ГОСТ 31746-2012 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus.
ГОСТ 31746-2012
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus
Food products. Methods for detection and quantity determination of coagulase-positive staphylococci and Staphylococcus aureus
___________________________________________________________
МКС 07.100.30
Дата введения 2013-07-01
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" (ГНУ "ВНИИКОП") на основе аутентичных переводов на русский язык международных стандартов, указанных в пункте 4
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 15 ноября 2012 г. N 42)
За принятие проголосовали:
|
|
|
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения
| AM
| Минэкономики Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Кыргызстан | KG | Кыргызстандарт |
Российская Федерация | RU | Росстандарт |
Украина | UA | Госпотребстандарт Украины |
Казахстан | KZ | Госстандарт Республики Казахстан |
Таджикистан | TJ | Таджикстандарт |
(Поправка. ИУС N 6-2019).
4 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международным стандартам*:
- ISO 6888-1:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета коагулазоположительных стафилококков (Staphylococcus aureus и другие виды). Часть 1. Метод с применением агаровой среды Байрд-Паркера);
- ISO 6888-2:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 2: Technique using rabbit plasma fibrinogen agar medium (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета коагулазоположительных стафилококков (Staphylococcus aureus и другие виды.). Часть 2. Метод с применением агаровой среды с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном);
- ISO 6888-3:2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 3: Detection and MPN technique for low numbers (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета коагулазоположительных стафилококков (Staphylococcus aureus и другие виды). Часть 3. Выявление и НВЧ метод для малых количеств) в части пищевых продуктов.
При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики указанных выше государств и особенностей межгосударственной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом*.
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанных международных стандартов для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).
Сравнение структуры настоящего стандарта со структурой указанных международных стандартов приведено в дополнительном приложении ДА.
Степень соответствия - модифицированная (MOD).
Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52815-2007
5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1773-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31746-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты".
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты"
ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 6, 2019 год с учетом уточнения, опубликованного в ИУС 11-2019
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus (S. aureus) посевом: в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на (в) агаризованные селективно-диагностические среды.
Допускается использование хромогенных сред предварительного выявления количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus в масложировой продукции.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 450-77 Кальций хлористый технический. Технические условия
ГОСТ 5962-67 Спирт этиловый ректификованный. Технические условия
ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе
ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов
ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 коагулазоположительные стафилококки: Грамположительные, каталазоположительные микроорганизмы, которые образуют типичные и/или атипичные колонии на (в) селективно-диагностической питательной среде, дающие положительную реакцию на коагулазу или специфичную для кроличьей плазмы реакцию на агаре с кроличьей плазмой и фибриногеном при определении по методам, приведенным в настоящем стандарте.
3.2 Staphylococcus aureus (S. aureus): Коагулазоположительные стафилококки, образующие ацетоин и ферментирующие мальтозу в аэробных условиях при определении этих биохимических тестов по методам, приведенным в настоящем стандарте.
3.3 выявление коагулазоположительных стафилококков и S. aureus: Определение присутствия или отсутствия коагулазоположительных стафилококков и S. aureus в определенной массе или объеме продукта по методам, приведенным в настоящем стандарте.
4 Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus*
4.1 Метод выявления и метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus* с предварительным обогащением
Сущность методов
Метод выявления и метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом с предварительным обогащением основаны на высеве навески продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.
При пересеве на агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном выросшие типичные колонии без подтверждения по биохимическим признакам относят к коагулазоположительным стафилококкам.
4.1.1 Метод выявления коагулазоположительных стафилококков и S. aureus
4.1.1.1 Определенное количество жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции вносят в жидкую селективную питательную среду.
Перед посевом анаэробные условия в среде создают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин, наслоением агара или парафина в каждую пробирку после посева, а также с помощью альтернативной процедуры - инкубирования пробирок в емкости или инкубаторе в анаэробных условиях.
4.1.1.2 Пробирки с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков на Жиолитти-Кантони бульоне определяется по редукции теллурита калия, а на глюкозном или солевом бульоне - по помутнению среды.
4.1.1.3 Поверхность одной из агаризованных селективно-диагностических сред (Байрд-Паркер агара, молочно-солевого агара, яично-желточно-азидного агара, яично-желточно-солевого агара, агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном), инокулируют из предположительно положительных пробирок (см. 4.1.1.4) после 24 ч и все оставшееся пробирки после 48 ч.
4.1.1.4 Чашки Петри с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.
Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по редукции теллурита калия и яично-желточной реакции (лецитиназной активности).
На агаре с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном после инкубирования присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по типичным колониям, показавшим специфичную реакцию (бычий фибриноген/кроличья плазма).
4.1.1.5 Подтверждение принадлежности типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам проводят по изучению отношения выявленных микроорганизмов к окраске по Граму, определению присутствия у них каталазы и коагулазы.
Подтверждение принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению образования ацетоина, определению ферментации в аэробных условиях мальтозы и, при необходимости, определению термостабильной нуклеазы и гемолитической активности.
4.1.2 Метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus
4.1.2.1 Навески продукта и (или) серию разведений навески продукта вносят в жидкую селективную питательную среду. Инкубирование посевов и подтверждение присутствия в них коагулазоположительных стафилококков и S. aureus проводят по 4.1.1.3-4.1.1.6.
4.2 Методы определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus* посевом на (в) агаризованные селективно-диагностические среды
Сущность методов
Методы определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на (в) агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве навески продукта и/или разведения навески продукта на (в) агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных и (или) атипичных колоний, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.
4.2.1 Проводят посев определенного количества жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции на (в) агаризованную селективно-диагностическую питательную среду на две параллельные чашки Петри.
Аналогично проводят посев десятикратных разведений испытуемого продукта.
4.2.2 Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.
При посеве в (на) агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном определяют только типичные колонии и без подтверждения по биохимическим признакам их относят к коагулазоположительным стафилококкам.
5 Питательные среды, растворы реактивов, эмульсии и дефибринированная кровь
Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред, растворов реактивов, эмульсий, должны быть аналитического качества.
5.1 Агаризованная среда Байрд-Паркера
5.1.1 Основа среды
5.1.1.1 Состав:
|
|
ферментативный гидролизат казеина | 10,0 г; |
дрожжевой экстракт | 1,0 г; |
мясной экстракт | 5,0 г; |
пируват натрия | 10,0 г; |
L-глицин | 12,0 г; |
хлорид лития | 5,0 г; |
агар | от 12 до 22 г*; |
вода | 1000 см . |
_______________
* В зависимости от желирующей способности агара.
5.1.1.2 Приготовление
При нагревании растворяют в воде все компоненты или дегидратированную основу. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (7,2±0,2) при температуре 25 °С.
Стерилизуют среду в автоклаве при температуре (121±1) °С в течение 15 мин.
5.1.2 Раствор теллурита калия
5.1.2.1 Состав:
|
|
теллурит калия  | 1,0 г; |
вода | 100 см . |
Примечание - Необходимо предварительно убедиться, что имеющийся в наличии теллурит калия пригоден для данного испытания.
5.1.2.2 Приготовление
Полностью растворяют теллурит калия в воде при минимальном нагревании.
Твердое вещество должно легко растворяться. Если в воде присутствует белый нерастворимый осадок, то такой порошок не используют.
Стерилизуют приготовленный раствор теллурита калия путем фильтрации через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
Раствор можно хранить не более 1 мес при температуре (3±2) °С.
Если при хранении раствора образуется белый осадок, то такой раствор не используют.
5.1.3 Эмульсия яичного желтка (приблизительно 20%-ной концентрации)
Свежие куриные яйца с неповрежденной скорлупой моют щеткой с применением жидких моющих средств, ополаскивают проточной водой, дезинфицируют погружением на 30 с в 70%-ный (объем/объем) этиловый спирт с последующим просушиванием на воздухе или, после того как раствор спирта стечет, яйца фламбируют в пламени горелки. С соблюдением правил асептики разбивают скорлупу яйца и отделяют желток от белка, поочередно перенося желток из одной половинки скорлупы в другую. Желтки помещают в стерильную колбу и добавляют 4-кратное количество (по объему) стерильной воды. Смесь тщательно перемешивают, выдерживают на водяной бане при температуре (47±1) °С в течение 2 ч, а затем оставляют на 18-24 ч при температуре (3±2) °С для образования осадка.
Для использования собирают в асептических условиях в стерильную колбу надосадочную жидкость. Приготовленную эмульсию можно хранить при температуре (3±2) °С не более 72 ч.
Допускается использование готовой эмульсии промышленного производства, в этом случае эмульсию применяют в соответствии с инструкцией изготовителя.
Допускается проводить приготовление желточной эмульсии по ГОСТ 10444.1.
5.1.4 Раствор сульфаметазина (сульфамезатина, сульфадимидина)
Раствор используют только в случае подозрения присутствия в испытуемом продукте бактерий рода Proteus или при испытании сильно обсемененных продуктов, например, из сырого мяса.
5.1.4.1 Состав:
|
|
сульфаметазин | 0,2 г; |
раствор гидроксида натрия,  (NaOH)=0,1 моль/л | 10 см ; |
вода | 90 см . |
5.1.4.2 Приготовление
Стерилизуют путем фильтрации через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
Приготовленный раствор допускается хранить не более 1 мес при температуре (3±2) °С.
5.1.5 Готовая питательная среда
5.1.5.1 Состав:
|
|
основа среды (см. 5.1.1) | 100 см ; |
раствор теллурита калия (см. 5.1.2) | 1,0 см ; |
эмульсия яичного желтка (см. 5.1.3) | 5,0 см ; |
раствор сульфаметазина (см. 5.1.4) (если необходимо) | 2,5 см . |
5.1.5.2 Приготовление
Расплавляют основу, затем охлаждают до температуры примерно 47 °С на водяной бане. В асептических условиях добавляют два других раствора и, если необходимо, раствор сульфаметазина (см. 5.1.4). Предварительно каждый раствор подогревают на водяной бане при 47 °С, тщательно перемешивая среду после каждого прибавления раствора.
5.1.6 Приготовление чашек Петри с агаризованной средой Байрд-Паркера
Разливают соответствующее количество готовой среды (см. 5.1.5) в стерильные чашки Петри, чтобы получить агаровый слой толщиной примерно 4 мм, и дают застыть. Приготовленные чашки можно хранить до использования 24 ч при температуре (3±2) °С.
Перед применением среду в чашках подсушивают в сушильном шкафу при температуре от 25 °С до 50 °С до тех пор, пока с поверхности среды не исчезнут капельки влаги. Предпочтительней подсушивать среду при снятых крышках и поверхностью среды вниз.
5.2 Бульон на основе вытяжки из сердца и мозга
5.2.1 Состав:
|
|
продукт ферментативного гидролиза животных тканей
| 10,0 г; |
дегидратированная вытяжка мозга теленка
| 12,5 г; |
дегидратированная вытяжка сердца теленка
| 5,0 г; |
глюкоза
| 2,0 г; |
хлорид натрия
| 5,0 г; |
двузамещенный фосфорнокислый натрий, безводный  | 2,5 г; |
вода | 1000 см . |
5.2.2 Приготовление
При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде.
Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °С (7,4±0,2).
5.3 Плазма крови кролика
Если в качестве антикоагулянта плазмы использовались цитраты калия или натрия, то к плазме добавляют раствор ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) до концентрации ЭДТА в плазме 0,1%. В плазму, содержащую оксалат или гепарин ЭДТА, не добавляется.
Если используется готовая обезвоженная плазма, то восстановление и использование такой плазмы проводят в соответствии с прилагаемой к ней инструкцией. Плазма готовится непосредственно перед применением.
Качество плазмы тестируется с помощью коагулазоположительных и коагулазоотрицательных штаммов стафилококков.
5.3.2 Раствор лимоннокислого натрия
5.3.2.1 Состав:
|
|
лимоннокислый натрий
| 5,0 г; |
вода | 100 см . |
5.3.2.2 Приготовление
Лимоннокислый натрий помещают в колбу, растворяют в воде. Раствор доводят до метки, разливают по колбам или пробиркам и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.
5.4 Агаризованная среда с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном
Следует учитывать опыт использования готовых партий добавок. Рекомендуется каждую партию раствора бычий фибриноген/кроличья плазма подвергать тестированию путем постановки положительного и отрицательного контроля.
5.4.1 Основа среды
5.4.2 Раствор бычьего фибриногена
5.4.2.1 Состав:
|
|
бычий фибриноген
| 5-7 г*; |
стерильная вода | 100 см . |
_______________
* Зависит от чистоты бычьего фибриногена.
5.4.2.2 Приготовление
С соблюдением правил асептики растворяют бычий фибриноген в воде непосредственно перед использованием.
5.4.3 Кроличья плазма и трипсин ингибирующий раствор
5.4.3.1 Состав:
|
|
кроличья плазма с ЭДТА для коагулазы (ЭДТА коагулазная плазма) | 30 см ; |
трипсин ингибитор | 30 мг. |
5.4.3.2 Приготовление
Раствор готовят с соблюдением правил асептики, растворяют компоненты в воде непосредственно перед использованием.
Если используют готовый раствор бычий фибриноген/кроличья плазма, то необходимо соблюдать инструкцию по приготовлению данного раствора и готовой среды. Особенно надо обращать внимание на температуру основы среды. При несоблюдении температуры среда может потерять свою активность.
5.4.4 Готовая среда
5.4.4.1 Состав:
|
|
основа среды (см. 5.4.1) | 90 см ; |
раствор теллурита калия (см. 5.1.2) | 0,25 см ; |
раствор фибриногена (см. 5.4.2) | 7,5 см ; |
кроличья плазма и трипсин ингибирующий раствор (см. 5.4.3) | 2,5 см . |
5.4.4.2 Приготовление
Расплавляют основу среды, охлаждают в водяной бане до температуры (47±1) °С. С соблюдением правил асептики прибавляют три раствора, предварительно подогретых до (47±1) °С в водяной бане. Тщательно перемешивают среду вращением после каждого прибавления, минимизируя вспенивание.
Используют готовую среду непосредственно после приготовления, тем самым избегая преципитации плазмы.
Для получения доступа к полной версии без ограничений вы можете выбрать подходящий тариф или активировать демо-доступ.