8,5 | 225 | 1,5 |
2,0 | 8,0 | 300 | 2,0 |
2,5 | 7,5 | 375 | 2,5 |
3,0 | 7,0 | 450 | 3,0 |
3,5 | 7,5 | 525 | 3,5 |
4,0 | 6,0 | 600 | 4,0 |
5,0 | 5,0 | 750 | 5,0 |
6,0 | 4,0 | 900 | 6,0 |
Рабочие стандартные растворы ксилозы готовят в день построения градуировочного графика, при этом берут по три параллельных разведения для приготовления каждой концентрации раствора ксилозы.
4.3.6 Построение градуировочного графика
Все пробирки помещают в кипящую водяную баню и кипятят в течение 5 мин с точностью, измеряемой по секундомеру. Пробирки охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптические плотности растворов на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм, против контрольной пробы на реактивы.
Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднеарифметическое значение оптической плотности трех параллельных измерений.
Градуировочный график строят для каждой новой партии реактивов, а также при замене прибора.
4.4 Отбор и подготовка проб
4.4.1 Отбор проб проводят по ГОСТ 20264.0.
Анализируемые образцы в форме порошка или микрокапсулированные можно использовать без предварительной подготовки. Анализируемые образцы в форме гранул следует измельчать (например, в механической мельнице или фарфоровой ступке) и просеивать через сито с диаметром отверстий не более 1 мм.
________________
* В зависимости от предполагаемой активности.
4.4.3 Рабочий раствор анализируемого образца готовят из основного раствора по 4.4.2 путем разведения его в дистиллированной воде таким образом, чтобы при определении активности оптические плотности опытных и контрольного растворов находились в пределах рабочей зоны градуировочного графика.
Раствор готовят в день определения.
4.5 Проведение анализа
4.5.4 Все три пробирки помещают в кипящую водяную баню на 5 мин (с точностью, определяемой по секундомеру).
4.5.5 Пробирки (две опытные и одну контрольную) охлаждают до комнатной температуры и колориметрируют содержимое на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при длине волны 540 нм, в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм, против контрольной пробы на реактивы.
Если значения оптических плотностей опытных проб находятся за пределами рабочей зоны градуировочного графика, определение активности следует повторить с раствором, имеющим большее или меньшее содержание фермента.
4.6 Обработка результатов
4.7 Сходимость и воспроизводимость результатов
4.7.1 Результаты измерений, полученные в условиях повторяемости (сходимости), признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости:
4.7.2 Результаты измерений, полученные в условиях воспроизводимости, признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости:
5 Определение ферментативной активности ксиланазы с окрашенным субстратом
5.1 Характеристика метода
5.1.2 В качестве субстрата используют азоксилан.
5.1.3 Продукты реакции - олигомеры с "пришитым" красителем определяют по увеличению поглощения при длине волны 490 нм.
5.1.4 Для определения активности ферментного препарата измеряют интенсивность окраски, освобожденной им из окрашенного субстрата, в сравнении с образцом ксиланазы, имеющим известную ферментативную активность.
5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование и реактивы
5.2.1 Для определения ферментативной активности ксиланазы с окрашенным субстратом используют средства измерений и оборудование по 4.2.1, а также:
- фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектрофотометр (СФ) любого типа, которые обеспечивают измерения при длине волны 490 нм, с погрешностью измерения коэффициента пропускания не более 1% (не более 0,01 единицы оптической плотности).
5.2.2 Для определения ферментативной активности ксиланазы с окращенным субстратом используют лабораторную посуду и материалы по 4.2.2, реактивы по 4.2.3, а также:
- азоксилан;
- ксиланазу (внутренний стандарт) с известной ферментативной активностью, определенной в разделе 4;
- спирт этиловый 96% по ГОСТ 5962.
5.2.3. Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х.ч.) или 3 (ч.д.а.) по ГОСТ 13867.
5.2.4 Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования с метрологическими характеристиками, а также реактивов, по качеству не ниже указанных.
5.3 Подготовка к анализу
Срок хранения при температуре 5 °С - 2 нед.
5.3.4 Для приготовления рабочих стандартных растворов ксиланазы из основного стандартного раствора ксиланазы по 5.3.3 готовят серию разведений в соответствии с таблицей 2.
Таблица 2
|
|
|
Объем основного стандартного раствора ксиланазы, например с активностью 0,72 ед./см , см | Объем буферного раствора, см | Активность разведения стандартного раствора ксиланазы, ед./см |
1,0 | 9,0 | 0,072 |
2,5 | 7,5 | 0,180 |
4,0 | 6,0 | 0,285 |
5,0 | 5,0 | 0,360 |
6,5 | 3,5 | 0,468 |
8,0 | 2,0 | 0,576 |
10,0 | 0,0 | 0,720 |
Рабочие стандартные растворы ксиланазы готовят в день построения градуировочного графика, при этом берут по три параллельных разведения для приготовления каждой концентрации раствора ксиланазы.
Все пробирки (семь опытных и одну контрольную) помещают в термостат (ультратермостат) с температурой (40±1) °С на 20 мин (по секундомеру).
Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 490 нм по сравнению с контрольной пробой на реактивы.
Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднеарифметическое значение оптической плотности трех параллельных измерений для каждой активности стандартного раствора ксиланазы.
Градуировочный график строят для каждой новой партии азоксилана, а также при замене прибора.
5.4 Подготовка пробы
5.4.1 Отбор проб проводят по 4.4.1.
5.4.2 Приготовление основного раствора анализируемого образца проводят по 4.4.2.
5.4.3 Рабочий раствор анализируемого образца готовят из основного раствора по 5.4.2 путем разведения его дистиллированной водой таким образом, чтобы при определении активности оптические плотности опытного и контрольного растворов находились в пределах рабочей зоны градуировочного графика.
5.5 Проведение анализа
5.5.3 Все пробирки (три опытные и одну контрольную) закрывают пробками и помещают в ультратермостат с температурой (40±1) °С и выдерживают в течение 20 мин (при анализе кормов - 1 ч).
5.6 Обработка результатов
5.7 Сходимость и воспроизводимость результатов
5.7.1 Результаты измерений, полученные в условиях повторяемости (сходимости), признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости:
5.7.2 Результаты измерений, полученные в условиях воспроизводимости, признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости
Библиография
|
|
[1] | Enzyme Nomenclature, recommendations of the nomenclature Committee of the lUB, N.Y., Academic Press, 1984 |