ГОСТ 26573.1-93 Премиксы. Методы определения витамина А.

ГОСТ 26573.1-93

Группа С19

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

 ПРЕМИКСЫ

 Методы определения витамина А

 Premixes. Methods for determination of vitamin A

МКС 65.120

ОКСТУ 9209

Дата введения 1995-01-01

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Госстандартом России

ВНЕСЕН Техническим секретариатом Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации

2 ПРИНЯТ Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации 21 октября 1993 года

За принятие проголосовали:

3 Постановлением Комитета Российской Федерации по стандартизации, метрологии и сертификации от 2 июня 1994 года N 160 межгосударственный стандарт ГОСТ 26573.1-93 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 января 1995 года

4 ВЗАМЕН ГОСТ 26573.1-85

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ

 ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Настоящий стандарт устанавливает методы определения витамина А в премиксах, предназначенных для обогащения комбикормов, белково-витаминных добавок и кормовых смесей.

      1 Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 13496.0.

      2 Определение витамина А методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии

Сущность метода заключается в экстракции витамина А (ретинола ацетат) из премикса экстрагентом и хроматографическом анализе содержания витамина в испытуемом растворе с использованием жидкостного хроматографа.

Метод применим в диапазоне концентраций витамина А 20-10000 международных единиц (ME) на 1 г премикса. Предельная погрешность метода - 10%.

2.1. Аппаратура и реактивы

Хроматограф жидкостный микроколоночный "Милихром" по ТУ 25-05.2830 или его последующие модификации со спектрофотометрическим детектором и спектральным диапазоном 190-360 нм.

Колонка хроматографическая одного из указанных размеров: 2х64, 2х80, 2х120 мм с числом теоретических тарелок не менее 4000 (по прилагаемому к колонке паспорту), заполненная одним из следующих сорбентов: Силасорб С

, Силасорб SPHС

, Сепарон С

.

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104*.

__________________

* С 1 июля 2002 года вводится в действие ГОСТ 24104-2001 (здесь и далее).

Баня водяная, обеспечивающая постоянство температуры (75±1) °С.

Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы 186-1100 нм.

Колбы конические со шлифом вместимостью 25 см

, КН-2-25-18 МХС по ГОСТ 25336.

Пипетка 4-1(2)-1 (исполнения 4, 1-го или 2-го класса, вместимостью 1 см

).

Пипетка 6-1(2)-10 или 7-1(2)-10.

Пипетка 2(3)-1(2)-50.

Колбы мерные 2-25-1(2) (исполнения 2, вместимостью 25 см

, 1-го или 2-го класса точности) по ГОСТ 1770.

Колбы мерные 2-50-1(2) по ГОСТ 1770.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-100, 1(2, 3, 4)-500 по ГОСТ 1770.

Воронка ВФО-40-ПОР 16 ХС по ГОСТ 25336.

Холодильник ХПТ-1-100-18 ХС по ГОСТ 25336.

Насос водоструйный по ГОСТ 25336.

Бюретка 6-2-2 (исполнения 6, 2-го класса точности, вместимостью 2 см

).

Склянки с притертой пробкой.

Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300.

Спирт этиловый абсолютированный по ТУ 84-11-99.

Спирт изопропиловый (пропанол-2), х. ч., по ТУ 6-09-402.

Спирт пропиловый (пропанол-1), х. ч., по МРТУ 6-09-6628.

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, х. ч., по ТУ 6-09-06-1092.

Ретинола ацетат в масле, 3,44%-ный раствор с активностью 90000-110000 МЕ/см

по фармакопее.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечание. При проведении испытаний допускается использовать импортные аппаратуру, материалы и реактивы с характеристиками не ниже отечественных аналогов.

2.2 Подготовка к испытанию

2.2.1 Приготовление элюента для хроматографии

Трехкомпонентный элюент готовят смешиванием пропилового спирта, дистиллированной воды и ацетонитрила в соотношении 50:8:42 (% об.). Для этого в склянку вместимостью 1000 см

вносят цилиндром 500 см

пропилового спирта, 420 см

ацетонитрила и 80 см

дистиллированной воды.

Приготовленную смесь растворителей фильтруют через стеклянный фильтр для удаления возможных механических примесей и пузырьков воздуха и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой. Полученный раствор можно хранить в течение 1 мес.

2.2.2 Подготовка хроматографической колонки

При работе на не использованной ранее колонке или колонке, которая не была подключена к прибору "Милихром", из нее следует удалить воздух и тщательно промыть элюентом до получения стабильной нулевой линии. Для этого через колонку пропускают элюент в количестве 20-30 свободных объемов колонки, т.е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 50 мкдм

/мин, а затем 100 мкдм

/мин. Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.

После промывки колонки проводят ее насыщение витамином А. Для этого выполняют 7-10 анализов наиболее концентрированного градуировочного раствора витамина А. Насыщение колонки прекращают, когда отношение разности между двумя последовательными определениями концентрации витамина А к среднему арифметическому значению этих операций не превышает 3% отн.

При правильной эксплуатации колонка выдерживает до 500-600 анализов.

2.2.3 Приготовление растворителя для экстракции витамина А из премикса

Для экстракции, витамина А из премиксов используют двухкомпонентный экстрагент состава изопропиловый спирт и дистиллированная вода в соотношении 97:3 (% об.). Для этого в мерную колбу вместимостью 1000 см

вносят пипеткой 30 см

дистиллированной воды и доводят до метки изопропиловым спиртом. Хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой.

2.2.4 Приготовление абсолютного этилового спирта

К этиловому ректификованному спирту прибавляют в соотношении 4:1 свежепрокаленную при температуре 800-1000 °С в течение 2 ч окись кальция. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2-3 ч. Затем смесь перегоняют, отбрасывая начальную и конечную порции отгона (по 20-30 см

). Перегнанный абсолютный спирт при измерении на спектрофотометре относительно дистиллированной воды в кювете с толщиной слоя 1 см должен иметь значение оптической плотности, не превышающее 0,01 единиц в области 320-350 нм и 0,05 при 280-300 нм.

Если спирт не отвечает вышеуказанным требованиям, процесс обезвоживания повторяют.

Этиловый абсолютный спирт промышленного изготовления перегоняют над твердой гидроокисью натрия или калия (10 г щелочи на 1 дм

спирта) и проверяют, как указано выше.

2.2.5 Определение активности витамина А в масляном препарате

0,1 г масляного препарата витамина А растворяют в абсолютном этиловом спирте в мерной колбе вместимостью 50 см

, перемешивают. Отбирают 1 см

раствора в колбу вместимостью 50 см

, заполняют ее до метки абсолютным спиртом и измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм при длине волны 326 нм. В качестве контрольного раствора используется абсолютный спирт.

Активность витамина А (

) в международных единицах (ME) в 1 г препарата вычисляют по формуле

,

где

- оптическая плотность раствора при длине волны 326 нм;

,

- первое и второе разведения, см

;

1880 - коэффициент перевода в ME;

- масса навески масляного препарата, г;

- объем раствора, используемый для второго разведения, см

;

100 - коэффициент

.

2.2.6 Построение градуировочного графика

Для приготовления стандартного раствора взвешивают навеску масляного препарата витамина А (3,44%-ный раствор), необходимую для получения раствора с активностью 30000 ME в 50 см

или 600 МЕ/см

. Навеску помещают в мерную колбу вместимостью 50 см

, растворяют в изопропиловом спирте, перемешивают и доводят этим спиртом до метки.

Раствор хранят в холодильнике и используют в течение одной недели.

Из этого раствора готовят градуировочные (рабочие) растворы. Для премиксов, содержащих витамин А в количестве от 100 МЕ/г и выше, готовят рабочие растворы с содержанием 120, 300, 600, 1200, 3000, 6000, 12000 ME витамина в 25 см

. Для этого берут соответственно, 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0 см

исходного раствора, помещают в мерные колбы вместимостью 25 см

и доводят до метки изопропиловым спиртом.

Для премиксов, содержащих витамин А в количестве 20-100 МЕ/г, готовят рабочие растворы с содержанием 20, 40, 60, 90, 120 ME в 25 см

. Для этого берут соответственно 0,033; 0,066; 0,1; 0,15; 0,2 см

исходного раствора, помещают в мерные колбы вместимостью 25 см

при помощи микробюретки и доводят до метки изопропиловым спиртом.

Срок годности растворов - не более 1 мес при хранении в холодильнике при температуре 4-10 °С.

Полученные рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе "Милихром" при следующих условиях:

хроматографическая колонка 2х64 мм (2х80 мм), (2х120 мм);

сорбент - Силасорб С

; Силасорб SPHC

; Сепарон С

;

трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;

объем пробы - 6 мкдм

;

длина волны - 328 нм;

постоянная времени - 0,2 с;

скорость подачи элюента - 150 мкдм

/мин.

Удерживаемый объем пика витамина А составляет 300-360 мкдм

(может меняться в зависимости от длины колонки).

Каждый раствор хроматографируют три раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 100-200 мкдм

элюента до выхода на нулевую линию.

Значение средних высот хроматографических пиков, выраженное в единицах оптической плотности (е.о.п.), откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс - значение активности витамина А в 25 см

раствора. Для концентраций витамина А 120-10000 и 20-120 МЕ/г градуировочные графики строят отдельно.

Градуировочный график строят также, откладывая по оси ординат средние высоты хроматографических пиков (

), выраженные в единицах длины (мм) с учетом чувствительности прибора. В этом случае содержание витамина в пробе определяют, измеряя высоту соответствующего хроматографического пика линейкой.

Пример хроматограммы представлен на рисунке 1.

Хроматограмма раствора витамина А

(ретинола ацетат) в изопропиловом спирте

Черт.1

Построение градуировочных графиков можно заменить расчетом коэффициентов наклона

по формуле

,

где  

- коэффициент наклона градуировочного графика для градуировочного раствора, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм;

- количество точек, по которым строится градуировочная кривая.

Значение коэффициента наклона

вычисляют по формуле

,

где

- содержание витамина А в соответствующем

-м градуировочном растворе, ME;

- высота

-го хроматографического пика, е.о.п. или мм.

2.2.7 Проверка градуировочного графика

Градуировочный график контролируют не реже одного раза в неделю. Для этого один-два рабочих раствора хроматографируют, как указано в 2.2.6.